一种新渡户线虫培养基及培养方法

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1.本发明涉及病虫害防治，尤其涉及一种新渡户线虫培养基及培养方法。

背景技术：

2.松树蜂（sirex noctilio）隶属于膜翅目（hymenoptera）树蜂科（siricidae）树蜂属（sirex），原产于欧亚大陆和北非，主要危害针叶树种，其中松属（pinus）类寄主相对较多，达20余种，同时，偶尔也发现其危害云杉属（picea）、冷杉属（abies）、以及落叶松属（larix）植物。
3.新渡户线虫（deladenus nitobei）属垫刃目（tylenchida），新垫刃线虫科（neotylenchidae），大腺属（deladenus），是松树蜂的寄生性天敌，具有致松树蜂雌成虫绝育的能力。现有研究表明，新渡户线虫具有双重生活史，即食菌型生活史及寄生型生活史，线虫可以根据环境条件选择其生活史型。自然条件下，新渡户线虫寄生型幼虫随松树蜂绝育卵粒通过松树蜂产卵活动进入林木木质部，并从卵粒内部破开卵鞘进入松树蜂产卵道中，取食松树蜂产卵过程中与毒液、卵粒一同注入的网隙裂粉韧革菌（amylostereum areolatum）菌丝，之后转化为食菌型线虫并在受害木管胞内定殖。当食菌型线虫接近松树蜂幼虫时，会受到松树蜂幼虫呼吸造成的局部二氧化碳浓度高和环境ph较低的条件影响进入感染期幼虫阶段。感染期线虫幼虫向松树蜂幼虫体内侵入，侵入成功后转变为寄生型生活史在松树蜂体内定殖。
4.现有研究结果表明，目前实验室普遍采用的接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上的网隙裂粉韧革菌饲养新渡户线虫的效果一般，主要表现为线虫繁殖率低，线虫内源性细菌污染造成的线虫死亡率高，培养基更换频率高、操作难度大等。同时，由于pda培养基缺乏线虫生长繁殖必要的胆固醇、氨基酸、维生素等营养物质，以及培养基质地导致的线虫活动困难等问题，新渡户线虫难以有效繁育，对生物防治相关研究造成困扰。

