芦可替尼在制备CAR-T药物中的应用的制作方法

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芦可替尼在制备car-t药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及芦可替尼的用途，尤其涉及芦可替尼在制备car-t药物中的应用。

背景技术：

2.靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞(car-t)在血液瘤，尤其是复发难治的b细胞急性白血病(r/r b-all)方面已经取得了非常好的疗效。在car-t过程中，细胞因子的释放被认为是car-t细胞起效的标志，但是当它们过度释放即会造成细胞因子释放综合征(crs)。
3.crs发生在car-t细胞回输到人体后，在car-t细胞在激活和扩增过程中，会释放大量细胞因子，激活整个人体免疫系统，引起il-6、il-1、il-2、tnf等细胞因子的联级释放，过度的免疫反应会使患者出现发热、低血压、呼吸困难等临床症状，严重时，会导致患者昏迷、神志不清、身体组织和器官损伤甚至死亡。这给car-t的带来了较大的难以预测的风险。
4.为了应对crs的发生，临床上常常使用il-6受体的抗体tocilizumab和糖皮质激素类药物作为其应对方案。tocilizumab是首款靶向il-6r的人源化单抗，而il-6作为crs中一个关键的细胞因子，其il-6r的抑制会抑制il-6的作用通路，尤其是sil-6r的抑制，会大幅度减少il-6细胞因子的功能，从而降低crs的程度。但tocilizumab在中也有呼吸道感染、全身性疾病及给药部位反应的外周水肿、超敏反应的副作用，且有相关报导其对car-t的疗效有一定的抑制作用。而对于糖皮质激素类药物，如地塞米松、可的松、倍它米松等作为人体糖原的控制因子，其可以作用整个免疫系统，抑制免疫系统的活性，减少糖原的消耗，但其作用远不止免疫系统，对整个人体的器官和组织，均有明显的作用，会明显降低car-t的抗肿瘤效果，顾其副作用也较为严重。
5.近期，临床上也发现使用芦可替尼ruxolitinib可以显著降低car-t细胞引起的crs而对其疗效和功能没有影响，而其作用机理并没有进行研究，对car-t细胞确切的作用仍然不是很明确。芦可替尼ruxolitinib为jak1/2的抑制物，而jak(janus tyrosine kinase)-stat(signal transducer and activator of transcription)通路，作为免疫系统中的关键通路，控制着大量多种细胞因子的释放及作用，ifn及白介素家族都是通过这一通路发挥作用。这一通路的抑制剂如，jak1/2抑制剂芦可替尼，jak3抑制剂tofacitinib等对于crs的控制应能在更多方面更多因子的控制，更符合crs的控制的要求，但其对car-t的疗效的影响还没有被研究过。

技术实现要素：

6.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明要解决的技术问题是提供芦可替尼在制备car-t药物中的应用。
7.本发明采用如下技术方案：
8.芦可替尼在制备car-t药物中的应用。进一步地，使用芦可替尼处理car-t细胞后，在细胞分化状态，car-t细胞亚型向适中状态富集，能提升car-t细胞增值能力并增强特异性杀伤能力。
9.本发明在细胞水平研究了芦可替尼对car-t细胞的功能和疗效的相关性，其结果为临床医生提供了正确使用芦可替尼的机制和基础。
10.在没有暴露于相应靶细胞的情况下，car-t细胞在培养体系中，其生长受到了明显的抑制，其生长似乎被暂停了，但是其活率及活性没有改变，为了进一步研究car-t细胞在这个过程中发生的变化，我们对car-t细胞的各类亚型的表达情况进行了检测。在实验中，在细胞分化状态，car-t细胞亚型既没有往更年轻的亚型分化，也没有往分化末期的状态分化，而是往更适中的状态富集。
11.芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞的扩增能力有较强的抑制作用，这个抑制作用与芦可替尼剂量与作用时间有明确的相关性，而对cd19-targeted car-t细胞的细胞活率没有影响。这也说明，芦可替尼在体内可以降低car-t细胞的扩增，减缓其扩增的速度，而不会损伤car-t细胞本身，让car-t细胞保持着活性。
12.而芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞亚型分化的影响，就较为有趣，在car-t细胞生长能力受到抑制的情况下，car-t的分化状态从分化较为晚期的teff方向往tcm及tem状态分化，而treg细胞的亚型也随着芦可替尼的剂量的提高及时间的延长而降低，其耗竭相关的marker也符合这一趋势。芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞不仅仅是暂停其生长，同时对car-t细胞的状态进行了调整，降低其耗竭的程度，减少treg细胞的数量。
13.芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞杀伤功能有明显的降低作用，同时其细胞因子的分泌能力也显著降低，特别是jak/stat相关通路的细胞因子，其分泌均受到明显的抑制，这显示了其在临床中对crs的控制作用。
