水产动物饲料及柠檬酸钠在制备水产动物饲料中的应用的制作方法

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1.本发明涉及饲料技术领域，具体涉及一种水产动物饲料及柠檬酸钠在制备水产动物饲料中的应用。

背景技术：

2.大口黑鲈(学名：micropterussalmoides)又名加州鲈，隶属鲈形目太阳鱼科，是原产美国加利福尼亚州密西西比河流域的一种淡水肉食性鱼类。大口黑鲈具有生长快，病害少、耐低温，养殖周期短等特点，属凶猛的肉食性鱼类，肉质细嫩，肉多刺少，味道鲜美，营养丰富。
3.柠檬酸钠是从木薯、玉米等淀粉中高温发酵生成柠檬酸，再与氢氧化钠发生中和反应后生成。柠檬酸钠无臭味，性能稳定，无毒，安全性高，有良好的ph调节性。当前，柠檬酸钠主要应用于食品、医疗行业，如长效抗凝血剂，让食品拥有了固定的口感和风味，用作调味剂、膨胀剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、乳化剂等。但是，柠檬酸钠在水产动物中的应用尚无研究。在饲料添加剂中，柠檬酸常作为酸化剂使用，目的在于改善养殖动物的肠道健康，促进磷的元素的吸收利用。但是，柠檬酸钠与柠檬酸差别很大，首先其ph、溶解性、分解性质、味道明显不同，其次其生物学作用也不同。
4.如今，在水产养殖业中，为降低饲料成本，行业中普遍使用低蛋白高脂肪或低蛋白高糖饲料来达到低本高效的目的。但是，改变饲料基本蛋白质、脂肪、糖类的组成后，养殖动物很容易出现生长减缓、炎症发生、抗病力下降，最终导致肉质品质的下降。
5.因此，人们在积极寻各种功能性添加剂，以期达到促进生长、提高肝脏健康等效果。

