棘孢木霉ZC3菌株及其在花椒枝条降解中的应用

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棘孢木霉zc3菌株及其在花椒枝条降解中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及棘孢木霉zc3菌株及其在花椒枝条降解中的应用。

背景技术：

2.花椒是我国传统的经济树种之一，芸香科花椒属(zanthoxy l.)，已有2600多年的种植历史(姚佳等，2010)。其果皮是我们日常食用的传统食品调味料，被誉为“八大调味品”之一，是麻香味物质的主要来源(李建红等，2009；李宏梁等，2014)，具有重要的经济价值(毕君等，2006；崔俊等，2008)。
3.据不完全统计，我国花椒种植面积为800万亩，产值超过50.5亿元。重庆市花椒种植规模约117万亩，主要品种以九叶青花椒(zanthoxylumarmatum v.novemfolius)为主，其中以江津区种植面积为最大。目前，江津区的九叶青花椒种植面积在53万亩左右，干椒总产量超过四万吨(卞浩等，2021)，较2002年的19.3万亩增加了近63.5％，随之而来的问题是青花椒采收剩余物激增。
4.青花椒采收剩余物指采收青花椒果实时从椒树上修剪下来的枝、叶和刺。据统计，重庆市江津区每年青花椒采收剩余废弃物可达3万吨。但目前由于技术水平、政策体制、花椒枝条资源分布不集中等问题使得大量的花椒枝条资源被焚烧或丢弃，导致资源浪费的同时造成了严重的环境污染(wenx.,2020；nguyenat.,2019；liut.,2020)。此外，当地农户每年将大量的青花椒采收剩余物堆放在椒园里或道路旁，可能会为病虫害滋生和火灾发生创造条件。
5.目前秸秆类物质的利用方式主要有：肥料化(堆肥还田、机械还田、过腹还田)、饲料化(青贮饲料)、基料化(生产食用菌)、燃料化(沼气、生物质碳)、原料化(工业化制造产品)等等。与其他利用方式相比，花椒枝条堆肥还田不仅可以补充椒园土壤流失的微量元素，并且可以改善椒园土壤质量、提高土壤肥力、改善土壤酸化情况。与此同时，堆肥化处理具有便捷、因地制宜、投入少等特点。
6.花椒枝条由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，其中木质素含量约为35％，纤维素和半纤维素含量分别为32％、18％。其中木质素具有网状结构，作为支撑骨架包围并加固着纤维素和半纤维素，与纤维素和半纤维素紧密结合，限制着纤维素的进一步利用(wangy x.,2013；许从峰等，2019；许莹等，2016)。木质素是以苯基丙烷为基本结构的高聚物，具有很牢固的分子内氢键，具有不规则的三维网状结构，通过共价键与半纤维素结合，而半纤维素与纤维素通过复合氢键结合，木质素与半纤维素相互交错着，呈现出复杂的、断断续续的层状结构，加上之间的醚键以及酷键的相互作用，从而影响了纤维素的水解，使得花椒枝条降解相对比较困难，更难以被有效利用。
7.目前自然界中木质素、纤维素的降解是由真菌、细菌及其相应微生物落共同完成的，相比于细菌，真菌—尤其是白腐真菌(phanerochaetc chrysosporium)具有最强的木质素降解能力，可将木质素彻底分解成co2和h2o，被认为是最有效的木质素降解微生物
(zhousime ng.，2015；takehitonakazawa.，2018)。然而，由于花椒属植物含有特殊的化学成分——主要有生物碱、酞胺、木脂素、香豆素、挥发油和脂肪酸，其它成分还有三菇、淄醇、烃类和黄酮酣类，其中花椒挥发油为花椒属植物的主要代谢产物——具有抑菌作用，使得花椒剩余废弃物的资源化利用被进一步限制。
8.研究表明，花椒挥发油对枯草杆菌、变形杆菌、金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、破伤风杆菌、荧光假单胞杆菌、痤疮丙酸杆菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、肺炎克雷伯菌、浓绿杆菌、侧孢芽孢杆菌等细菌具有抑制或致死作用，对真菌酿酒酵母、米曲霉、禾谷镰刀菌、黑曲霉、施瓦贝禾谷镰刀菌、叶点霉、尖孢镰刀菌、刺盘孢霉、米曲霉菌、白念珠菌、黑曲霉菌、酵母菌、假丝酵母、隐球菌等真菌有抑制或致死作用(脱聪聪等，2020；娄京荣等,2018；赵二劳等,2019；silvafernandabda.,2017)。王珊珊等(2017)通过研究发现乙醚、石油醚、甲醇、无水乙醇提取的花椒挥发油对细菌普遍具有抑菌性，而对霉菌的抑制效果不明显。脱聪聪等(2020)提取陇南大红袍花椒芳香油，发现它不仅对革兰氏阳性细菌即金黄葡萄球菌和破伤风杆菌有抑制性，而且对革兰氏阴性细菌即大肠杆菌和荧光假单胞杆菌有抑制性。
9.此外，花椒的香气成分也具有一定的抑菌作用。高逢敬等(2007)发现使用不同方法提取的花椒香气成分都能不同程度的抑制金黄葡萄球菌、热带假丝酵母、产肮假丝酵母、白地霉等的生长发育；竹叶椒片则对大肠杆菌有明显抑菌作用。丁雄等(2020)研究发现从，花椒中的芳樟醇成分对白念珠菌，耐药白念珠菌，大肠杆菌有较好的抑菌效果。
10.由于花椒枝条复杂的结构及其含有的特殊化学物质，目前花椒采收剩余物微生物降解方面鲜有报道，基于此，亟需筛选出一种对花椒枝条具针对性的具有良好降解能力的菌株，以期改善青花椒产业链中采收剩余物处理难、分解难、易造成污染的现状。