14.将药物移除后，芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞的杀伤能力的抑制作用很快移除，但对于其细胞因子的释放在第三天仍有抑制作用，细胞的亚型得到了一定程度的恢复。
15.在细胞分化状态，car-t细胞亚型既没有往更年轻的亚型分化，也没有往分化末期的状态分化，而是往更适中的状态富集，细胞的亚型得到了一定程度的恢复，这是芦可替尼对car-t细胞的功能和疗效所新发现的性质，并且产生了预料不到的技术效果。该预料不到的技术效果，能够使芦可替尼应用于car-t药物的制备中，降低病人的死亡率，提高病人的生存质量。
16.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
17.图1是芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞扩增实验中，使用不同浓度进行car-t细胞的培养，使用流式细胞仪检测其细胞亚型(图1a)、treg细胞(图1b)、耗竭marker ctla4、lag3、pd.1、tim3的变化情况(图1c)示意图；
18.图2是芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞亚型分化的影响示意图，表明芦可替尼对car-t细胞的影响是剂量依赖的，其中，图2a为car-t细胞质粒设计示意图，收集不同浓
度芦可替尼处理的细胞，流式细胞术检测细胞亚型分化(tscm/tcm/tem/teff)(图2b)和treg细胞亚的比例(图2c)以及耗竭标志物(ctla4、lag3、pd-1、tim3)的表达量(图2d)示意图；
19.图3是慢病毒载体结构设计psb1244质粒图谱；
20.图4是慢病毒载体结构设计psb2159质粒图谱；
21.图5是慢病毒载体结构设计pcr程序设置示意图；
22.图6是重组慢病毒载体psb1576质粒图谱；
23.图7是载体重组示意图；
24.图8是pcr扩增步骤的pcr鉴定程序设置示意图。
具体实施方式
25.为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
26.须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
27.实施例1：
28.实验步骤：
29.1、选择细胞系
30.使用表达cd19抗原且带抗性的慢病毒转导k562细胞，用一定浓度的嘌呤霉素，进行筛选，进行单克隆实验，最后使用apc-conjugated cd19单克隆抗体，流式检测得到k562-cd19稳转株的靶细胞。白血病细胞系k562(阴性对照)和raji从美国组织细胞收藏中心购买，这三种靶细胞使用含有10％牛胚胎血清的1640培养基进行培养。
31.2、构建慢病毒
32.慢病毒编码的二代car结构包含anti-cd19-scfv，cd8α分子的铰链和跨膜区，4-1bb共刺激分子和cd3ζ信号域。cd19-scfv序列(fmc63)由北京擎科新业生物技术有限公司合成。用hek293t细胞瞬时转染包装复制缺陷慢病毒。
33.3、car-t细胞的分离分选
34.收集健康志愿者的外周血，用人单核细胞分离培养基进行培养，采用梯度离心法分得出外周血单个细胞核(pbmcs)。然后用cd4和cd8的磁珠阳性分选得t细胞。
35.t细胞采用anti-cd3/cd28单克隆抗体激活，激活18-24小时后用生产好的慢病毒进行转导，细胞在含有1,000iu/ml recombinant human interleukin-2和5％fbs的aim-v培养基中进行培养。细胞扩增至一定量时进行分组，根据实验方案，将细胞分别在含不同浓度的芦可替尼培养基中处理car-t细胞，对其进行培养，每天进行计数补液。
36.4、细胞增殖
37.使用the cell tracetm cfse细胞增殖试剂盒按照说明书进行细胞增殖检测。效应细胞使用2.5μm cfse进行标记，k562-cd19靶细胞使用丝裂霉素进行预处理，然后两者以
效靶比5：1在24孔板进行共孵育，体系为500μl的aim-v培养基补充以4％fbs。共孵育后的3-5天使用流式细胞仪检测cfse染料的浓度。数据使用flowjo v10软件进行分析。
38.5、流式检测
39.所有的检测样本使用pbs离心洗涤两遍，然后加入相应抗体按照说明书的指示进行孵育，最后在流式细胞仪(thermo fisher)上机检测。t细胞亚使用fitc-conjugated anti-cd223(lag-3)单克隆抗体，pe-conjugated mouse anti-human tim-3(cd366)抗体，pe-cyanine7-conjugated cd152(ctla-4)单克隆抗体，percp/cyanine5.5-conjugated anti-human cd279(pd-1)抗体,pe-cyanine7-conjugated anti-cd127单克隆抗体,percp/cyanine5.5-conjugated anti-human cd45ra抗体,fitc-conjugated anti-human cd25抗体,以及pe-conjugated anti-human cd197(ccr7)抗体等抗体进行检测。
