朱伟峰1,2,3陈露1,2,3谭凯1,2,3王高杰1,2,3蔡承志4
1.江苏省农业科学院兽医研究所，南京210014； 2.农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京210014；
3.国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京210014；
4.华中农业大学动物医学院，武汉430070
摘要首先通过多序列比对分析不同血清型菌株GAPDH的一级结构保守性，然后使用在线软件Bepipred-2.0预测巴氏杆菌GAPDH线性B细胞表位，并通过人工化学合方式合成GAPDH表位对应的多肽。最后使用间
接ELISA法检测这些多肽与巴氏杆菌GAPDH高免血清之间的反应，确认预测结果。研究发现，不同血清型菌株的GAPDH一级结构高度保守，只有D型菌株HN06发生A288T突变。本次试验预测到巴氏杆菌GA
PDH的3个表位，ELISA检测结果表明177HATTATQKTVDGPSAKDWRGGRGAAQNIIPSSTGA211与GAPDH高免血清反应明显，是巴氏杆菌GAPDH的表位。本研究鉴定到了巴氏杆菌GAPDH的1个线性B细胞表位，这些表位将为以后基于巴氏杆菌GAPDH表位的诊断、疫苗设计及感染与免疫机制研究提供技术基础。
关键词巴氏杆菌；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；保护性抗原；表位预测；表位鉴定 巴氏杆菌病（pasteurellosis）主要由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）引起，是多种畜禽、野生动物和人类的一种传染病的总称。巴氏杆菌病呈地方流行性，会造成动物死亡或影响其生长、降低饲料报酬，给畜禽养殖业带来较大经济损失[1-2]。巴氏杆菌病因发病程度和感染动物不同而有不同的病名，如猪肺疫、猪进行性萎缩性鼻炎、禽、牛出血性败血症、兔巴氏杆菌病（兔出血性败血症）等，其中多数疫病被中国政府列为二类动物疫病[3]。近年来，巴氏杆菌在多种动物中的临床分离或检出率都位居前列[4-7]。多杀性巴氏杆菌同样可以造成人类感染发病，是一种人兽共患病病原体[1-2]。
根据荚膜多糖抗原性的差异可以将巴氏杆菌分为A、B、D、E、F等5个血清型，除E型外其他4个血清型均为临床常见血清型[8]。目前对巴氏杆菌的免疫保护机制和致病机制依然不完全清楚[2-9]，我们前期主要针对巴氏杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP⁃
DH）致病作用和免疫保护作用开展了研究，研究结果
显示巴氏杆菌的GAPDH分子具有黏附宿主细胞和分子的作用[10]，同时作为抗原巴氏杆菌GAPDH还具有免疫保护效应[11]。抗原表位是抗原引发免疫保护的物质基础[12-13]，部分抗原表位既是抗体发挥作用的位点，也是病原菌对宿主发挥作用的关键位点（即致病性表位）[14]。因而通过鉴定巴氏杆菌GAP⁃
DH的B细胞表位有助于进一步理解GAPDH免疫保护效应的本质，并为进一步研究GAPDH的致病作用提供条件。伴随生物信息学的发展，不断有学者试图开发能够预测抗原表位的软件，近年来在线软件Bepipred-2.0对于线性B细胞表位已经有了比较好的预测效果[15]。本研究的目的是预测巴氏杆菌GAPDH分子的线性B细胞表位并进一步鉴定预测结果。
1材料与方法
1.1基因序列来源
本研究用于序列分析巴氏杆菌GAPDH氨基酸
收稿日期：2021-07-05
基金项目：江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20190270）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（19）3016）朱伟峰，男，1984年生，博士，助理研究员。
