高栋梁，张雷，张宏峰，杨喜明
作者单位：延安大学附属医院烧伤整形手外科，陕西
延安716000
通信作者：张宏峰，男，副主任医师，研究方向为创面修复的机制及病理性瘢痕的防治，Email ：摘要：目的
研究微小RNA -4463（miR -4463）对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移、侵袭的影响以及机制。方法
收集延安
大学附属医院2017年12月至2019年6月整形手术病人40例，每例切除瘢痕疙瘩组织1个以及邻近正常皮肤组织1个，利用定量聚合酶链反应（qPCR ）检测人正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR -4463的表达量；将miR -4463模拟物对照质粒和miR -4463模拟物分别在Lipofectamine 2000介导下转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞，分为miR -NC 组和miR -4463组；常规培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞作为对照；qPCR 检测转染后miR -4463的表达量；qPCR 检测上调miR -4463对瘢痕疙瘩纤维化相关基因Col
1A1、Col 3A1表达的影响；细胞计数试剂盒（CCK -8）检测上调miR -4463对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响，Transwell 实验检测细胞的迁移、侵袭；采用TargetScan 软件预测miR -4463与B 细胞淋巴瘤-2（Bcl -2）相关的致病基因BAG4的靶向关系，双荧光素酶报告基因进一步进行验证。结果
miR -4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量较人正常成纤维细胞显著降低［（0.218±
0.036）比（1.000±0.071），P <0.05］；与对照组相比，转染miR -4463模拟物明显增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR -4463的表达量［（1.000±0.073）比（3.313±0.242），P <0.05］；上调miR -4463显著抑制瘢痕疙瘩纤维化相关基因Col 1A1［（1.000±0.065）比
（0.334±0.010）］、Col 3A1［（1.000±0.070）比（0.301±0.008）］的表达量（P <0.05）；上调miR -4463抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖［（0.836±0.081）比（0.656±0.072），P <0.05］，降低其迁移［（153.269±12.471）个比（82.363±7.254）个］、侵袭细胞数［（73.623±6.451）个比（36.459±3.235）个］（P <0.05）；BAG4是miR -4463下游靶基因。结论miR -4463可能通过调控BAG4抑制细胞外基
质中纤维化相关胶原基因的表达，抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移、侵袭。关键词：瘢痕疙瘩；成纤维细胞；miR -4463；Bcl2相关致病基因4（BAG4）
Effect of miR -4463on proliferation and invasion of human keloid fibroblasts
GAO Dongliang,ZHANG Lei,ZHANG Hongfeng,YANG Ximing
Author Affiliation:Burn and Hand Plastic Surgery,Yan'an University Affiliated Hospital,Yan'an,Shaanxi
716000,China
Abstract ：Objective
To study the effects of microRNA -4463(miR -4463)on the proliferation,migration and invasion of human ke‐
loid fibroblasts and its mechanism.Methods
Forty patients with plastic surgery in Yan′an University Affiliated Hospital from Decem‐
ber 2017to June 2019were collected.One keloid tissue and one adjacent normal skin tissue were excised from each patient.The ex‐pression of mir -4463in human normal fibroblasts and keloid fibroblasts was detected by quantitative polymerase chain reaction (qP‐
CR).The control plasmid and the mimic of miR -4463were respectively transfected into keloid fibrobl
asts by Lipofectamine 2000and assigned into miR -NC group and miR -4463group,while the conventional cultured keloid fibroblasts were selected as controls.The ex‐pression of miR -4463after transfection was detected by qPCR.qPCR was used to detect the effect of up -regulated miR -4463on the ex‐pression of keloid fibrosis related genes Col 1A1and Col 3A1.Cell counting kit -8(CCK -8)was used to detect the effect of up -regula‐tion of miR -4463on the proliferation of keloid fibroblasts.The cell migration and invasion were analyzed by Transwell assay.The tar‐geting relationship between miR -4463and Bcl -2-associated athanogene (BAG4)was predicted by TargetScan and further validated by double luciferase reporter gene.Results
The expression of miR -4463in keloid fibroblasts was significantly lower than that in human
normal fibroblasts [(0.218±0.036)vs .(1.000±0.071),P <0.05].Compared with the control group,the expression of miR -4463in keloid fi‐broblasts transfection with miR -4463mimics was significantly increased [(1.000±0.073)vs .(3.313±0.242),(P <0.05)].Up -regulation of miR -4463significantly inhibited the expression of Col 1A1[(1.000±0.065)vs .(0.334±0.010)]and Col 3A1[(1.000±0.070)vs .(0.301±0.008)]in keloid fibrosis (P <0.05).Up -regulation of miR -4463inhibited the proliferation of keloid fibroblasts [(0.836±0.081)vs .(0.656±0.072),P <0.05],and decreased the number of migrating [(153.269±12.471)vs .(82.363±7.254)]and invading [(73.623±6.451)vs .(36.459±3.235)]cells (P <0.05)
.BAG4was the downstream target gene of miR -4463.Conclusion miR -4463may inhibit the ex‐
pression of fibrosis -related collagen genes in extracellular matrix by regulating BAG4,and inhibit the proliferation,migration and inva‐
sion of keloid fibroblasts.