40.在没有暴露于相应靶细胞的情况下，car-t细胞在培养体系中，其生长受到了明显的抑制，但是其活率及活性没有改变，为了进一步研究car-t细胞在这个过程中发生的变化，我们对car-t细胞的各类亚型的表达情况进行了检测。图1与图2表示，芦可替尼对car-t细胞的影响是剂量依赖的，其中图2a中car序列使用抗cd19抗体fmc63的vl和vh构建scfv,cd8α作为铰区和跨膜区，胞内为4-1bb共刺激域和cd3z信号域。由于人不同个体的细胞亚型有很大的不同，所以图1与图2的实验选取不同人的数据进行检测分析。如图1a、图2b所示，在细胞分化状态，car-t细胞亚型既没有往更年轻的亚型分化，也没有往分化末期的状态分化，而是往更适中的状态富集，这个阶段的car-t细胞增值能力更强且具有一定的特异性杀伤能力。在treg的检测中，如图1b、图2c所示，随着时间和剂量的增加，其treg细胞明显降低。而在细胞耗竭相关marker的检测中，如图1c、图2d所示，随着时间及剂量的增加，细胞的耗竭相关marker表达在逐渐降低。因此，芦可替尼添加到car-t细胞中后，虽然car-t细胞的增殖受到了影响，但其耗竭状态降低，同时调节性细胞的占比减少，tcm及tem细胞的占比提高。
41.实施例2：
42.第一步，慢病毒载体结构的设计和生产
43.实验仪器如下：
[0044][0045]
表1
[0046]
实验试剂如下：
[0047][0048]
表2
[0049]
实验耗材如下：
[0050][0051][0052]
表3
[0053]
实验方法：
[0054]
(1)合成、扩增基因片段cd19-scfv：
[0055]
构建载体框架。将构建成的表达cd19-scfv的质粒命名为psb1576。骨架部分的载体由上海优卡迪提供。骨架质粒命名为psb1244。如图3所示，cd19-scfv片段上下游分别含clai和sali的酶切位点,酶切后，-80℃冻存备用。
[0056]
pcr扩增基因片段ef1α启动子及cd19-scfv，如图4所示。ef1α启动子从载体pse2159上获取，载体pse2159由上海优卡迪提供。为扩增ef1α启动子序列，使用primer premier 6软件设计一对引物，如下表所示。引物合成由生工完成。
[0057]
f1:5
’‑
ttcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3’r1:5
’‑
catggtggcggatcctcacgacacctgaaatggaag-3’[0058]
表4 ef1α启动子序列扩增引物表
[0059]
cd19-scfv序列(fmc63)由北京擎科新业生物技术有限公司合成。为扩增cd19-scfv序列，使用primer premier 6软件设计一对引物如下表所示。引物合成由生工完成。
[0060]
f2:5
’‑
ggatccgccaccatggc-3’r2:5
’‑
aggttgattgtcgacttagcgagggggcaggg-3’[0061]
表5 cd19-scfv序列扩增引物表
[0062]
将psb1244质粒及合成后的片段进行pcr扩增，使用下表所示的扩增体系将各组分加入pcr管中，使用如图5所示的程序设置pcr仪器，进行pcr扩增。
[0063][0064][0065]
表6 pcr扩增体系
[0066]
以ef1α为模板，pcr扩增得到大小为1210bp的产物a，即ef1α启动子；以cd19-scfv为模板，pcr扩增得到大小约1488bp的产物b，即cd19-scfv。
[0067]
pcr产物ef1α启动子及cd19-scfv琼脂糖凝胶电泳。配制凝胶液：称取琼脂糖0.5g置于锥形瓶中，然后加入1
×
tae溶液50ml，置于微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖全部融化后
摇匀，即配成1.0％琼脂糖凝胶液。冷却到55℃～60℃左右，加入适量溴化乙锭(eb)混匀，之后倒入凝胶板中，待凝胶完全凝固后，然后将凝胶放入电泳槽中，向其中加入适量1
×
tae电泳缓冲液。
[0068]
将5μl pcr产物与1μl 6
×
loading buffer上样缓冲液混匀，然后轻轻加入加样孔中，加入5μl dna marker与1μl 6
×
loading buffer上样缓冲液混合物作为参照物。加样完毕后，电压调至恒压120v，电流0.1ma。电泳40min左右。电泳结束后，使用凝胶成像系统进行拍照。
[0069]
ef1α启动子及cd19-scfv基因片段的胶回收。根据dna marker判断目的条带的位置，将目的片段使用刀片切下，至于ep管中。根据凝胶的量，加入3倍体积剂量的buffer gm，混匀，然后加入50℃～55℃水浴箱5～10分钟，期间不断摇晃ep管。
[0070]
把融化所得的溶液加入吸附柱内，然后放入收集管中，12000rpm，离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；在吸附柱中加入600μl buffer wb，然后12000rpm离心30秒，再次把收集管内废液倒掉；在吸附柱中加入600μl buffer wb，然后12000rpm离心30秒，再次把收集管内废液倒掉；不加任何试剂，将吸附柱再次放入离心机内离心12000rpm，离心60秒；把吸附柱放入一个新的干净的离心管内，在膜的中心正上方悬空滴加已预热的60℃的灭菌纯水30μl,室温静置2分钟；室温下12000rpm，离心1分钟，离心管中获得即为pcr产物ef1α启动子a片段及cd19-scfv基因b片段，分装，-20℃冰箱中冻存。
