VER50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用的制作方法

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ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。

背景技术：

2.肠道病毒71型(ev71)属于小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus) 成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、自主性神经紊乱、肺水肿等，甚至导致死亡。自1969年首次报道以来，ev71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。在最近十年中，与ev71相关的hfmd爆发激增。鉴于手足口病的传播流行给我国人民生命和健康带来的极大危害，我国严控手足口病的流行传播。目前，对于病毒性疾病的预防和主要依靠疫苗和药物，目前还没有具体数据能够支持上市疫苗可以保护其他血清型的肠道病毒。针对ev71病毒感染的方法也相当有限，主要手段为对症支持和广谱抗病毒疗法，其疗效有限，个体差异较大，且难以推广。
3.因此，相关抗病毒药物的研发将是攻克该病毒的关键着力方向，开发特异有效的抗 ev71药物势在必行。

技术实现要素：

4.本发明目的是提供ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，本技术首次发现 ver50589对肠道病毒有较强抑制作用，为肠道病毒感染性疾病的和预防提供了方向。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供了ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
7.进一步地，所述抗肠道病毒71型药物还包括药学上可接受的辅料和载体。
8.进一步地，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着剂中的至少一种。
9.进一步地，所述抗肠道病毒71型药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。
10.进一步地，所述抗肠道病毒71型药物的抗病毒的方式包括：抑制肠道病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。
11.进一步地，所述ver-50589浓度为20μmol/ml时，对于ev71病毒的抑制率为96.3％， ver-50589浓度为0.16μmol/ml时，对于ev71病毒的抑制率为89％。
12.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
13.本发明提供的ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，本技术人通过大量的生物学实验，hsp90β抑制剂(ver-50589)具有较好抑制ev71病毒的活性。具体表现为可以抑制ev71病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，抑制ev71病毒在细胞内的复
制增殖。由此表明化合物hsp90β抑制剂有潜力制备抗ev71感染的特异药物，具有较好的临床应用前景。
14.同时，本发明所述的ver50589小分子化合物合成工艺简单，易于大规模生产推广。 hsp90β抑制剂的抗ev71病毒活性未见报道，对其抗ev71病毒活性的开发具有一定的导向作用。从结构相似的化合物中寻抗ev71药物，易于通过构效关系研究寻到其作用靶点，为进一步药物开发提供一定的借鉴意义。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
16.图1为实施例1中hsp90β抑制剂(ver-50589)对于ev71作用的rd细胞的毒性检测结果；
17.图2为实施例1中hsp90β抑制剂(ver-50589)对于ev71作用的hela细胞的毒性检测结果；
18.图3为实施例2中ticd
50
法测定不同浓度hsp90β抑制剂(ver-50589)的抗病毒活性检测结果；
19.图4为实施例2中空斑法测定不同浓度hsp90β抑制剂(ver-50589)的抗病毒活性检测结果；其中图4a为空斑法拍摄的图片；图4b为空斑数量的统计结果；
20.图5为实施例3中实时荧光定量pcr(qpcr)方法检测hsp90β抑制剂(ver-50589) 抑制病毒复制的效果；
21.图6为实施例3中western blot检测hsp90β抑制剂(ver-50589)抑制病毒复制的效果；
22.图7为实施例4中ver-50589和对照组对于ev71在宿主细胞rd产生的细胞病变效应(cpe)影响结果；其中图7a为对照组rib代利巴韦林对于ev71在宿主细胞rd产生的细胞病变效应结果；图7b为ver-50589对于ev71在宿主细胞rd产生的细胞病变效应结果；
23.图8为实施例5中hsp90β抑制剂(ver-50589)对于icr3d乳鼠水平显著抑制ev71 的复制，从而显著提高感染小鼠的存活率。
具体实施方式
24.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