序列均来自已经完成基因组测序的巴氏杆菌的基因组数据：C51-17（A型，NZ_MAPQ01000003.1）、
PMTB2.1（B型，NZ_CP007205）、HN06（D型，NC_ 017027）、Pm70（F型，NC_002663）。所有序列从自美国国立生物技术信息中心数据库NCBI-GenBank 公共数据库中获得。
1.2生物材料及主要试剂
鼠源巴氏杆菌GAPDH高免血清在以前的试验[10]中已经制备并保存。ELISA板购自美国Costar 公司，HRP鼠二抗购自Biosharp公司，TMB单组分显液购自湖州英创生物科技有限公司。
1.3不同菌株GAPDH一级结构的比较
使用在线软件Clustal Omega（www.clustal. org/omega/）完成氨基酸序列多序列比对，比较1.1中不同巴氏杆菌GAPDH氨基酸序之间的相似性。1.4巴氏杆菌GAPDH表位预测
使用在线软件Bepipred-2.0（www.de⁃taibio/tools/epitope-prediction-vr.html）分析巴氏杆菌
GAPDH分子上各个氨基酸残基构成表位的能力。以软件默认的0.5为阈值，高于此阈值且有较长连续序列的一段多肽被预测为GAPDH分子的线性B细胞表位。
1.5表位多肽的化学合成
针对Bepipred-2.0所预测到的线性B细胞表位，通过南京金斯瑞生物科技股份有限公司化学合成对应序列的线性多肽。合成过程简述如下，使用固相肽合成法（SPPS）合成多肽，即依次向树脂中添加氨基酸以构建肽链。当合成完成后，首先去保护N-端的Fmoc基团，然后去保护侧链保护基团，最后将多肽从树脂上切割下来。粗肽液样品溶解后，注入高效液相谱（HPLC）仪，对谱中出现的每个部分进行分子量和纯度测试，以确认目标多肽含量。如果预测到的抗原表位长度均超过25个氨基酸残基，常规合成难度较大，则合成能够覆盖对应表位的重叠多肽以完成后续试验。
1.6表位与GAPDH高免血清的反应
使用间接ELISA法[16]鉴定多肽与血清的反应性，简要叙述如下。以多肽包被ELISA板（10μg/孔，对照组不包被任何抗原），37℃孵育2h。以PBST洗涤5次后，使用5%脱脂乳于37℃下封闭1h。接下来孵育1/200稀释的巴氏杆菌C51-17株GAPDH高免血清，37℃下1h。以PBST洗涤5遍后，孵育偶联HRP的羊抗鼠二抗，37℃下孵育30min。经过5遍洗涤后加入100μL的TMB单组分显液，反应10min 后加入50μL终止液（2mol/L硫酸）。最后在酶标仪上读取450nm的吸光度。
1.7数据处理与统计学检验
试验数据均使用平均值（means）±标准差（SD）来表示，用t检验检测试验组和对照组的统计学差异，差异显著判定标准为P<0.05。
2结果与分析
2.1不同菌株GAPDH氨基酸序列的相似性
通过多序列比较发现巴氏杆菌不同血清型菌株C51-17、PMTB2.1、HN06、Pm70的GAPDH氨基酸序列高度保守，仅HN06发生了A288T一处点突变（未展示多序列比对结果）。
2.2GAPDH线性B细胞表位预测结果
选择巴氏杆菌C51-17株的GAPDH序列进行预测分析，所预测的巴氏杆菌GAPDH线性B细胞表位的分布状况如图1所示。有多段连续序列高于软件默认的阈值0.5，本研究选择了最长的3个片段（分别记为PMepitope1、PMepitope2、PMepitope3，表1、图2）作为预测到的线性B细胞表位进行后续研究。
2.3表位对应多肽与GAPDH高免血清的反应
以人工化学合成方式制备所预测表位PMepit⁃ope1、PMepitope2、PMepitope3对应的多肽（分别标记为PMG-1、PMG-2（A-D）、PMG-3）（表1）。由于PMG-2C结构特殊，经过反复和尝试都没有成功合成，所以本次试验没有使用该条多肽。