[0071]
psb1244骨架载体双酶切。将psb1244 1μg加入到ep管中，加入2μl custmart缓冲液及1μl clai和sali酶，使用水补充到20μl体系。置于恒温水浴锅中，设置温度为37℃，进行酶切反应，4小时后使用上文的条件进行琼脂糖凝胶电泳跑胶，收集5828bp大小的条带，进行使用上文的条件进行胶回收，获得的片段为v1。
[0072]
(2)重组慢病毒载体psb1576构建：
[0073]
采用“一步法定向克隆”(无缝试剂盒)将目的基因导入表达载体，如图6所示。
[0074]
基于上述实验基础上，进一步将所获得基因片段psb1244载体骨架片段v1、ef1α启动子基因片段a和cd19-scfv基因片段b重组连接。使用sunbio无缝组装试剂盒，将目的dna片段和线性化载体以摩尔比2:1加到试管中进行重组反应。具体反应体系如下：
[0075]
试剂阳性对照(μl)自连对照(μl)连接组(μl)基因片段a222基因片段b222线性载体v1111无缝克隆反应液15015final volume2020to 20
[0076]
表7无缝克隆反应体系
[0077]
按照上述反应体系配置，将混合物混匀，在42℃水浴30分钟，然后从水浴中转移到冰上。2分钟后取10μl混合物转化到感受态细胞中。载体重组示意图如图7所示。
[0078]
转化，在进行重组连接载体过程中，从-80℃冰箱取出100μl感受态细胞dh5a，取10μl连接物加入dh5a中，震荡混匀，将ep管放于冰上，冰浴30分钟；然后将ep管放于42℃水浴中热休克，90秒，然后再迅速冰浴5分钟；将dh5a转移到1.5ml离心管中，加入600μl无抗生素的lb培养基，置于37℃恒温的水平摇床中，185rpm/min摇菌1h；取培养液200μl涂抹在具有
amp(+)的lb平板上，倒置放入37℃培养箱过夜；第二天，取出lb平板，观察菌落生长情况。
[0079]
连接产物扩增，取5ml离心管，加入3ml amp(+)lb培养基，取出上述培养平板，观察菌落，用头挑取8个单克隆菌落置于离心管中，将试管置于37℃水平摇床，200rpm/min过夜，分别从每个试管中取出菌液1μl用作pcr菌落鉴定。
[0080]
菌落pcr鉴定，为验证所构建的psb1576中各个片段是否连接正确，设计合成引物，使引物跨过连接点。若所取菌落经过pcr所扩增获得的产物与预计的基因片段相吻合，那么就说明其连接方向是正确的，构建是成功的。
[0081]
pcr扩增：使用primer premier 6软件设计引物，引物合成由生工完成。引物序列如下：
[0082]
f:5
’‑
gccagcttggcacttgatgt-3’r:5
’‑
gggtgataaccagtgacagga-3’[0083]
表8 pcr鉴定引物表
[0084]
将菌液直接进行pcr扩增，使用如下表所示的扩增体系将各组分加入pcr管中，使用如图8所示的程序设置pcr仪器，进行pcr扩增。
[0085]
试剂体积(μl)h2o13.710
×
buffer(with mg
2+
)2dntp各2.5mm1.6primer id(+)(10μm)0.8primer id(－)(10μm)0.8template1taq酶0.1final volume20
[0086]
表9 pcr鉴定扩增体系
[0087]
扩增后，制备凝胶进行凝胶电泳，之后使用凝胶成像仪进行拍照，根据dna marker选择与预期符合的条带1121bp的菌落进行扩增。
[0088]
摇菌扩增连接产物，将菌落pcr鉴定正确的菌液700μl，加入50％的甘油300μl，混匀后，于-80℃冰箱中冻存备用。剩余菌液用于质粒提取。
[0089]
质粒小提、dna测序，为进一步验证筛选的阳性克隆所含dna片段是所需目的基因，先使用小提试剂盒小提质粒，并外送公司对其进行dna测序。
[0090]
按照说明书进行操作，具体操作步骤如下：
[0091]
将剩余菌液置于ep管中，室温，10,000g，1min进行离心，弃去上清，加入rnase a的buffer s1液250μl，旋涡振荡混匀，向管中加入buffer s2液250μl，轻柔混匀，直至ep管中的溶液变得澄亮透明；
[0092]
加入buffer s3液350μl，混匀，室温静置5min，室温，13800g，10min离心，吸取上清，加入制备管中，再次离心，室温，13800g，1min；
[0093]
将离心管中的废液丢弃，加入buffer w1液500μl，再次离心，室温，13,800g，1min；丢弃掉离心管中废液，加入buffer w2液600μl，再次离心，室温，13,800g，1min；去掉离心管中的废液，再次离心，室温，13,800g，1min；
[0094]
转入ep管中，在超净工作台中，通风，晾干15min，加入50μl洗脱液，在超净台中，静置5min，再离心，室温，13,800g，1min，之后置于-20℃保存，测定核酸浓度。将质粒寄送进行dna测序鉴定。
[0095]
