牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术

牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术

本发明涉及一种从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的方法，特别是建立了一 套适合工业化生产乳铁蛋白的新技术。该技术具有生产成本低，操作简单， 无污染，不改变乳铁蛋白活性等特点，生产的乳铁蛋白纯度可达85％以上， 乳铁蛋白的得率在70％以上。

乳铁蛋白(Lactoferrin，简称Lf)是富含在初乳中的一种功能因子，它最 初于1939年由Sorensen等在动物乳中发现，1953年Polis等在制备乳过氧 化物酶时得到了它的粗制品，1960年Johansson和Montreuil等从人乳中首 次分离出Lf。Lf因最先在乳汁中被发现而得名，后来的研究表明，它也广泛 存在于动物体的泪液、唾液、汗液、胰液、胆汁、精液等内、外分泌液中， 只是在乳汁中含量较高，如牛初乳中的Lf质量浓度为1g/L，而在其它分泌 物中含量甚微。近代研究证明，Lf具有许多独特的生物学功能：增强铁的传递 和吸收；广谱的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用；促进肠道菌的平衡；作 为生长因子；抗炎症；抗病毒；抗癌症作用等。对Lf的分离、加工、综合 利用的研究，已经成为食品界，特别是乳品界关心的热点。

Lf是一种铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族。分子的主体是一个大约 有700个氨基酸残基构成的、相对分子质量约为80,000Da的单肽链，并连 接1～2个配糖体，其组成包括甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸、 岩藻酸等。牛乳Lf由703氨基酸构成，等电点在8.0。

由于Lf具有一些非凡的生理功能，自1960年以来人们就试着采用各种 方法来制备Lf，人乳中Lf含量虽然丰富，但是依靠从人乳中提取Lf并不现 实。商用Lf通常从牛乳中分离提取，特别是牛初乳和乳清，资源丰富，可实现 规模化、商品化生产。物料的前期处理方法基本相同，都是采用新鲜牛初乳 通过离心脱去脂肪(4℃，3000rpm，30min)得到脱脂乳，将脱脂乳稀释后， 边搅拌边向其中加入1M盐酸溶液调整脱脂乳的pH值到4.6(酪蛋白的等电 点)，室温放置30min，离心除去酪蛋白(4℃，3000rpm，30min)，得到的上清 就是我们需要的乳清(或直接运用生产奶酪的副产物乳清)，用它来分离Lf。

乳铁蛋白的分离纯化方法较多，常见的有吸附谱法、亲和谱法、固 定化单克隆抗体法、超滤法、盐析法、离子交换法等。吸附谱法是利用固 相吸附剂通过与蛋白质分子相结合，利用不同物质和吸附剂结合力的差异性 而将它们分离，其缺点是吸附容量小、效率低；亲和谱法：亲和谱是一 种新兴地分离技术，它用来生产高纯度的Lf，该方法分离效果好纯度高，且 没有生物活性损失，是生产医药用高纯度Lf最有效的方法之一，其缺点是 成本昂贵，难以工业化生产；固定化单克隆抗体法：该方法实际上是利用抗 原-抗体之间的高特异性结合反应而实现目标物的分离。载有单克隆抗体的 免疫谱是一种亲和力谱法，它较成功的实现了Lf的一步分离，回收率 达到97％，该方法的优点是分离效果好纯度高，抗体被固定可重复使用，其 缺点是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵(1000美元/克)，难以工业化生产； 超滤法：超滤是一种基本的膜分离技术，其原理是根据膜孔径不同可以实现 不同分子质量和分子形状的大分子物质的分离，由于超滤法提供了不加热或 不发生相变进行大分子质量组分的浓缩、分离的机会，非常适合热敏性的功 能性组分的分离，但膜的污染和产品纯度较低难以满足生产的要求。盐析法： 盐析法通常是利用饱和硫酸铵沉淀乳铁蛋白，该方法尽管生产成本简单，但 由于乳清中添加硫酸铵带来了污染，产品的纯度也较低，制约了其应用。离 子交换法：该方法原理是根据离子交换剂对不同的离子或离子化合物的结合 力不同而实现目标物质的分离。Grove最早使用DEAE纤维素阴离子交换树脂 分离出较纯的Lf成分，此后，他又开发出磷酸纤维素交换谱法，并由Foley 等对此法加以改进，得到的Lf的纯度为81％左右；羧甲基阳离子交换谱法 被应用于Lf和乳过氧化氢酶的分离。树脂能用0.2MNaOH和0.2MHCl再生， 此法较DEAE纤维法更有效。尽管有人在尝试运用离子交换法生产乳铁蛋白， 但由于所选树脂的种类、性能不同、交换条件不同，未能完全实现工业化生 产。

本发明的目的在于：建立一套适合工业化从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白 的方法，纯化的乳铁蛋白纯度可达85％以上。