技术实现要素：

6.本发明提供的一种水产动物饲料及柠檬酸钠在制备水产动物饲料中的应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
7.为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
8.第一方面，本发明公开了柠檬酸钠在制备水产动物饲料中的应用。
9.在一些实施例中，所述饲料增加水产动物中蛋白的含量。
10.第二方面，本发明公开了一种水产动物饲料，包括基础饲料及作为饲料添加剂的柠檬酸钠。
11.在一些实施例中，所述柠檬酸钠的添加量占所述水产动物饲料重量的2-3％。
12.第三方面，本发明公开了柠檬酸钠在制备预防或水产动物肝脏疾病的饲料或药物中的应用。
13.在一些实施例中，所述饲料或药物降低水产动物肝脏炎症的发生。
14.在一些实施例中，所述饲料或药物降低水产动物中肝脏脂肪的含量。
15.在一些实施例中，所述饲料或药物降低水产动物血清ast和alt活性。
16.在一些实施例中，所述饲料或药物抑制水产动物促炎症因子基因tnfα，并促进抑炎症因子基因tnfβ的表达。
17.在一些实施例中，所述饲料或药物抑制水产动物肝脏nfkb信号通路关键蛋白p65的磷酸化。
18.优选的，所述水产动物为大口黑鲈。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
20.在大口黑鲈商业膨化饲料中添加2％和3％的柠檬酸钠，可在8周内显著提高大口黑鲈的存活率，并促进体蛋白的沉积，且能够有效地降低肝损伤，同时，不同添加水平的柠檬酸钠都具有抗炎症的效应。
附图说明
21.图1为本技术对照组与实验组养殖8周后大口黑鲈的存活率对比图；
22.图2为本技术对照组与实验组中，大口黑鲈全鱼粗蛋白含量的对比图；
23.图3为本技术对照组与实验组中，大口黑鲈全鱼粗脂肪含量的对比图；
24.图4为本技术对照组与实验组中，大口黑鲈的肝脏泽及肝脏脂肪含量对比图；
25.图5为本技术对照组与实验组中，大口黑鲈的血清ast和alt活性对比图；
26.图6为本技术对照组与实验组中，大口黑鲈肝脏中促炎症因子基因tnfα和抑炎症因子基因tnf-β的相对表达量对比图；
27.图7为本技术对照组与实验组中，大口黑鲈肝脏中nfkb信号通路关键蛋白p65的磷酸化水平表达量对比图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例
30.四种大口黑鲈水产饲料的制备，分别为高脂低蛋白组，作为对照组；添加有0.5％的柠檬酸钠组，作为实验组1；添加有2％的柠檬酸钠组，作为实验组2；添加有3％的柠檬酸钠组，作为实验组3。分别按下列表1的配方进行制备。
31.表1大口黑鲈水产饲料的制备(单位：份)
[0032][0033]
实验设计方案如下：
[0034]
大口黑鲈初重(12
±
2.5)g；养殖56天；水温：26.5
±
1℃；
[0035]
饲料投喂量按照体重4％进行投喂。
[0036]
实验计算方法如下：
[0037]
存活率：根据公式终末数量/初始数量*100计算得出
[0038]
全鱼蛋白含量：利用凯式定氮法测定全鱼蛋白质含量。
[0039]
mda含量：通过使用商业mda含量检测试剂盒，利用硫代酸显法进行测定。
[0040]
体脂肪、肝脏脂肪含量测定：采用甲醇氯仿(1：2,v/v)抽提法进行测定。
[0041]
血清中天冬氨酸转氨酶ast活力测定：使用商业试剂盒进行测定，该酶可以将天冬氨酸的氨基转移到-酮戊二酸，产生草酰乙酸和谷氨酸，通过谷氨酸显来检测ast酶活力。
[0042]
血清中丙氨酸转氨酶alt活力测定：使用商业试剂盒进行测定，该酶可以将丙氨酸的氨基转移到-酮戊二酸，产生丙酮酸和谷氨酸，通过丙酮酸显来检测alt酶活力。
[0043]
肝脏tnf-α、tnf-β基因相对表达量测定：提取肝脏总mrna，用1％琼脂糖凝胶电泳验证总mrna的完整性。使用nanodrop2000 spectrophotometer(thermo,united states)测定rna浓度。使用反转录试剂盒(takara,japan)合成cdna模板，根据大口黑鲈tnf-α、tnf-β序列的保守区设计特异性引物，以β-actin作为内参基因。在cfx connect real-time system(bio-rad)的96孔板上进行rt-qpcr。反应体系(10μl，takara,japan)：super mix 5μl，cdna模板0.5μl，正、反向引物各0.5μl，ddh2o 3.5μl。pcr反应条件：95℃下预变性300s；
95℃下循环变性10s，60℃下退火复性15s，72℃下延伸15s，共进行40个循环。反应结束后用2
‑△△
ct
法计算基因的相对表达量。
[0044]
磷酸化p65蛋白的表达水平测定：肝脏组织经ripa裂解液(beyotime biotechnology,china)裂解后进行westernblot分析。首先，使用8％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离蛋白，然后将蛋白转移到nc膜上。膜在含有5％牛血清白蛋白的封闭溶液中孵育1小时。然后与加入一抗(目的蛋白p-p65(ser536)，affibiotech，af2006，1：800；内参α-tubulin，huabio，m1501-1，1：1000)，在4℃下孵育过夜。移出一抗并用tbst洗3次，每次10分钟。最后与辣根过氧化物酶(hrp)偶联二抗体孵育1小时；移出二抗并用tbst洗3次。western blot图像使用odyssey clx imager(licor,usa)获得。
[0045]
试验例
[0046]
对经过表1中对照组、实验组1-3中饲料饲喂的大口黑鲈进行8周的养殖实验。
[0047]
(1)统计对照组、实验组1、实验组2和实验组3中的大口黑鲈的存活率，结果如图1所示。
[0048]
从图1中可知，与对照组相比，2％柠檬酸钠显提高大口黑鲈的存活率，但添加0.5％和3％柠檬酸钠与对照组无显著性差别。
[0049]
(2)统计对照组、实验组1、实验组2和实验组3中大口黑鲈的全鱼粗蛋白含量，结果如图2所示。
[0050]
从图2中可知，与对照组相比，添加柠檬酸钠可以显著提高大口黑鲈全鱼粗蛋白含量，说明柠檬酸钠促进了鱼体蛋白的沉积。
[0051]
(3)统计对照组、实验组1、实验组2和实验组3中大口黑鲈全鱼粗脂肪含量，结果如图3所示。
[0052]
从图3中可知，与对照组相比，柠檬酸添加组对大口黑鲈全鱼粗脂肪含量没有显著影响。
[0053]
(4)统计对照组、实验组1、实验组2和实验组3中的大口黑鲈肝脏泽，结果如图4所示。
[0054]
从图4中可知，对照组大口黑鲈的肝脏呈米白，而添加柠檬酸钠后，肝脏的颜也由米白转变为鲜红，同时肝脏脂肪含量显著降低，提示肝脏脂肪的分解。
[0055]
(5)统计对照组、实验组1、实验组2和实验组3中大口黑鲈血清ast和alt活性，结果如图5所示。
[0056]
从图5中可知，相较于对照组，2％和3％柠檬酸钠添加组的血清ast和alt活性显著降低，提示肝损伤缓解。
[0057]
(6)统计对照组、实验组1、实验组2和实验组3中大口黑鲈肝脏促炎症因子基因tnfα和抑验证因子基因tnfβ的表达量，结果如图6所示。
[0058]
从图6中可知，相较于对照组，2％和3％柠檬酸添加组显著抑制促炎症因子基因tnfα，并促进抑验证因子基因tnfβ的表达，说明添加柠檬酸钠可以缓解肝脏炎症。
[0059]
(7)统计对照组、实验组1、实验组2和实验组3中大口黑鲈肝脏nfkb信号通路关键蛋白p65的磷酸化的表达水平，结果如图7所示.
[0060]
从图7中可知，相较于对照组，不同水平的柠檬酸钠添加均可以抑制大口黑鲈肝脏nfkb信号通路关键蛋白p65的磷酸化，2％和3％柠檬酸钠添加组磷酸化p65的蛋白表达显著
低于对照组，而1％添加组与对照组无显著差异，提示抑制了炎症通路关键蛋白的表达。
[0061]
因此，通过试验例1-7数据可以说明，在大口黑鲈商业膨化饲料中添加2％柠檬酸钠可在8周内显著提高存活率，2％或3％柠檬酸钠能够有效地降低肝脏脂肪和肝脏炎症，从而保证鱼类健康。同时，不同添加水平的柠檬酸钠都能够促进体蛋白的沉积，从而提高鱼肉品质。
[0062]
在本说明书的描述中，参考术语“第一”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0063]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：