目的质粒中抽，经菌落pcr和小提质粒dna测序结果证实，psb1576构建成功。现使用mn公司nucleobond xtra中抽质粒试剂盒进行质粒中提。提前将含有psb1576载体的甘油菌从-80℃冰箱取出。将甘油菌接种于amp(+)液体lb培养基中，放入摇床培养，240rmp，37℃，12-16h。按照说明书操作，具体步骤如下：
[0096]
取干净的50ml离心管，将培养的菌液加入其中，8000rpm，室温，离心5分钟，将上清液丢弃，再重复2次。向其中加入8ml res试剂(含rnase a)，使用漩涡振荡器，充分混匀，加入lys(紫)试剂8ml，上下颠倒充分混匀，使菌体充分裂解，室温放置3分钟，观察溶液由浑浊变清亮粘稠。加入预冷的neu 8ml，混匀，此时可见管内清亮液体出现蛋白质，冰浴，5分钟。
[0097]
取锥形瓶，将discard nucleobond xtra midi架于锥形瓶上，取equ 12ml均匀湿润筛选柱白边框，equ流干后，将静置的离心管中的液体全部倒入discard nucleobond xtra column filter白筛选柱中，有大块状物时，将其打碎。待筛选柱中的液体自然流干后，再加入equ 5ml冲洗筛选柱。等筛选柱中equ自然流干后，取出筛选柱，取8ml wash加入吸附膜中间，同时将elu放入水浴锅，55℃，预热。
[0098]
将nucleobond xtra column塑料管架在50ml离心管上，取5ml elu洗脱液加入吸附膜中，进行洗脱反应。待elu自然滴尽后，取走column塑料管，向离心管中加入异丙醇3.5ml，静置-20℃冰箱，20分钟。然后取出，放入离心机，12000rpm，离心10分钟，弃上清。
[0099]
使用移液器将离心管底质粒沉淀，转移至2ml离心管中，然后加入70％乙醇500μl，12000rpm 5分钟，弃上清，再重复一次，弃上清，控干。加入适量的elution buffer进行溶解。4℃冰箱中过夜后，再充分混匀，测浓度。-20℃冰箱保存，备用。
[0100]
辅助质粒抽提，从-80℃冰箱中分别拿出冻存的ppac-gp、ppac-r和penv-g菌液37℃融化。然后分别加入含有amp的lb液体培养基中，编号标记，放进水平摇床培养(240rmp)，37℃，过夜，培养12h；
[0101]
质粒中提，具体步骤同前。
[0102]
第二步，慢病毒载体的包装及浓缩纯化
[0103]
实验仪器如下表：
[0104]
名称厂商型号恒温培养箱上海精宏gnp-9050冷冻高速离心机thermocl17r漩涡混合器其林贝尔ql-886浓度测定仪thermonanodrop 2000c漩涡混匀器鲎试剂mx-f超速离心机beckman coulteroptima xpn蠕动泵masterflax77921-85
[0105]
表10
[0106]
实验试剂如下表：
[0107]
名称厂商货号293t细胞atcccrl-3216dmemgibcoc11995500bt胎牛血清bi1906287pbscorning21-040-cvc台盼蓝bi03-102-1b胰酶gibco12563029hbsteknovah1705-96cacl2teknovac0478目的质粒plve1576上海优卡迪na包装质粒penv-g上海优卡迪na包装质粒ppac-gp上海优卡迪na包装质粒ppac-r上海优卡迪na全能核酸酶上海近岸gmp1707无内毒素检查用水鲎试剂trw5001m naohsigma71463-1l消毒酒精欧洁nahbssgibco14175-095
[0108]
表11
[0109]
实验耗材如下表：
[0110][0111][0112]
表12
[0113]
实验步骤如下：
[0114]
(1)病毒包装
[0115]
293t细胞准备。转染前一天，按照上述步骤，复苏、培养293t细胞，显微镜下观察培养皿中的293t细胞状态。选择状态良好的细胞进行消化、计数、调整细胞浓度、转至细胞培养皿(10cm)中、铺板、培养等环节(详细步骤同前)，共10个10cm培养皿，每皿1
×
107细胞。
[0116]
转染293t包装细胞。第2天，镜下观察细胞，融合度在40％左右，分布比较均匀。在转染前1小时将培养皿取出，换掉原有的细胞培养基，重新加入9ml的opti-mem培养基，换液完毕后再将培养皿放回培养箱。取15ml离心管，依次加入cacl2、质粒和hbs，每瓶对应加入250μl cacl2，44μg质粒(目的质粒、ppac-gp质粒、ppac-r质粒和penv-g质粒配比为20：10：
8：6)，边涡旋振荡边加入500μl hbs，全部加完后拧紧管盖震荡出漩涡20s，制备成转染试剂。从培养箱取出准备好的293t细胞，将转染试剂，均匀的滴入到盛有293t细胞的培养皿中，每皿1ml。轻轻的来回晃动培养皿，混匀后，将培养皿重新放入37℃，5％co2细胞培养箱中培养。6小时后，弃去细胞上清，重新加入dmem完全培养基10ml。
[0117]
293t细胞补液，转染后一天，镜下观察细胞，密度接近60％～80％，然后每皿补液10ml。重新将细胞放到细胞培养箱中继续培养2天(36～48小时)。随着培养过程，细胞逐渐融合，形成多核体。
[0118]
(2)慢病毒收集
[0119]
转染293t细胞两天后，取干净的50ml离心管，收集所有上清，将离心管放入离心机，4℃，500g，离心10分钟，脱落细胞、大细胞碎片沉至管底。总上清约200ml，用一次性60ml 0.22μm pvdf针头过滤装置过滤。如果发现过滤速度变慢，考虑滤膜被堵，则更换新滤器。