技术实现要素：

11.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种棘孢木霉zc3菌株及其在花椒枝条降解中的应用。
12.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
13.1、棘孢木霉zc3菌株，其分类命名为棘孢木霉(trichoderma asperellum)zc3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.40236，保藏日期为2022年7月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
14.优选的，棘孢木霉zc3菌株的its序列如seq id no.1所示。
15.gggggggctgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcggggtcacgccccgggtgcgtcgcagccccggaaccaggcgcccgccggaggaaccaaccaaactctttctgtagtcccctcgcggacgtatttctttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccgggggatcggcgttggggatcgggacccctcacacgggtgccggcccctaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtccacgtccgtaaaacacccaactttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcaa，如seq id no.1所示。
16.2、棘孢木霉zc3菌株在木质素、纤维素或半纤维素降解中的应用。
17.3、棘孢木霉zc3菌株在花椒枝条降解中的应用。
18.4、一种微生物菌剂，它的有效成分为前述的棘孢木霉zc3菌株，其质量含量为5～10％。
19.本发明的有益效果在于：
20.本发明重庆市江津区田间自然腐熟的花椒枝条中筛选分离获得一株棘孢木霉新菌株，即棘孢木霉(trichoderma asperellum)zc3。该菌株的生长速度快，菌落形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，接近中央的分生孢子暗绿，边缘的分生孢子刚形成为白，缺少气生菌丝。分生孢子梗形成垫状至半球形丛束，散布在整个菌落或聚集成2～3个同心圆环，暗绿。菌落背面不变。分生孢子梗细长、弯曲，次级分枝对生。分生孢子球形、近球形，壁有细刺；培养3d，菌落直径5.2cm，培养4d，菌落直径能达6.3cm，具有较强的降解能力，在液体滤纸条培养基中，28℃培养7天，滤纸条完全崩解；在花椒枝条粉固体培养基中，28℃培养40天，其对花椒枝条木质素降解率达到78.11％，纤维素、半纤维素降解率分别达到82.58％、75.84％，扫描电镜下可见花椒枝条出现明显的纤维断裂、结构崩解现象，表现出较高的降解能力。此外，木质素降解菌zc3对花椒枝条浸提液有良好耐受性。
附图说明
21.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
22.图1为zc3菌株愈创木酚、苯胺蓝平板显反应；
23.图2为zc3菌株的纤维素、木质素酶活图，其中，a为纤维素酶活，b为木质素酶活；
24.图3为zc3菌株系统发育树；
25.图4为zc3菌株处理前后的花椒枝条电镜结构图，其中，a为ck未接菌处理，b为zc3菌株处理。
26.图5为葡萄糖标准曲线。
27.生物保藏信息
28.分类命名：棘孢木霉(trichoderma asperellum)zc3；
29.保藏编号：cgmcc no.40236；
30.保藏时间：2022年7月1日；
31.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
32.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
33.下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
34.实施例1
35.zc3菌株的分离鉴定
36.(1)供试材料
37.采集重庆市江津区田间自然腐熟花椒枝条，选择腐熟程度高，颜黑棕，表面带有菌斑，质地潮湿柔软且没有刺鼻气味的完全腐熟枝条，至于密封袋内，于实验室4℃冰箱
保存。
38.(2)培养基
39.富集培养基：200g马铃薯提取液，葡萄糖20g，链霉素0.33g，蒸馏水1000ml，ph自然。