25.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
26.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
27.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
28.ver50589是hsp90β抑制剂，是一类具有生物活性的有机小分子化合物，它所作用的靶点蛋白热休克蛋白90(hsp90β)蛋白家族是表达最丰富的分子伴侣之一，从细菌到真核生物都高度保守。ver50589的化学结构式如下：
[0029][0030]
需要说明的是，ver50589在本发明中以编号jyt046代称。
[0031]
ver-50589是强效的hsp90β抑制剂，对hsp90β的ic50为21nm。
[0032]
本发明通过实验发现：化合物hsp90β抑制剂(ver-50589)抑制ev71在宿主细胞rd 产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率；抑制ev71病毒在细胞内的复制增殖；保护ev71病毒感染小鼠的致死。综上可知，本发明结果表明化合物ver50589有潜力制备抗 ev71感染的特异药物，具有较好的临床应用前景。
[0033]
因此，本发明提供ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，所述应用是指 ver50589添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗ev71病毒的制剂，辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着剂中的至少一种，根据药物剂型的需要选择不同的辅料。所述制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。
[0034]
可以理解的是，以ver50589为先导化合物进行进一步结构优化，用于制备肠道病毒感染性疾病药物也属于本发明想要保护的范围。
[0035]
下面将结合实施例及实验数据对本技术的ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用进行详细说明。
[0036]
实施例1、目标化合物hsp90β抑制剂(ver-50589)的细胞毒性检测
[0037]
1、在rd细胞中，对hsp90β抑制剂(ver-50589)的细胞毒性进行检测。将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养12-16h后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，药物作用48h后mtt染，检测od
492
nm，分析细胞存活率。prism7软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(median cyctoxicconcentration，cc
50
)，如图1所示。
[0038]
由图1可知，rd细胞中，药物对于细胞的半数中毒浓度cc
50
＝22123nm。
[0039]
2、在hela细胞中，对hsp90β抑制剂(ver-50589)的细胞毒性进行检测。将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养12-16h后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，药物作用48h后mtt染，检测od
492
nm，分析细胞存活率。prism7软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(median cyctoxicconcentration，cc
50
)，如图2所示。
[0040]
由图2可知，hela细胞中，药物对于细胞的半数中毒浓度cc
50
＝29027nm。
[0041]
实施例2、ver50589对于对ev71病毒复制的抑制效果
[0042]
1、ticd
50
法测定目标化合物hsp90β抑制剂(ver-50589)不同浓度，对ev71病毒复制的抑制效果
[0043]
将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，moi＝3
ꢀ×
107cpe/ml的ev71病毒液感染细胞2h孵育细胞。分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养约24h，阴性对照加入同体积pbs。病毒对照孔出现90％左右的cpe病变时，将细胞板反复冻融，收集不用药物浓度作用后的含有病毒的细胞培养基(其中病毒滴度待tcid
50
法检测，及空斑法检测)，用tcid
50
的方法测定不用药物作用后，病毒tcid
50
的变化趋势。利用reed-muench公式计算出不同浓度抑制ev71复制后的tcid
50
及非药物组的病毒孔的tcid
50
。用prism7软件制作柱状图y轴为log
10
(tcid
50
/ml)，x轴为不懂药物浓度，单位(nmol/l)。
[0044]
结果如图3所示，表明所述ver-50589浓度为20μmol/ml时，对于ev71病毒的抑制率为96.3％，ver-50589浓度为0.16μmol/ml时，对于ev71病毒的抑制率为89％。
[0045]
2、空斑法测定目标化合物hsp90β抑制剂(ver-50589)不同浓度，对ev71病毒复制的抑制效果