[0120]
(3)慢病毒浓缩
[0121]
取mltra-clear sw28离心管，每个离心管中加入约40ml的收集、过滤的病毒上清液；用pbs液调平；然后使用beckman sw28进行超速离心，4℃，25000rpm(82700g)，离心2小时；离心结束，弃掉上清，然后将离心管倒扣于洁净的吸水纸巾上，放置10分钟，使管壁上的液体流干，可见沉淀物在管底附着；然后向每个mltra-clear sw28离心管中各加入200μl无血清opti-mem培养基，将sw28离心管置于4℃，溶解2小时，每20分钟摇震一次；之后进行进一步离心，4℃，500g，离心1分钟，将上清转移出来，并进行分装。放置-80℃冻存备用。
[0122]
(4)滴度测定
[0123]
细胞铺种，感染前1天，按照上述步骤，复苏、培养293t细胞，显微镜下观察培养皿中的293t细胞状态。选择状态良好的细胞进行消化、计数、调整细胞浓度，将293t细胞接种到24孔板中，加入500μl培养基/孔。
[0124]
病毒感染，第2天，取2孔细胞进行计数，确认感染时细胞的实际数目，记为n。之后将剩余孔的培养基轻轻移除，使用含10％fbs的dmem新鲜完全培养基稀释病毒，按照10倍梯度进行稀释，终体积为500μl。将稀释好的病毒加入到24孔板中，进行感染。第3天，感染293t细胞后20小时，弃掉上清，加入500μl完全培养基(dmem+10％fbs)，5％co2，37℃，继续培养48小时。
[0125]
基因组dna抽提，使用0.25％胰酶-edta溶液，消化细胞，37℃，放置1分钟。用移液吸取培养基吹洗细胞，然后离心收集。
[0126]
按照dneasy试剂盒的说明书抽提基因组dna。具体步骤如下：
[0127]
a.向各管中加入200μlpbs重悬细胞，再加入蛋白激酶k 20μl；
[0128]
b.加入buffer al 200μl，混匀；
[0129]
c.加入乙醇200μl，混匀；
[0130]
d.用移液将上述混合物转到2ml离心管中的dneasy mini滤柱中，6000
×
g，离心1min，弃滤液和离心管；
[0131]
e.将再取新的2ml离心管一支，将滤柱放入，加入buffer aw1 500μl，8000
×
g离心1min，弃滤液和离心管；
[0132]
f.将再取新的2ml离心管一支，将滤柱放入，加入buffer aw2 500μl，20000
×
g，离心3min，弃液、收集管；
[0133]
g.将滤柱放入新的2ml离心管；
[0134]
h.将buffer ae 200μl从滤柱膜正上加入，洗脱dna，室温，孵育1分钟。8000
×
g，离心1分钟；
[0135]
i.基因组dna保存在
–
20℃。
[0136]
上机，为检测病毒滴度，采用qpcr方法。所需引物序列如下：
[0137]
f：5'-cctttccgggactttcgcttt-3'；
[0138]
r：5'-gcagaatccaggtggcaaca-3'；
[0139]
probe：5'-fam-actcatcgccgcctgccttgcc-tamra-3'(probe)。
[0140]
pcr反应体系如下：
[0141]
为病毒序列检测引物配总管a：
[0142]
试剂体积2
×
taqman master mix100μlforward primer(100pmol ml-1
)4μlreverse primer(100pmol ml-1
)4μlprobe(100pmol ml-1
)4μlh2o788μl
[0143]
表13
[0144]
上述混合液混合、震荡后放在冰上。
[0145]
为人基因组序列检测引物配总管b如下表：
[0146]
试剂体积2
×
taqman master mix1000μl10
×
rnasep primer/probe mix100μlh2o700μl
[0147]
表14
[0148]
上述混合液混合、震荡后放在冰上。
[0149]
pcr具体步骤：
[0150]
a.取96孔的pcr板，按上述体系，依次建立，从总管a中各取45μl混合液加入到a-d各行的孔中，从总管b中各取45μl液体加入到e-g各行的孔中；
[0151]
b.分别向a-d行孔中各加入质粒标准品5μl、待测dna5μl，每个样品各重复1次。留1孔作为无模板对照组(no-template control)，向其加入加5μl水；
[0152]
c.分别向e-g行孔中加入基因组标准品5μl、待测dna5μl，每个样品各重复1次。留1孔作为无模板对照组(no-template control)，向其加入加5μl水；
[0153]
d.循环条件：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min；
×
40。仪器为abi prism 7000定量pcr仪。
[0154]
e.数据计算：
[0155][0156]
f.pcr法滴度(integration units per ml，iu/ml)计算公式如下：
[0157][0158]
其中，c代表平均每基因组中整合病毒拷贝数量；n代表感染时细胞数目(一般为1
×
105)；d指病毒载体稀释倍数；v代表所加稀释病毒体积数。
[0159]
第三步，car-t细胞的制备及扩增
[0160]
实验仪器如下表：
[0161]