◇临床医学
◇
引用本文：高栋梁，张雷，张宏峰，等.微小RNA -4463对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的影响［J ］.安徽医药，2021，25（6）：1140-1143.DOI ：10.3969/j.issn.1009-6469.2021.06.019.
1140
2021256 Key words：Keloid;Fibroblasts;MiR-4463;Bcl2Associated Athanogene4(BAG4)悬空板
瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕，主要表现为皮肤损伤修复过程中结缔组织快速增殖，成纤维细胞过度生
长，胶原大量沉积，并伴有炎症以及组织损伤等［1-2］。瘢痕疙瘩生长在面部等部位严重影响病人的容貌，给病人带来极大的生活困扰。目前，瘢痕疙瘩的发病机制尚不十分清楚，临床缺乏特异性的方法。因此，探究瘢痕疙瘩发生发展过程中的分子机制，为临床寻新的防治方法具有重要意义。研究结果表明，阻碍成纤维细胞的恶性增殖可抑制瘢痕疙瘩的生长［3］。微小RNA（microRNA，
miRNA）是一种具有广泛作用的非编码RNA，主要调控转录后的靶基因水平，影响多种人类疾病的发生发展［4-6］。研究证实，miRNA的表达量异常与多种皮肤病如瘢痕疙瘩的病理进程紧密相关［7］。研究显示，miR-4463在瘢痕疙瘩组织中较正常对照明显降低［8］，但其具体的作用机制尚不明确。本研究拟通过探究miR-4463对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭的影响及分子机制，为临床阐明瘢痕疙瘩发生发展分子机制提供实验基础。
1材料与方法
1.1主要材料胎牛血清、DMEM培养基、Tran‐swell小室购自美国Corning公司，Trizol试剂、Lipo‐fectamine2000购自美国Invitrogen公司，定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒、cDNA逆转录试剂盒购自中国Roche公司，细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）购自上海碧云天生物有限公司；Ma‐taigel胶购自美国BD公司，miR-4463模拟物对照质粒、miR-4463模拟物均购自广州锐博生物科技有限公司，荧光素酶试剂盒购自美国Sigma公司。荧光定量PCR扩增仪购自美国ABI公司，多功能酶标仪购自美国Applied Biosystoms公司。
1.2细胞的收集与培养收集延安大学附属医院2017年12月至2019年6月整形手术病人40例，每例切除瘢痕疙瘩组织1个以及邻近正常皮肤组织1个，其研究均获得病人或其近亲属的同意，且均经过病理学检验确认为瘢痕疙瘩。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。病人年龄在20~35岁，均未接受任何瘢痕相关。收集的样本置于无菌条件下清洗，使用组织块贴壁法分离瘢痕疙瘩成纤维细胞［9］，经鉴定符合实验要求，加入含10%胎牛血清DMEM培养基孵育，置于5%二氧化碳、37℃培养，每2天加入胰酶消化、传代。
1.3细胞的转染选取对数期3~5代瘢痕疙瘩成纤维细胞，采用随机数字表法分为对照组、miR-NC 组、miR-4463组。常规培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞作为对照组，miR-NC组、miR-4463组根据Lipo‐
fectamine2000说明书将miR-4463模拟物对照质粒和miR-4463模拟物分别转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞，然后置于37℃继续培养48h。取临床手术中正常皮肤标本，应用组织块法进行培养，用2.5g/L胰蛋白酶进行消化传代，实验用第3~8代处于对数生长期的细胞。
1.4qPCR实验各组瘢痕疙瘩成纤维细胞转染后培养48h，收集5×105/孔置于6孔板中，待细胞密度约为80%~90%，加入Trizol试剂，提取瘢痕疙瘩成纤维细胞总RNA，逆转录为互补DNA（cDNA），反应条件为50℃60min，85℃5min。引物均由上海生工生物公司设计、合成，如下表所示。miR-4463以U6为参照，Col1A1和Col3A1以GAPDH为参照，根据qPCR试剂盒指示检测miR-4463的表达量，反应条件：95℃15min，95℃15s，57℃45s，35个循环，采用2−ΔΔCt法计算miR-4463的表达量。
1.5CCK-8实验将各组1×104个瘢痕疙瘩成纤维细胞接种至96孔板，加入适量培养基，分别培养24 h、48h、72h，每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃继续孵育2h，酶标仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞450nm 吸光度。