40.木质素选择培养基：碱性木质素2g，硫酸铵1.33g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钠0.2g，链霉素0.33g，琼脂20g，20％花椒枝条浸提液(将花椒枝条用清水冲洗干净后65℃烘干12h，剪成2-3cm小段，以花椒枝条200g：水1000g煮沸后转60-80℃浸提20min，后转移至摇床120r/min浸提48h)，加蒸馏水定容至1000ml(参照郭晓威等，2017；王晶等，2020)。
41.gu-pda培养基：200g马铃薯提取液，琼脂20g，用6g花椒枝条粉代替葡萄糖，愈创木酚0.4m，加水定容到1l，121℃灭菌3min，用于定性测定菌株的产漆酶/过氧化物酶能力(如图1上半部分所示)。
42.ab-pda培养基：200g马铃薯提取液，琼脂20g，用6g花椒枝条粉代替葡萄糖，苯胺蓝0.1g，加水定容到1l。
43.pda培养基：200g马铃薯提取液，葡萄糖20g，琼脂20g(液体培养基不加琼脂，半固体培养基加琼脂8g/l)。
44.(3)zc3菌株的分离、纯化
45.称取10g腐熟花椒枝条样品于90ml富集培养基中，28℃、120r/min培养48h，选择稀释梯度为10-1
、10-3
、10-5
、10-7
和10-9
，分别取100μl涂于木质素选择培养基上，28℃培养48h。挑取有明显真菌形态的菌株于gu-pda、ab-pda培养基上，挑选显圈、变圈明显的菌株于pda培养基反复纯化，直至纯培养后制成甘油菌液，-80℃保存菌种。具体见图1，上半部分是愈创木酚显，下半部分是苯胺蓝显。
46.将以上挑选的菌株命名zc3，并于2022年7月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为c gmcc no.40236，分类命名为棘孢木霉(trichoderma asperellum)zc3。
47.实施例2
48.zc3菌株的鉴定
49.1)形态学鉴定
50.将保藏的菌株zc3经pda培养基活化后，观察其菌落形态特征；然后使用插片法培养，置于显微镜下观察其形态结构。
51.zc3菌株形态如图1所示，菌落形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，接近中央的分生孢子暗绿，边缘的分生孢子刚形成为白，缺少气生菌丝。分生孢子梗形成垫状至半球形丛束，散布在整个菌落或聚集成2～3个同心圆环，暗绿。菌落背面不变。分生孢子梗细长、弯曲，次级分枝对生。分生孢子球形、近球形，壁有细刺。培养3d，菌落直径5.2cm，培养4d，菌落直径6.3cm。
52.2)生理生化鉴定
53.a.纤维素酶活测定：
54.①
种子培养基：蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph 7.0。
acid)，abt s)底物氧化所需的酶量。mnp活力单位的定义(u)：在波长465nm下，每分钟将1μmol愈创木酚氧化所需的酶量。lip活力单位的定义(u)：在波长651nm下，每1ml反应体系中每分钟吸光度值变化0.01为一个酶活单位。
68.木质素酶活结果如图2中b所示。
69.数据分析：采用软件spss 22.0计算平均值和标准差，并分析各个处理之间的差异显著性。
70.3)真菌its分子生物学鉴定
71.将纯化好的菌株接种于100ml pda液体培养基上，过夜培养。漏斗过滤并吸干残留的培养液，转移至研钵后快速加入液氮将组织研磨成粉末状，立即将研磨后的粉末转移到1.5ml的eppendorf管中。加入2倍体积预热的质量浓度2％ctab(含有质量浓度0.1％β-巯基乙醇》充分混匀，65℃温浴30-45min，每15min混匀一次。冷却至室温，10000rmp离心10min，取上清转移至另一干净的1.5ml的eppendorf管中。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(所含tris酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1)抽提。10000rmp离心10min，取上清液转转移至另一于净的1.5ml的eppendorf管中。等体积氯仿-异戊醇混合液(所含氯仿、异戊醇的体积比为24:1)再抽提一次，颠倒混匀10min，10000rmp离心10min，取上清液转至另一于净1.5ml的eppendorf管中。加入0.6-0.7倍体积预冷的异丙醇沉淀d na，颠倒混匀，-20℃放置过夜。10000rmp离心10min，弃上清。沉淀用体积百分数75％的乙醇水溶液洗涤脱盐，无水乙醇洗涤脱水，置于37℃温箱中干燥10min。加入50μl ddh2o溶液溶解dna。
72.its序列是位于idna编码基因18s，5.8s，28s之间的小基因片断，真核生物细胞中的its序列保守，不受所处环境条件的变化的影响。因此，采用通用引物分析真核生物细胞中的its碱基序列与其他微生物种之间its序列的同源性，可以分析它们的亲缘关系的距离和系统发育地位。
73.its通用引物为：
74.its1：5'ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3，如seq id no.2所示；