名称厂商型号生物安全柜hr40-iia2海尔co2培养箱ccl-170b-8esco倒置显微镜ckx53奥林巴斯水平离心机st40r赛默飞2-8℃冰箱hyc-68a/hyc-205海尔瞬时离心机ew6000东胜创新恒温水浴锅hws-12上海一恒-80℃冰箱dw-86l626海尔液氮罐yds-175-216金凤台式离心机micro21rthermo涡旋振荡仪ikavortex2电动移液器px-100rain磁力分选架美天旎130-042-102流式细胞仪attune nxtthermo scientific
[0162]
表15
[0163]
实验试剂如下表：
[0164]
[0165][0166]
表16
[0167]
实验耗材如下表：
[0168]
耗材名称厂家货号10ml移液管corning44885ml移液管corning448750ml离心管corning43082915ml离心管corning4307911.5ml ep管爱优epbg-015024孔板corning352496孔板corning3599t25培养瓶corning430639t75培养瓶corning430641t175培养瓶corning431080血球计数板德国marienfeld06500300冻存管corning430663ls分选柱美天旎130-042-4010.7μm筛网corning352350
[0169]
表17
[0170]
实验步骤：
[0171]
(1)单个核细胞的分离
[0172]
使用75％酒精将一次性无菌的50ml离心管、10ml移液管、各种规格的带滤芯头等耗材表面擦拭消毒后放入到生物安全柜内，开启生物安全柜的紫外灯，将生物安全柜内的耗材和操作桌面紫外杀菌30min，做好实验前准备工作。
[0173]
采集50ml外周血于5管10ml edta-k2抗凝管中，使用酒精擦拭抗凝管表面，消毒后于生物安全柜内操作。将抗凝管轻轻颠倒混匀后，使用电动移液器将抗凝管中的外周血转移至50ml离心管中进行离心，转速为2000rpm，8min。小心吸取上层的血浆转移到新的50ml离心管。使用d-pbs(-)对血细胞沉淀进行重悬并稀释，按照体积比为血液：d-pbs(-)＝1:2的比例进行混匀操作。将25ml稀释后的血液沿离心管内壁缓慢加到15ml淋巴细胞分离液
(ficoll)上层，注意不要破坏ficoll的界面层。加入血液完成后，小心拿到离心机中进行水平离心，800g室温离心30min。
[0174]
离心结束后，取出离心管，注意切记摇晃。小心擦拭离心管表面后放入到生物安全柜里的离心管架，观察离心管内有明显分层，其中肉眼可见的“白膜层”即为此次分离获得的外周血单个核细胞(pbmc)。使用电动移液器小心吸取白膜层至新离心管中，使用0.9％生理盐水重悬pbmc细胞，1500rpm室温离心5min，清洗pbmc细胞2次，用0.9％生理盐水重悬pbmc，并用台盼蓝计数法进行细胞计数，根据计数结果计算取出2
×
108个pbmc，补加0.9％生理盐水至50ml，1500rpm，室温离心5min。
[0175]
(2)t细胞分选
[0176]
用0.5-1ml的分选缓冲液重悬清洗后的细胞沉淀，并按照每2
×
107个pbmc的比例加入10μlcd3磁珠，吹打混匀后于4℃避光孵育15min。孵育完成后加入10ml分选缓冲液，1500rpm，5min室温离心洗涤一次。在此期间，取一支一次性分选柱于磁力分选架上，并在分选柱下方放一支新的50ml离心管，标记为
“‑”
，用于收集cd3阴性细胞；另外准备一支新的50ml离心管，标记为“+”，用于收集cd3阳性细胞，于旁边备用。向一次性分选柱中加入3ml分选液，用于润洗。将离心后的细胞-磁珠混合物沉淀用3ml分选缓冲液重悬，加入到前面已经润洗好的分选柱内。待细胞悬液不再滴下时，向分选柱内加入3ml分选液，用于洗涤分选柱内残留的阴性细胞，重复洗涤步骤2次。待液体不再滴下时，向分选柱内再次加入3ml分选液，取下分选柱，将分选柱的塞子插入到分选柱内，把分选柱内液体推到“+”离心管中，收集得到cd3阳性t细胞。
[0177]
(3)t细胞激活
[0178]
将收集得到的cd3阳性t细胞1500rpm，室温离心5min，弃上清后使用t细胞培养基重悬细胞沉淀，在培养基中添加cd3和cd28抗体和il-2因子(100iu/ml)，其中cd3和cd28抗体用于t细胞的激活，而il-2细胞因子则为促进增殖。将t细胞使用培养基调整为2
×
106/ml的密度，于37℃、5％co2的二氧化碳培养箱中培养。
[0179]
(4)细胞的慢病毒转导
[0180]
从二氧化碳培养箱中取出t细胞培养瓶，于生物安全柜内无菌操作，使用移液轻轻吹匀t细胞，并取出0.5-1ml的细胞至1.5ml离心管内，采用台盼蓝染法进行计数。根据细胞总量计算出所需病毒量，计算公式为加入病毒体积＝细胞量*moi/病毒滴度，moi常规用量为3-5。根据计算结果，将慢病毒载体液加入细胞悬液中，轻轻吹打混匀后，于37℃、5％co2的二氧化碳培养箱中培养。慢病毒转导后72h，可以检测转导效率。
[0181]
(5)car-t细胞的扩增
[0182]
每天从二氧化碳培养箱中取出细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态和培养基颜，并进行细胞计数，按照2-3
×
