摘要：荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具，特别是对一些染体数目异常和复杂染体异常的诊断，架起了染体显带技术和分子遗传学之间的桥梁。本文主要就荧光原位杂交技术的发展历程、探针制备和临床应用做一简单的综述。 关键词：FISH；荧光原位杂交；临床应用；产前诊断；肿瘤
Fluorescence in situ hybridization and applications
SUN Jingjing,YAN Shouqing
(College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China)
Abstract: FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads, bridging the gap between conventional chromosome banding analys
is and molecular genetic DNA studies. This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics.
Key words: FISH; Fluorescence in situ hybridization; Clinical applications; Prenatal diagnosis; Tumor
DNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染体上显示DNA序列位置的方法[1]。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染体进化研究等领域。 1 FISH技术的产生
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术[2]，但是没有得到广泛应用。1974年Evans第一次将染体显带技术和原位杂
交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染体非整倍体的可行性，从而开辟了间期细胞遗传学研究[3]。
2 FISH的原理
荧光原位杂交技术原理是将DNA探针用生物素和毛地黄毒苷等荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合，通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。与其他原位杂交技术相比，荧光原位杂交具有很多优点，主要体现在：制作智能卡 ①FISH不需要放射性同位素作探针标记，安全性高；②FISH的实验周期短，探针稳定性高； ③FISH能通过多次免疫化学反应，使其杂交信号明显增强，从而提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；④FISH的分辨率高达3-20Mb；⑤FISH可以用不同修饰
核苷酸分子标记不同的DNA探针，再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子，因此可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到它们的相关位置和顺序，从而大大加速生物基因组和功能基因定位的研究[4]。
3 FISH技术的发展
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在20世纪90年代，FISH在方法上逐步形成了从单向多、从中期染体FISH向粗线期染体FISH再向fiber-FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。
3.1 多荧光原位杂交（M-FISH）
多原位杂交(M-FISH)，“M”分别代表“Multicolor”、“Multiplex”和“Multitar get” 3种类型。M-FISH的最大特点是：可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在一次FISH实验中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双FISH 技术。1990年Nederlof等提出用3种荧光素探测3种以上的靶位DNA序列，创建了多FISH人脸识别智能门禁方法。以下五种方法是在多彩FISH基础上发展起来的新技术：染体描绘(chromosome paint ing)、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)、光谱染体自动
核型分析(spectral karyotyping, SKY)、交叉核素带分析(cross-species color banding, Rx-FISH)、多彩原位启动标记(multicolor primed in situ labeling, multicolor PRINS) [5]。
3.2 DNA纤维荧光原位杂交技术(DNA fiber-FISH)
Wiegant等和Heng等首先利用化学方法染体进行线性化，再以此线性化的染体DNA 作为载体进行FISH，使FISH的分辨率显著提高，就是最初的纤维-FISH。Parra和Windle(1993)，Heiskanen等(1994)，Florijn等(1995)，进一步改进了伸展DNA纤维的方法，使DNA纤维的伸展程度从最初的80kb/μm达到了现在的2.5-3.5kb/μm，这一数值与Watson-Crick建立的DNA双螺旋模型中B-DNA分子的理论值2.97kb/μm十分接近，因此可以说现在得到的DNA纤维基本上是裸露的双螺旋DNA分子。纤维-FISH的关键就在于何制备高质量的线性DNA纤维纤维-FISH具有高分辨率,能进行定量分析，模板要不高，只需分析少量的DNA分子(<10个)，灵敏度高等优点由于纤维-FISH的这些优点使得它在染体图谱绘制，基因重组研究以及临床染体基因序列检测工作中起着十分重要的作用[1]。
3.3 组织微阵排列技术(tissue microarray)
Microarray可以在1次实验中检测出数百个基因在1个细胞中的表达情况(包括降低和增高)。Tissue array则在1次实验中能检测出1个基因在数百个细胞中的表达情况。Tissue microarray是由Tissue microarray区域中500-1000单个肿瘤组织联合筒状活检构成的，将活检组织切成200多片用于DNA、RNA探针。单个杂交提供单个载玻片上所有样本的信号，以后的切片可以用其他探针或抗体分析。同一个组织样本切片的多重叠区域可以形成数千张切片[6]。组织和cDNA微阵排列技术相结合提供一种有力的体内鉴定基因的方法，可以对癌或其他疾病的分子改变做出重要评估。
3.4 荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学(fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics, FICTION)
FICTION缝隙式排水沟是1种将免疫核型分析和原位杂交相结合的方法，这种方法可以同时显示异种细胞中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因改变。FICTION形态学有关，可以对档藏材料作回顾性研究[7]。FICTION诊断快速，可以再现，适合FISH分析前或后没有所需以前细胞标本的细胞学样本[8]。FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱以获得对肿瘤病理组织更好的了解。
树脂吸附
4 FISH技术的应用
FISH技术已经在细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断及哺乳动物染体进化研究等领域得到了广泛应用。
4.1 染体结构变异与非整倍体的检测
荧光原位杂交简化了染体结构变异的检测。如植物染体的非整倍体是由于染体行为异常，即可能是双亲配子染体数目和结构差异引起或染体亲缘关系较远等因素导致。利用原位杂交可比较容易地检测出缺失、附加或替换的染体[9]。
4.2 基因扩增和缺失的检测
FISH空间分辨率和敏感性使得亲本和扩增基因在抗病虫害细胞中定位成为可能[10]。被扩增基因主要在同一染体臂上，但离初始亲本基因有一定距离，且经常独立地位于染体端粒部位；FISH分析表明细胞断裂可能是由于染体含有扩增区域的结构重排。同时用FISH 可定位转基因植物中外源基因位置和拷贝数，此法在番茄、烟草、大麦、小麦、黑麦
等作物中已获成功。利用FISH技术也可检测一些与遗传性疾病相关的基因缺失，如成功检测了aniridia疾病(一种虹膜缺失的罕见遗传异常疾病)患者的缺失基因。
4.3 基因定位
荧光原位杂交的基因定位技术有着广泛的应用。PP2Ac突变型肺癌相关基因在染体区域的定位，荧光显微镜下观察记录和分析杂交信号的特征。结果在正常人淋巴细胞的染体5q23-31可见明显杂交信号，在GLC-82细胞的5号和7号染体上出现较强信号。说明点突变引起PP2Ac活性改变，从而基因易位，导致肺肿瘤的产生[11]弹片开关。FISH技术与生化、计算机和重组DNA技术结合检测Alu位点，表明DNA序列与带型有关。用FISH技术对人类基因组中编码基因分布的研究揭示，基因主要集中在染体上G+C(占全基因组35% )最丰富的DNA区段。FISH技术为着丝粒结构研究提供了重要手段。应用FISH技术可直接观察染体端粒，这简化了染体在核内的结构和功能研究。
4.4 基因作图
用FISH技术可直接检测DNA在染体上的位置，所确定位置是基因在染体上实际的物理
位置。由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响，FISH技术已成为重复序列和多基因家族作图的重要手段，如M.C lark等用荧光原位杂交方法在大麦第5号染体制作出B-醇溶蛋白位点的物理图谱。多探针标记为探针定位提供了一种更简便的方法。如检测时2个探针用红，第3探针用绿，则绿位点的位置要么在2红位点之外，要么在它们之间，于是可确定探针顺序。因此，探针被至少20kbp的序列隔开就可以用FISH技术将之定位[3]。