75.its4：5'tcctcc gcttattgatatgc-3'，如seq id no.3所示。
76.pcr扩增程序为：94℃预变性5min后：开始循环94℃变性30s，52℃退火60s，72℃延伸2min，共30个循环，72℃延伸10min。取2μl反应液进行质量百分数1％琼脂糖电泳检测，pcr扩增产物送至上海美吉生物工程有限公司进行测序，将序列输入genbank进行序列同源性比较分析。
77.4)its序列系统发育树的构建
78.从genbank基因数据库中分别下载与降解菌株zc3的序列序列相似性大于97％的菌株的its序列。通过clustalx进行聚类分析后，利用mega4.1软件生成系统发育进化树。结果如图3所示。
79.实施例3
80.zc3菌株对花椒枝条粉降解能力的测定
81.液体培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉5g，kh2po
4 1g，mgso4·
7h2o 0.5g，znso4·
7h2o 50mg，加水定容到1l，ph自然，分装至250ml锥形瓶中，每瓶倒入液体培养基100ml，121℃灭菌30min后，加入维生素b1 40μl。
82.花椒枝条固体培养基：将花椒枝条于60℃烘干至恒重后粉碎，过40目筛，按照花椒
枝条:水＝1:2.5的比例(质量比)加入到培养皿中，121℃灭菌30min。
83.以种子发酵液体积：花椒枝条质量＝1ml:1g的比例将种子发酵液接种到花椒枝条固体培养基中，28℃培养40d，每隔10d取样(外加第5d取样)，40d后将样品取出，于60℃烘干至恒重，装入自封袋中备用。用扫描电镜观察样本的降解情况，如图4所示，其中，a为ck未接菌处理，图2为zc3菌株处理后。
84.并测定花椒枝条固体培养基中发酵40d后的花椒枝条木质素、纤维素、半纤维素含量，如表1-3所示。(注：ck1为2代白腐菌ndm3-2，购自北京生物保藏中心；ck2为复合秸秆腐熟剂，购自仲禧生物科技有限公司，下同)
85.表1 zc3处理花椒枝条40天木质素降解率
[0086][0087]
表2 zc3处理花椒枝条40天纤维素降解率
[0088][0089]
表3 zc3处理花椒枝条40天半纤维素降解率
[0090][0091]
由表1-3可知，本发明的棘孢木霉zc3菌株在花椒枝条木质素降解、纤维素降解、半纤维素降解方面具有明显优势。
[0092]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.棘孢木霉zc3菌株，其特征在于，其分类命名为棘孢木霉(trichoderma asperellum)zc3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.40236，保藏日期为2022年7月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。2.根据权利要求1所述的棘孢木霉zc3菌株，其特征在于，棘孢木霉zc3菌株的its序列如seq id no.1所示。gggggggctgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcggggtcacgccccgggtgcgtcgcagccccggaaccaggcgcccgccggaggaaccaaccaaactctttctgtagtcccctcgcggacgtatttctttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccgggggatcggcgttggggatcgggacccctcacacgggtgccggcccctaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtccacgtccgtaaaacacccaactttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcaa，如seq id no.1所示。3.权利要求1或2所述棘孢木霉zc3菌株在木质素、纤维素或半纤维素降解中的应用。4.权利要求1或2所述棘孢木霉zc3菌株在花椒枝条降解中的应用。5.一种微生物菌剂，其特征在于，它的有效成分为权利要求1或2所述的棘孢木霉zc3菌株，其质量含量为5～10％。

技术总结

本发明公开了棘孢木霉ZC3及其在花椒枝条降解中的应用，该菌株的生长速度快，具有较强的降解能力，在液体滤纸条培养基中，28℃培养7天，滤纸条完全崩解；在花椒枝条粉固体培养基中，28℃培养40天，其对花椒枝条木质素降解率达到78.11％，纤维素、半纤维素降解率分别达到82.58％、75.84％，扫描电镜下可见花椒枝条出现明显的纤维断裂、结构崩解现象，表现出较高的降解能力。此外，木质素降解菌ZC3对花椒枝条浸提液有良好耐受性。浸提液有良好耐受性。浸提液有良好耐受性。