Pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用的制作方法

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pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。

背景技术：

2.肠道病毒71型(ev71)是小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus) 成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。自1974 年首次报道以来，ev71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。鉴于手足口病的传播流行给我国人民生命和健康带来的极大危害，我国，严控手足口病的流行传播。目前对于由ev71感染的疾病没有特效药物，相关的疫苗预防效果还有待进一步观察。
3.因此，开发特异有效的抗ev71药物势在必行。

技术实现要素：

4.本发明目的是提供pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，本技术首次发现 pilaralisib对肠道病毒有较强抑制作用，为肠道病毒感染性疾病的和预防提供了方向。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供了pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
7.进一步地，所述抗肠道病毒71型药物还包括药学上可接受的辅料和载体。
8.进一步地，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着剂中的至少一种。
9.进一步地，所述抗肠道病毒71型药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。
10.进一步地，所述抗肠道病毒71型药物的抗病毒的方式包括：抑制肠道病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。
11.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
12.本发明提供的pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，本技术人通过大量的生物学实验，发现pilaralisib具有较好抑制ev71病毒的活性。具体表现为可以抑制ev71 病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，抑制ev71病毒在细胞内的复制增殖。由此表明化合物pilaralisib有潜力制备抗ev71感染的特异药物，具有较好的临床应用前景。
13.同时，本发明所述的pilaralisib小分子化合物合成工艺简单，易于大规模生产推广； pilaralisib的抗病毒活性未见报道，对其抗ev71病毒活性的开发具有一定的导向作用。从结构相似的化合物中寻抗ev71药物，易于通过构效关系研究寻到其作用靶点，为
进一步药物开发提供一定的借鉴意义。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
15.图1是pilaralisib作用的rd细胞存活率的影响，及药物对ev71感染rd细胞后病毒核酸复制的抑制效果；其中图1a为细胞存活率结果；图1b为药物对ev71感染rd细胞后病毒核酸复制的抑制效果；
16.图2是pilaralisib对于ev71引起的rd细胞cpe的抑制效应。
17.图3是pilaralisib对于ev71子代病毒产量的抑制作用，通过空斑试验验证；其中图3a 为抑制作用结果；图3b为空斑试验验证结果。
18.图4是pilaralisib对于ev71病毒在细胞内复制的抑制效果，通过免疫荧光验证，并由高内涵仪器(molecular devices)拍摄图片。
19.图5是pilaralisib对于ev71病毒致死性感染在三日龄乳鼠中的存活率的保护效果。
具体实施方式
20.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
21.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
22.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
23.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
24.pilaralisib是一种选择性的可逆i型pi3k抑制剂，作用于pi3kα/δ/γ。pilaralisib的化学结构式如下：
[0025][0026]
本发明pilaralisib作为抗ev71病毒的应用，化合物pilaralisib抑制ev71在宿主
细胞 rd产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率。抑制ev71病毒在细胞内的复制增殖，对子代病毒的释放具有抑制效果，并且在至死性ev71感染的三日龄icr乳鼠的死亡率中具有保护效果，有潜力发展成为有效ev71感染的药物。
[0027]
综上可知，本发明结果表明化合物pilaralisib有潜力制备抗ev71感染的特异药物，具有较好的临床应用前景。
[0028]
因此，本发明提供pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，所述应用是指 pilaralisib添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗ev71病毒的制剂，辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着剂中的至少一种，根据药物剂型的需要选择不同的辅料。所述制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。
[0029]
可以理解的是，以pilaralisib为先导化合物进行进一步结构优化，用于制备肠道病毒感染性疾病药物也属于本发明想要保护的范围。
[0030]
下面将结合实施例及实验数据对本技术的pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用进行详细说明。
[0031]