1.柠檬酸钠在制备水产动物饲料中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述饲料增加水产动物中蛋白质的含量。3.一种水产动物饲料，其特征在于：包括基础饲料及作为饲料添加剂的柠檬酸钠。4.根据权利要求2所述的水产动物饲料，其特征在于：所述柠檬酸钠的添加量占所述水产动物饲料重量的2-3％。5.柠檬酸钠在制备预防或水产动物肝脏疾病的饲料或药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述饲料或药物降低水产动物肝脏炎症的发生。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述饲料或药物降低水产动物中肝脏脂肪的含量。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述饲料或药物降低水产动物血清ast和alt活性。9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述饲料或药物抑制水产动物促炎症因子基因tnfα，并促进抑炎证因子基因tnfβ的表达。10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述饲料或药物抑制水产动物肝脏nfkb信号通路关键蛋白p65的磷酸化。

技术总结

本发明公开了一种水产动物饲料及柠檬酸钠在制备水产动物饲料中的应用，涉及饲料技术领域。具体涉及柠檬酸钠在制备预防或水产动物肝脏疾病的饲料或药物中的应用。本发明在大口黑鲈商业膨化饲料中添加2％和3％的柠檬酸钠，可在8周内显著提高大口黑鲈的存活率，降低肝脏脂肪和减轻炎症，并促进体蛋白的沉积，最终实现促进鱼体健康、提高水产动物品质的作用。用。用。