[0046]
将vero细胞1
×
106的密度种于6孔板细胞板中37摄氏度，5％co2细胞培养箱培养过夜，将待检测的含病毒的培养基(上述)稀释相同倍数后感染vero，2h后去掉培养基，更换为1.7％琼脂糖培养基覆盖，继续相同环境培养72h,后4％甲醛溶液固定30min,5％结晶紫溶液染过夜，后在缓慢水流下冲洗，暴露染后固定的细胞，后拍摄图片进行对比(图 4a所示)，统计空斑数量，采用graphpad软件制图(图4b所示)。
[0047]
由图4可知，ver50589对于对ev71病毒复制有较好的抑制效果。
[0048]
实施例3、ver50589对于ev71的抗病毒活性检测
[0049]
1、rd细胞接种于12孔板细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12-16h，使其培养至单层细胞，使用含有不同浓度的实验化合物进行处理，阴性对照加入同体积pbs。用ev71病毒感染，37℃孵育2h后，更换培养基为2％fbs的dmem培养基，24h后，通过实时荧光定量pcr(qpcr)方法检测hsp90β抑制剂(ver-50589)抑制病毒复制的效果。
[0050]
结果如图5所示，可知：在不同浓度条件下，hsp90抑制剂(ver-50589)对ev71病毒的复制均有显著抑制作用。
[0051]
2、重复上述试验，24h后收集细胞沉淀，并在冰上裂解，制蛋白样，western blot检测后，并用photoshop软件制作试验结果图片。
[0052]
结果如图6所示，表明hsp90β抑制剂(ver-50589)对于ev71有较好的抑制活性。
[0053]
实施例4、ver-50589对ev71引起的rd细胞cpe的抑制效应检测
[0054]
将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100 tcid50的ev71病毒液感染细胞2h，(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的cpe病变时，显微镜下观察细胞病变效应(cpe)。
[0055]
结果如图7所示，表明hsp90β抑制剂(ver-50589)抑制ev71引起的rd细胞cpe 效应，ev71感染的rd细胞变圆，从细胞板壁脱离，不同浓度的实验化合物处理对于其病变效应有显著的抑制作用。且与对照组rib代利巴韦林相比，hsp90β抑制剂的抑制作用更强。
[0056]
实施例5、目标化合物hsp90β抑制剂(ver-50589)对ev71感染小鼠的影响
[0057]
icr3d乳鼠全程饲养于spf环境，小鼠感染采用腹腔注射法，接毒量为108pfu/只，体积40μl。随后，小鼠被分为3组：(1)ev71+vehicle组；(2)ev71+jyt046 15mg/kg/d； (3)ev71+jyt046 5mg/kg/d组。mock组为等体积安慰剂。腹腔注射法给药。
[0058]
jyt046(ver-50589)的用量严格按照实验方案执行，每天1次，共计8天。整个实验流程严格遵守动物保护和使用委员会操作指南所规定的美国国立卫生研究院的指导方针。小鼠每日监测指标包括：活动力、应激反应、体重、四肢灵活度等。
[0059]
结果如图8所示，与对照组相比，给药组小鼠死亡率显著降低至，且有剂量相关性。提示hsp90β抑制剂(jyt046)可以在小鼠水平显著抑制ev71的复制，从而显著提高感染小鼠的存活率。
[0060]
综上所述，hsp90β抑制剂(ver-50589)具有一定的抑制ev71活性，可以强烈抑制 ev71病毒引起的rd细胞病变效应，增强细胞存活率，抑制病毒rna水平的复制，显著降低感染老鼠的死亡率，有潜力进一步开发制备一种临床上有效对抗ev71病毒感染的药物。
[0061]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0062]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.ver50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肠道病毒71型药物还包括药学上可接受的辅料和载体。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着剂中的至少一种。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肠道病毒71型药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肠道病毒71型药物的抗病毒的方式包括：抑制肠道病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ver-50589浓度为20μmol/ml时，对于ev71病毒的抑制率为96.3％，ver-50589浓度为0.16μmol/ml时，对于ev71病毒的抑制率为89％。

技术总结

本发明提供了VER50589在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，HSP90β抑制剂(VER-50589)具有一定的抑制EV71活性，可以强烈抑制EV71病毒引起的RD细胞病变效应，增强细胞存活率，抑制病毒RNA水平的复制，显著降低感染老鼠的死亡率，可在制备抗EV71病毒药物中应用。可在制备抗EV71病毒药物中应用。可在制备抗EV71病毒药物中应用。