巴氏杆菌GAPDH的抗原表位PMepitope2对应的合成多肽PMG-2（A、B、D）均能够与巴氏杆菌GAPDH高免血清发生明显的反应（P<0.05），但是PMepitope1和PMepitope3对应的合成多肽（PMG-1、PMG-3）则不能与巴氏杆菌GAPDH高免血清发生反应（P>0.05）。该结果证实所预测到的PMepitope2是巴氏杆菌GAPDH的抗原表位，但PMepitope1和PMepitope3则不是巴氏杆菌GAPDH的抗原表位。3讨论
BepiPred-2.0是通过随机森林算法学习来自于抗体-抗原复合物结构的表位数据进而建立起的一种表位预测工具，它对于线性B细胞表位的预测能
力尤为突出[15]。所以本研究选择了该软件预测巴氏杆菌GAPDH 的表位。依照软件使用方法，预测分值高于0.5且长度较长的多肽构成表位的可能性较大，所以本研究选择了长度最长的3段片段来作为预测到的表位进行研究。通过合成多肽与GAPDH 高免血清的反应进一步确认了其中1个是表位。研究结果证实BepiPred-2.0具有较好的表位预测能力，特别是当所预测表位较长时效果良好。
通过ELISA 验证，本研究最终确认PMepitope2分别是巴氏杆菌GAPDH 和巴氏杆菌GAPDH 的线性B
细胞表位。该表位的序列及其在GAPDH 分子上的位置与之前研究所鉴定到的GAPDH 表位[17-18]都不同，是新的表位。之前的文献报道显示GAPDH 表位在抗原提呈、调理吞噬等方面发挥作用，本研究所鉴定到的表位可能也具有类似的免疫学效应，以后
应进一步研究，并在疫苗设计中加以利用。
我们的研究结果显示GAPDH 具有高度保守的特点。巴氏杆菌不同血清型菌株的GAPDH 一级结构高度相似，仅有1个点突变，本研究所鉴定到的表位所在
位点序列完全相同。最近已经有研究显示细菌保守
图3
间接ELISA
法检测多肽与高免血清之间反应的结果
注：使用在线软件Bepipred-2.0（http ：//www.detaibio/tools/epitope-prediction-vr.html ），所分析的序列为C51-17株的GAPDH 序列。
图1
巴氏杆菌GAPDH 各氨基酸残基构成表位能力及线性B 细胞表位预测结果
表1
巴氏杆菌和GAPDH 线性B 细胞表位预测结果及对应多肽合成情况
片段名称
PMepitope1
PMepitope2
PMepitope3
74
VTAERDPANLKWNEIGV 90177
HATTATQKTVDGPSAKD-
WRGGRGAAQNIIPSSTGA 211
278
AVVSTDFNGCAL 289
tm2005序列
PMG-1（VTAERDPANLKWNEIGV ）
PMG-2A （HATTATQKTVDGPSAKDWRGGRGA ）PMG-2B （TQKTVDGPSAKDWRGGRGAAQNI⁃
IP ）PMG-2C
（DGPSAKDWRGGRGAAQNIIPSSTG ）PMG-2C
（KDWRGGRGAAQNIIPSSTGA ）PMG-3（AVVSTDFNGCAL ）
对应的合成多肽（序列
）
注：氨基酸序列为巴氏杆菌C51-17株GAPDH 的一级结构，本研究所预测到的抗原表位已经用下划线标出。
图2
所预测到的表位在巴氏杆菌GAPDH 分子上的位置
隐蔽式水箱蛋白的表位可以用于建立特异性的诊断方法[16]，因而将来还可以以本研究所鉴定到的表位（PMepitope2）为基础建立巴氏杆菌感染的特异性诊断方法。我们的前期工作表明，GAPDH是巴氏杆菌的黏附因子，某些氨基酸位点可能发挥关键作用[19]。其他学者的研究则表明有的抗原表位同时也是病原和宿主相互作用的关键位点[20-22]，因而本研究所鉴定到的表位可为研究巴氏杆菌与宿主相互作用提供新的线索。
本研究成功预测并鉴定到1个巴氏杆菌的抗原表位，该表位将为以后的巴氏杆菌GAPDH免疫保护机制、致病机制研究提供新的线索，并为基于GAPDH抗原表位的疫苗设计和诊断试剂开发提供技术基础。
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