实施例1、pilaralisib对于宿主rd细胞的毒性
[0032]
1、pilaralisib作用的rd细胞存活率的影响
[0033]
将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，mtt法测定细胞存活率。spss 11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(mediancyctoxic concentration，cc
50
)。细胞存活率＝(药物组平均od
490
值/细胞对照组平均od
490
值)
×
100％。
[0034]
检测结果如图1a所示，可知cc50＝11113nm。
[0035]
2、药物对ev71感染rd细胞后病毒核酸复制的抑制效果
[0036]
将rd细胞均匀接种至12孔板细胞后，待细胞90-100％覆盖后，覆盖含有病毒的普通细胞培养基敷育2h，后弃覆盖层，更改为含有不同药物浓度的普通细胞培养基1ml继续培养，为组细胞空更换为不含药物的细胞培养基1ml，培养20小时后，提取细胞内病毒核酸，通过rt-pcr检测不同试验试验组中病毒核酸载量，以此验证药物对病毒复制的抑制效果，并计算出不同浓度下的抑制率。si＝cc
50
/ic
50
。指数越高，说明抗病毒潜力越大。
[0037]
结果如图1b所示，并计算该药物指数为si＝cc
50
/ic
50
＝2.28。说明该药物可以明显抑制病毒的复制。
[0038]
实施例2、pilaralisib对于ev71引起的rd细胞cpe的抑制效应
[0039]
将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100 tcid50的ev71病毒液感染细胞1h，后更换为含有不同浓度药物的培养基孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的cpe病变时，显微镜下观察细胞病变效应(cpe)。 cpe的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做 ++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++，将细胞病变情况采用相机拍摄，并将图片排列标注。
[0040]
结果如图2所示，表明pilaralisib抑制ev71引起的rd细胞cpe效应，ev71感染的 rd细胞变圆，从细胞板壁脱离。
[0041]
实施例3、pilaralisib对于ev71病毒在细胞内复制的抑制效果
[0042]
待cpe观察完毕后，将细胞冻融后，采用空斑试验滴定冻融液中病毒滴度，以此观察到药物对子代病毒的产生所具有的影响。具体步骤为：6孔板接种vero细胞，100％覆盖后，将收集的冻融液用普通细胞培养基稀释至105，每孔1ml，孵育2-3h后去掉上清液，加入1.87％琼脂糖固体细胞培养基覆盖，培养72小时后，4％甲醛固定，后5％结晶紫染半小时，轻柔去掉覆盖层后读取空斑个数，及摄取空斑照片，绘制成图形。
[0043]
结果如图3所示，观察到随着药物作用浓度降低，细胞因感染所产生cpe情况越明显，具有明显剂量依赖关系。药物可以强烈抑制ev71病毒引起的rd细胞病变效应，增强细胞存活率，显著降低子代病毒产量。
[0044]
实施例4、ev71病毒在细胞内复制的抑制效果
[0045]
将细胞接种于24孔板中，待细胞在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100tcid50的ev71病毒液感染细胞2h,后更换为含有不同浓度药物的培养基孵育细胞，24小时后，弃上清，多聚甲醛固定30min,通透封闭后，抗ds-rna抗体(标记病毒双链rna)孵育过夜，cy3荧光二抗孵育1h，dapi染核5min，pbs液封。采用高内涵细胞成像技术拍摄图片。
[0046]
检测结果如图4所示，由图4可知药物可以强烈抑制ev71病毒在细胞内的复制。
[0047]
实施例5、药物在至死性ev71感染三日龄icr乳鼠中，对乳鼠的死亡具有保护效果
[0048]
将三组3日龄icr乳鼠(平均体重为2.5-2.8mg)接种ebv71病毒20μl病毒液，试验组将采取2.5mg/kg及1mg/kg两种浓度7天，对照组采用药物组相同溶剂(不含药物) 行安慰处理7天，将一组空白组设计为非感染组，且每日安慰剂处理，期间每日观察乳鼠是否死亡，统计最终结果绘制图形。
[0049]
本次试验中，将病毒腹腔注射接种于三组3日龄icr乳鼠体内，其中两组分别采取 2.5mg/kg及1mg/kg两种浓度7天，对照组采用药物组相同溶剂(不含药物)行安慰处理7天，空白组为非感染组，且每日安慰剂处理，期间每日观察乳鼠是否死亡，统计最终结果绘制图形，如下图5所示：
[0050]
由图5可知，药物在至死性ev71感染三日龄icr乳鼠中，对乳鼠的死亡具有保护效果。
[0051]
综上所述，化合物pilaralisib具有一定的抑制ev71活性，可以强烈抑制ev71病毒引起的rd细胞病变效应，增强细胞存活率，显著降低子代病毒产量，有潜力进一步开发制备一种临床上有效对抗ev71病毒感染的药物。
[0052]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0053]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肠道病毒71型药物还包括药学上可接受的辅料和载体。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着剂中的至少一种。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肠道病毒71型药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肠道病毒71型药物的抗病毒的方式包括：抑制肠道病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。

技术总结

本发明提供了Pilaralisib在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，Pilaralisib对EV71病毒抑制活性研究实验表明化合物Pilaralisib抑制EV71病毒在宿主细胞RD上产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率，对致死性EV71感染乳鼠死亡率具有一定的保护效果，可在制备抗EV71病毒药物中应用。毒药物中应用。毒药物中应用。