1.6Transwell实验将Mataigel基质胶稀释液提前加入Transwell上室膜，风干、备用；收集各组转染48h的瘢痕疙瘩成纤维细胞，在胰酶的介导下将其密度调整为1×106/mL；吸取200μL瘢痕疙瘩成纤维细胞悬液加入Transwell上室，下室中加入600μL、含10%胎牛血清的培养基，37℃培养48h；取5个区域计数，计算平均值即为侵袭细胞数；检测迁移细胞数时，Transwell上室膜不加入Mataigel基质胶。1.7miR-4463靶基因的预测和验证Targetscan
表1引物序列
基因
miR-4463
Col1A1
Col3A1
U6
GAPDH
序列
正向：5’-GGCCCACCCCAGTCTC-3’
反向：5’-GCAGGAGACTGGGGTG-3’
正向：5’-CGAAGACATCCCACCAATCAC-3’
反向：5’-GATCGCACAACACCTTGCC-3’
正向：5’-CCTGGTCCTTGCTGTGGTGGTGT-3’
射频调制器>三方通话
反向：5’-GCAGTTTCTAGCGGGGTTTTTACG-3’
正向：5’-CCTGCTTCGGCAGCACA-3’
反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’
正向：5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’
反向：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’
1141
2021256
（http：///vert_71/）预测miR-4463与B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）Bcl-2相关的致病基因
BAG4的靶向关系。野生型（BAG4-wt）荧光素酶报告载体（含有与miR-4463结合的位点）和突变型（BAG4-mut）荧光素酶报告载体（含有突变位点）均购买自美国Sigma公司，分别与miR-NC质粒、miR-4463模拟物共转染，37℃培养48h，在荧光素酶试剂盒说明书指示下测定瘢痕疙瘩成纤维细胞中的荧光素酶相对活性。
1.8统计学方法实验结果通过SPSS2
2.0统计学软件分析，正态分布资料表示为xˉ±s，两组间的比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1miR-4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量与人正常成纤维细胞细胞（1.000±0.071）相比，miR-4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达量（0.218±0.036）明显降低（t=29.470，P<0.001）。
2.2转染miR-4463模拟物对瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-4463表达量的影响与对照组（1.000±0.073）相比，miR-NC组瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-4463表达量（1.026±0.085）差异无统计学意义（P> 0.05），但miR-4463组细胞中miR-4463表达量（
3.313±0.242）明显增加（F=669.515，P<0.001）。2.3上调miR-4463对瘢痕疙瘩纤维化相关基因表达、细胞增殖、迁移及侵袭的影响与对照组相比，miR-NC组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Col1A1、Col3 A1表达量、细胞增殖、迁移及侵袭差异无统计学意义（P>0.05），但miR-4463组细胞中Col1A1、Col3 A1表达量、增殖活性、迁移及侵袭数明显降低（P< 0.05）。见表1、图1。
2.4miR-4463靶基因的预测和验证BAG4基因3’端非翻译区域（3’UTR）部分碱基可于miR-4463特异性结合，见图2。
跟miR-NC与BAG4-wt共转染（1.000±0.065）相比，miR-4463模拟物与BAG4-wt共转染降低瘢痕疙瘩成纤维细胞荧光素酶相对活性（0.435±0.048）（t=
20.977，P<0.001）；但miR-4463模拟物与BAG4-mut 共转染（0.994±0.081）跟miR-NC与BAG4-m
ut共转染（1.000±0.083）相比，对瘢痕疙瘩成纤维细胞荧光素酶相对活性无明显影响（t=0.155，P=0.879）。
3讨论
瘢痕疙瘩是一种组织在创伤或感染后过度修复、纤维化的良性肿瘤，其病理进展与成纤维细胞增殖调控异常有关。瘢痕疙瘩发生发展主要表现为成纤维细胞增殖活性增强，但其发病机制尚不明确，手段多样，但效果不令人满意，已经成为整形外科亟待解决的主要难题之一。越来越多的研究表明，瘢痕疙瘩的发生、发展与miRNA表达量异常紧密相关［10-11］。
Col1A1和Col3A1基因是一种胶原表达的相关基因，在瘢痕疙瘩发生发展中起到重要作用，Col 1A1和Col3A1基因过表达可引起成纤维细胞的增殖。