综合国内外的文献资料可知，乳铁蛋白的分离纯化工艺复杂，产品的纯 度较低，产品的价格高，难以商品化。本发明选用羧甲基阳离子交换树脂， 采用分批交换的方法，结合超滤脱盐和冷冻干燥工艺成功地建立了适合工业 化生产乳铁蛋白的方法。该技术的主要特点为：

①所选树脂符合食品卫生生产要求，分离纯化乳铁蛋白后，原料乳可继 续利用，无任何污染。

②该技术的工艺简单，设备投资低，适合工业化生产。

③该技术生产的乳铁蛋白，较好的保持了乳铁蛋白的活性，生产出的乳 铁蛋白纯度较高，可以满足食品及医疗行业的需要。

具体实施条件与发明制作方案

1、牛初乳离心脱脂(3000rpm，30min)，用1M的HCl调pH至4.6，沉 淀酪蛋白，离心(3000rpm，30min)，得乳清备用；

2、树脂活化，根据需要称取一定量树脂，用去离子水浸泡(常温下 1-2天，或沸水1-2小时)，再浸泡于10％NaCl溶液中，配制成Na型树脂；

3、用1MNaOH将乳清pH调至5-8，加入Na型阳离子交换树脂，于0-50℃ 搅拌2-20h，用滤布抽滤分离树脂，用去离子水洗除杂蛋白，再用 0.1-15％盐溶液(NaCl，KCl，CaCl₂，MgCl₂，NaCO₃等)洗脱树脂，洗脱液 超滤脱盐。浓缩液冷冻干燥得乳铁蛋白。

4、可用ELISA方法检测乳清中乳铁蛋白的交换情况，检测树脂的洗脱 情况。产品经SDS-PAGE进行电泳，用凝胶成像系统分析其纯度。

为了更加清楚的说明本发明，下面结合实施例进行详细说明：

实施例1：称取2g CM-SEPHAROSE FF(PHARMACIA)树脂，加入200mL 去离子水浸泡24h，收集树脂浸泡于10％的NaCl溶液中30min，制备成Na型树脂。将树脂加入5L脱脂乳清液中(pH值为6.9)，于4℃轻轻搅拌交换 8小时。用滤布分离收集树脂，经过交换后的脱脂乳清的pH、颜、气味、 感官均未发生变化。

将收集的树脂用pH为6.9去离子水清洗，以除掉杂蛋白，然后再用5％ 的盐溶液洗脱树脂，用抽滤的方式将树脂和洗脱液分离，收集洗脱液进行超 滤脱盐，超滤膜的截留分子量为3-5万，超滤压力为0.15-0.2MPa。经超滤

脱盐后的乳铁蛋白浓缩液进行冷冻干燥，收集产品4.01g。产品经电泳 分析纯度为86％，得率为69％。

实施例2：称取30g SEPABEADS FP-CM13(MITSUBISHI KASEI)阳离子交换树脂 进行活化，经平衡后装柱子(直径10cm)，用蠕动泵将2L含10％KCl溶液过 柱，然后用去离子水过柱，制备成K型阳离子交换树脂。然后将80L脱脂常 乳乳清(pH6.6，4℃)以6L/h流速通过柱子进行交换，经交换过的乳清颜， 味道，均未发生变化。

将交换过的柱子先用去离子水过柱，除去乳清和杂蛋白，接着用15L含 12％KCl溶液过柱洗脱乳铁蛋白，收集洗脱液15L。洗脱液经超滤脱盐和冷冻 干燥后，得乳铁蛋白7.2g，经检测乳铁蛋白纯度为81％，得率为73％。

实施例3：称取5g CM-SEPHADEX C-50(PHARMACIA)树脂，加入400mL 去离子水浸泡24h，收集树脂浸泡于10％的NaCl溶液中30min，制备成Na型树脂230mL。将树脂加入20L脱脂初乳乳清液中(pH值为6.8)，于4℃轻 轻搅拌交换12小时。用滤布分离收集树脂，经过交换后的脱脂乳清的pH、 颜、气味、感官均未发生变化。

将收集的树脂用pH为6.8去离子水清洗，以除掉杂蛋白，然后先用1％ 的盐溶液洗脱树脂，以除去结合不牢的杂蛋白，再用5％的盐溶液洗脱树脂， 用抽滤的方式将树脂和洗脱液分离，收集洗脱液进行超滤脱盐，超滤膜的截 留分子量为3-5万，超滤压力为0.15-0.2MPa。经超滤脱盐后的浓缩液进行 冷冻干燥，收集乳铁蛋白产品14.5g。产品经电泳分析纯度为92％，得率为 65％。本实施例采用两步法洗脱树脂，产品的纯度有了较大提高，但产品的 得率有所下降(产品的得率以初乳中乳铁蛋白含量为1g/L计算)。