105/ml的密度补充新鲜培养基，体外培养7-14天。在此期间，可进行细胞扩增计数、cd3+car+细胞及其cd4和cd8细胞比例的检测、t细胞亚型的状态评估、ldh法的杀伤效率检测和cba法细胞因子的检测。
[0183]
(6)car+细胞转导效率及cd4/8比例检测
[0184]
取未转导的t细胞和转导后的cart细胞各约1
×
106个细胞，分别装于1.5ml ep管中，经1500rpm，3min离心后弃上清，每管加入1ml 1xpbs重悬细胞，使用相同离心条件离心清洗。重复洗涤细胞2次后，使用0.1ml的1x pbs重悬细胞沉淀，每管加入1μl protein l，吹
打混匀后于4℃避光孵育45min。完成孵育后，使用1x pbs将每管细胞洗涤两次，使用0.1ml的1x pbs重悬细胞沉淀，每管加入0.2μl耦联了apc荧光素的streptavidin，吹打混匀后室温避光孵育20min。孵育完成后分别加入1ml 1x pbs洗涤两次，使用0.2ml的1x pbs重悬细胞，并用流式细胞仪检测car+细胞比例。
[0185]
(7)台盼蓝计数
[0186]
每天将cart细胞从二氧化碳培养箱中取出置于生物安全柜中，使用一次性移液管轻轻吹打混匀瓶中的细胞后，吸取100μl左右的细胞悬液于1.5mlep管中，并使用台盼蓝染法进行细胞计数，并计算细胞数与细胞活率，连续七天后制作细胞数扩增曲线。
[0187]
第四步，car-t细胞功能实验
[0188]
实验仪器如下表：
[0189][0190][0191]
表18
[0192]
实验试剂如下表：
[0193][0194]
表19
[0195]
实验耗材如下表：
[0196]
耗材名称厂家货号10ml移液管corning44885ml移液管corning448750ml离心管corning430829
15ml离心管corning4307911.5ml ep管爱优epbg-015024孔板corning352496孔板corning3599t25培养瓶corning430639t75培养瓶corning430641t175培养瓶corning431080血球计数板德国marienfeld06500300冻存管corning430663ls分选柱美天旎130-042-4010.7μm筛网corning352350
[0197]
表20
[0198]
实验步骤如下：
[0199]
细胞亚型、treg和耗竭性t细胞检测。连续三天，取各组cart细胞于1.5ml ep管中，每份约1
×
106个细胞，将一管标记为p1，另一管标记为p2。将两管细胞经1500rpm，3min离心后弃上清，每管加入1ml1xpbs重悬细胞，使用相同离心条件离心清洗。重复洗涤细胞2次后，每管使用0.1ml的1x pbs重悬细胞沉淀，向p1管中加入1μl耦联了af700荧光素的cd4抗体、1μl耦联了apc-cy7荧光素的cd8抗体、1μl耦联了pe-cy7荧光素的cd127抗体、1μl耦联了percp-cy5.5荧光素的cd45ra抗体和1μl耦联了pe荧光素的ccr7抗体，吹打混匀后于室温避光孵育20min。完成孵育后，使用1x pbs将每管细胞洗涤两次，并用流式细胞仪检测t细胞分化及其状态。
[0200]
在实验中发现，芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞亚型分化的影响较为有趣，在car-t细胞生长能力受到抑制的情况下，car-t的分化状态从分化较为早期的tscm及分化较为晚期的teff方向往tcm及tem状态分化，而treg细胞的亚型也随着芦可替尼的剂量的提高及时间的延长而降低，其耗竭相关的marker也符合这一趋势。芦可替尼对cd19-targeted car-t细胞不仅仅是暂停其生长，同时对car-t细胞的状态进行了调整，降低其耗竭的程度，减少treg细胞的数量。
[0201]
芦可替尼在il-2依赖的car-t细胞扩增的扩增有明显的抑制作用，且对其细胞的活性没有显著的影响，而在这一阶段对car-t的抑制不是一种完全意义的暂停作用，而对car-t细胞的状态进行调整，将其分化状态转变在更好的状态，降低treg细胞的含量，较少car-t细胞的耗竭程度，将car-t细胞转变到更适合被激活的状态。故其药物移除后，其特异性杀伤能力得以快速恢复。而在受到抗原刺激的情况下，其特异性杀伤能力被抑制，细胞因子的释放水平被降低，这也是其作为临床上可以用于控制crs的原因。
[0202]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：

1.芦可替尼在制备car-t药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，使用芦可替尼处理car-t细胞后，在细胞分化状态，car-t细胞亚型向适中状态富集，能提升car-t细胞增值能力并增强特异性杀伤能力。

技术总结

本发明涉及芦可替尼在制备CAR-T药物中的应用。使用芦可替尼处理CAR-T细胞后，在细胞分化状态，CAR-T细胞亚型既没有往更年轻的亚型分化，也没有往分化末期的状态分化，而是向适中状态富集，CAR-T细胞具有强增殖能力及特异性杀伤能力，随着芦可替尼的撤离，CAR-T细胞的功能和杀伤能力可以回复。本发明的优势在于，芦可替尼的存在不影响CAR-T细胞的生存能力，同时对其他免疫细胞如单核巨噬细胞的细胞因子的释放也存在抑制作用，能够全面的降低CRS的毒性作用。的毒性作用。的毒性作用。