miR-4463是近年来发现的一种miRNA，通过调控细胞的增殖、侵袭影响人类疾病的发生发展。研究表明，采用miRNA芯片技术检测发现，miR-4463在动脉硬化闭塞症病人中表达量明显降低，进一步过表达miR-4463抑制低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞迁移，从而参与动脉硬化闭塞症的病理发生过程［12］。另外研究表明，miR-4463可通过靶向调控下游靶基因（细胞迁移相关蛋白AMOT）表达来调控血管平滑肌细胞迁移，为探究血管疾病的新疗法提供实验依据［13］。除此之外，miR-4463可增强过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激反应，并促进其凋亡，表明miR-4463在血管疾病中发挥重
要作
表1上调miR-4463对瘢痕疙瘩纤维化相关基因表达的影响/xˉ±s
组别
对照组miR-NC组miR-4463组
F值
P值重复
次数
9
9
9
Col1A1相对
表达量
1.000±0.065
1.022±0.090
0.334±0.010①
558.490
<0.001
Col3A1相对
表达量
1.000±0.070
1.025±0.059
0.301±0.008①
601.287
<0.001
吸光度
24h
0.503±0.049
投票机0.525±0.058
0.487±0.050
1.189
0.322
48h
0.836±0.081
0.857±0.086
0.656±0.072①
17.219
<0.001
72h
1.227±0.156
1.254±0.163
0.872±0.085①
21.109
<0.001
迁移细胞数/个
153.269±12.471
148.235±13.052
82.363±7.254①
111.663
<0.001
侵袭细胞数/个
73.623±6.451
83.274±7.336
36.459±3.235①
155.781
<0.001
注：Col1A1为I型胶原蛋白A1，Col3A1为Ⅲ型胶原蛋白A1。
①与miR-NC组比较，P<0.05。
图2Targetscan预测miR-4463与BAG4的靶向关系
1142
2021256
用。但研究发现，miR-4463在瘢痕疙瘩病人样本组织中表达量异常，表明miR-4463可能参与瘢痕疙瘩病理发展过程。因此本实验通过qPCR检测miR-
4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞、人正常成纤维细胞中的表达量，结果显示，miR-4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量明显降低，与前人研究在组织中的表达量具有一定的相似性；进一步上调miR-4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量，结果显示，过表达miR-4463抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，降低其侵袭、迁移能力，表明miR-4463可通过影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学特性，阻碍瘢痕疙瘩组织的生长。
BAG4是BAG家族蛋白成员之一，可靶向结合于B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewk‐mia-2，Bcl-2），阻碍细胞凋亡信号的传导，降低细胞的凋亡率。近年来的研究发现，BAG4在多种肿瘤组织如非小细胞肺癌［14］、乳腺癌［15］、黑素瘤［16］中表达量异常，参与肿瘤的发生、转移过程。研究证实，BAG4在瘢痕疙瘩病理演进过程中表达量明显上调，表明BAG4参与瘢痕疙瘩的病理进程［17］。在本实验中，为进一步探究miR-4463抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制，通过在线数据库预测发现，BAG43’UTR区域含有部分碱基可特异性结合于miR-4463，表明BAG4可能是miR-4463的下游靶基因；进一步通过双荧光素酶验证发现，miR-4463与含有结合位点的BAG4野生型载体共转染可降低细胞中的双荧光素酶相对活性，而与BAG4突变型载体共转染对细胞中双荧光素酶相对活性无显著影响，表明miR-4463可通过特异性结合于BAG4，从而降低细胞中的双荧光素酶相对活性，证实BAG4是miR-4463的下游靶基因。
综上所述，miR-4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量显著降低；过表达miR-4463可抑制细胞外基
质中纤维化相关胶原基因的表达，抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭、迁移，其作用机制可能是通过靶向调控BAG4表达量，为瘢痕疙瘩临床特异性方法的探究提供实验依据，未来会进一步深入研究miR-4463的作用机制以及探究其在临床样本中的作用。
（本文图1见插图6-4）
参考文献
［1］KULAWCZUK P，CZAPLA N，BIŃCZAK-KULETA A，et al.Ge‐netic basis of keloid formation in wounds after cardiac surgery［J］.
Kardiochir Torakochirurgia Pol，2014，11（3）：273-277.
［2］LEDON J A，SAVAS J，FRANCA K，et al.Intralesional treat‐ment for keloids and hypertrophic scars：a review［J］.Dermatol
Surg，2013，39（12）：1745-1757.
［3］MUKHOPADHYAY A，TAN E K J，KHOO Y T A，et al.Condi‐tioned medium from keloid keratinocyte/keloid fibroblast cocul‐
殊胜诃子ture induces contraction of fibroblast-populated collagen lattices
［J］.Br J Dermatol，2005，152（4）：639-645.
［4］LUDWIG N，LEIDINGER P，BECKER K，et al.Distribution of miRNA expression across human tissues［J］.Nucleic Acids Res，2016，44（8）：3865-3877.
［5］REDDY K B.MicroRNA（miRNA）in cancer［J］.Cancer cell Int，2015，15（1）：38-52.
［6］GANJU A，KHAN S，HAFEEZ B B，et al.miRNA nanotherapeu‐tics for cancer［J］.Drug Discov Today，2017，22（2）：424-432.［7］LIU Y，YANG D，XIAO Z，et al.miRNA expression profiles in keloid tissue and corresponding normal skin tissue［J］.Aesthetic
Plast Surg，2012，36（1）：193-201.
［8］YAO X，CUI X，WU X，et al.Tumor suppressive role of miR-1224-5p in keloid proliferation，apoptosis and invasion via the
TGF-β1/Smad3signaling pathway［J］.Biochem Bbiophys Res
commun，2018，495（1）：713-720.
［9］薛斌，王璞，董浦江.人瘢痕疙瘩成纤维细胞原代培养及生物学行为研究［J］.激光杂志，2007，28（2）：95-95.
［10］LI C，BAI Y，LIU H，et al.Comparative study of microRNA profil‐ing in keloid fibroblast and annotation of differential expressed mi‐
croRNAs［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2013，45（8）：692-699.［11］LUAN Y，LIU Y，LIU C，et al.Serum miRNAs signature plays an important role in Keloid disease［J］.Cur Mol Med，2016，16
（5）：504-514.
［12］何雪梅，王雪琴，杜超，等.miR-4463在下肢动脉硬化闭塞症中的表达及意义［J］.中国动脉硬化杂志，2017，25（8）：812-817.［13］WANG X，DU C，HE X，et al.MiR-4463inhibits the migration of human aortic smooth muscle cells by AMOT［J/OL］.Biosci
Rep，2018，38（5）：20180150.DOI：10.1042/BSR20180150.［14］WANG R，WANG L，LI Y，et al.FGFR1/3tyrosine kinase fu‐sions define a unique molecular subtype of non–small cell lung
cancer［J］.Clin Cancer Res，2014，20（15）：4107-4114.
［15］ZUBOR P，HATOK J，MORICOVA P，et al.Gene expression ab‐normalities in histologically normal breast epithelium from pa‐
tients with luminal type of breast cancer［J］.Mol Biol Rep，2015，42（5）：977-988.
［16］REULAND S N，SMITH S M，BEMIS L T，et al.MicroRNA-26a is strongly downregulated in melanoma and induces cell death
through repression of silencer of death domains（SODD）［J］.J In‐
vest Dermatol，2013，133（5）：1286-1293.
［17］SATISH L，LUO JH，PRIYA KS，et al.139Gene array profiling of keloid fibroblasts to identify the target genes for therapeutic
evaluations［J］.Wound Repair and Regeneration，2004，12（2）：A36.
（收稿日期：2020-01-22，修回日期：2020-05-18）
1143
微小RNA-4463对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的影响
（正文见1140
页）
插图6-4
35（正文见1124
高频电子水处理器
页）
图1 超声造影模型诊断恶性乳腺肿物的ROC
曲线
>BI-RADS 3>BI-RADS 4A >BI-RADS 4B >BI-RADS 4C 参考线
0.20.40.6 1.0
YAP 干扰腺病毒载体对宫颈癌增殖、迁移及侵袭的影响
（正文见1136页）
图1 荧光显微镜下观察宫颈癌CaSki 细胞感染48 h 后病毒感染情况（×10）：A 为腺病毒靶向YAP 干扰载体（pAd-si-YAP ）感染CaSki 细胞；B 为重组空载体腺病毒（pAd-mock ）感染CaSki
细胞
图1miR-4463200）
miR-NC 组
对照组
miR-4463
细胞迁移数
细胞侵袭数A B
0.80
0.2
0.4
0.6
1.0
0.8