技术实现要素：

5.本发明提供一种新渡户线虫培养基及培养方法，该培养方法可以稳定繁育新渡户线虫，提升新渡户线虫产卵量，同时降低内源细菌污染对线虫的影响。
6.一种新渡户线虫培养基，包括：松木粉160-190g/l，琼脂15-25g/l，黄豆粉5-15g/l，蔗糖8-13g/l，麦芽粉2.5-10g/l，韦氏盐1.5-5g/l，胆固醇1.5-2.5g/l，对羟基苯甲酸甲酯0.5-3g/l，维生素a 0.5-2.0g/l，维生素c 0.5-5.0g/l。
7.根据本发明实施例，所述新渡户线虫培养基包括：松木粉170.0g/l，琼脂20.0g/l，黄豆粉10.0g/l，蔗糖10.0g/l，麦芽粉5.0g/l，韦氏盐3.0g/l，胆固醇2.0g/l，对羟基苯甲酸甲酯1.5 g/l，维生素a 0.5g/l，维生素c 3.0g/l。
8.根据本发明实施例，所述松木粉的粒径小于或等于0.2mm。
9.根据本发明实施例，所述松木粉为樟子松（pinus sylvestris var. mongholica litv.）木粉或油松木粉，优选为樟子松木粉。
10.根据本发明实施例，所述樟子松木粉为健康樟子松干燥木粉。
11.根据本发明实施例，所述新渡户线虫培养基用水配制，可采用本领域常规方法。
12.本发明还提供上述新渡户线虫培养基的制备方法，包括：按配方将松木粉，琼脂，黄豆粉，蔗糖，麦芽粉，韦氏盐，胆固醇，对羟基苯甲酸甲酯加入纯净水，混匀后灭菌；然后再加入维生素a和维生素c，混匀。
13.根据本发明实施例，可采用热压灭菌，例如在121℃条件下高压灭菌25min。
14.本发明还提供上述培养基在新渡户线虫培养中的应用。
15.本发明还提供一种新渡户线虫的培养方法，包括：1）提供上述新渡户线虫培养基，分装为培养基平板或斜面；2）接种网隙裂粉韧革菌，在25℃
±
2℃条件下避光培养8d以上；3）将分离出的新渡户线虫接种于所述新渡户线虫培养基上；4）经培养后洗脱所述培养基上生长的线虫，依次用无菌水、抗生素溶液洗涤，然后再接种于新的新渡户线虫培养基平板或斜面上。
16.根据本发明实施例，重复以上步骤即可完成新渡户线虫扩繁工作。
17.根据本发明实施例，接种网隙裂粉韧革菌后培养至菌丝直径达到培养皿直径50%-70%，再接种新渡户线虫。
18.根据本发明实施例，接种网隙裂粉韧革菌后的培养时间与培养基平板直径相关。通常情况下，60mm直径培养基平板应培养8-11d，90mm直径培养基平板应培养11-14d。
19.根据本发明实施例，分离新渡户线虫的方法包括：解剖被线虫寄生的松树蜂雄成虫腹部背板，使树蜂雄虫腹腔暴露，将被寄生树蜂精巢取出。将松树蜂精巢在抗生素溶液或无菌水中清洗，使线虫充分脱落松树蜂精巢结缔组织，静置沉淀后弃上清液，得到线虫悬液。
20.根据本发明实施例，步骤3）中每培养基内接种200-500头新渡户线虫。可选地，新渡户线虫接种位置为网隙裂粉韧革菌菌丝生长边缘。
21.根据本发明实施例，步骤4）包括将培养基上的新渡户线虫用无菌水洗脱，通过300目纱网，收集滤液，滤去不能通过筛网的培养基碎块及菌丝团；将滤液通过灭菌的1000目纱网，弃滤液，收集新渡户线虫成虫、幼虫及卵粒；在无菌环境下使无菌水通过承接新渡户线虫的1000目纱网，洗去新渡户线虫体表附着的细菌，随后用抗生素溶液通过筛网，进一步降低细菌污染概率。
22.根据本发明实施例，步骤4）中新渡户线虫洗脱时间为培养基内剩余菌丝面积为培养基面积的5%-10%时。
23.根据本发明实施例，步骤4）中使5-10ml无菌水通过承接新渡户线虫的1000目纱网后重复3-5次，随后使5-10ml抗生素溶液通过承接新渡户线虫的1000目纱网后重复2-3次。
24.根据本发明实施例，步骤4）中选用抗生素为10-50mg/l硫酸庆大霉素溶液或10-50mg/l头孢噻呋钠溶液。
25.本发明提供的培养基可以有效提高新渡户线虫繁殖能力，降低污染概率。
26.本发明提供的培养方法降低了生产人员操作难度，减少了线虫洗涤过程出现的损失。
附图说明
27.图1为新渡户线虫在不同培养基中的生长状态；其中s、d1、d2分别表示实施例1、对比例1、对比例2。
28.图2为新渡户线虫在实施例1培养基中产卵情况。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.以下樟子松木粉的制备方法：将健康樟子松木截为5.0
×
0.3
×
0.3cm的条形木块，在90℃条件下烘干24h，研磨成粒径小于等于0.2mm的木粉，在121℃条件下灭菌25min，得到樟子松木粉。
31.以下网隙裂粉韧革菌菌株由北京林业大学林业有害生物防治北京市重点实验室提供。
32.以下所用松树蜂由吉林省榆树市林草局提供。
33.以下新渡户线虫分离方法：在无菌环境下解剖松树蜂雄虫后，用洁净镊子夹取被寄生松树蜂的膨大精巢，将松树蜂精巢在1ml盛放于1.5ml离心管中的50mg/l浓度的头孢噻呋钠溶液中清洗，使新渡户线虫充分脱落松树蜂精巢结缔组织，静置45min后弃上清液，得到新渡户线虫悬液。
34.实施例1本实施例提供新渡户线虫培养基，配方为：樟子松木粉170.0g/l，琼脂20.0g/l，黄豆粉10.0g/l，蔗糖10.0g/l，麦芽粉5.0g/l，韦氏盐3.0g/l，胆固醇2.0g/l，对羟基苯甲酸甲酯1.5 g/l，维生素a 0.5g/l，维生素c 3.0g/l。用水配制。
35.本实施例新渡户线虫培养基的制备方法：称取170.0g木粉，20.0g琼脂，10.0g黄豆粉，10.0g蔗糖，5.0g麦芽粉，3.0g韦氏盐，2.0g胆固醇，1.5g对羟基苯甲酸甲酯，混匀，加入1.0l纯水搅拌均匀，在121℃条件下灭菌25min。待培养基冷却至80℃后，加入维生素a 0.5g、维生素c 3.0g，再次混匀。
36.本实施例提供新渡户线虫的培养方法：1）将新渡户线虫培养基分装至培养皿（直径60mm）内，并接种网隙裂粉韧革菌，避光培养10天。
37.2）无菌条件下，在新渡户线虫悬液内加入0.5ml头孢噻呋钠溶液，取20微升，约150头新渡户线虫侵染期幼虫接种于菌丝边缘，25℃条件下避光培养7d。
38.3）洗脱旧培养基上生长的线虫：无菌条件下，用无菌水反复冲洗培养基表面，得到线虫悬液，依次通过300目、1000目纱网，使线虫停留在1000目纱网上表面，依次使5ml无菌水通过1000目纱网后重复5次，随后使5ml抗生素溶液通过1000目纱网后重复3次，随后使纱网在1ml盛放于1.5ml离心管中的50mg/l浓度的头孢噻呋钠溶液中清洗，使线虫充分脱落松树蜂精巢结缔组织，静置45min后弃上清液，得到线虫悬液。全部接种于新培养基上，并在25℃条件下避光培养7d。
39.对比例1本对比例提供的新渡户线虫培养方法与实施例1的区别仅在于，所用新渡户线虫培养基中不含有胆固醇。
40.对比例2本对比例提供的新渡户线虫培养方法与实施例1的区别仅在于，将新渡户线虫培养基替换为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l）。
41.对比例3本对比例提供的新渡户线虫培养方法与实施例1的区别仅在于，所用新渡户线虫培养基中不含有黄豆粉。
42.实验1分别按实施例1、对比例1、对比例2方法培养新渡户线虫共14d，每组6个重复，结束后洗脱线虫并统计虫口数量，其中未孵化线虫卵不计入虫口数量，记录实验结果见表1。
43.图1为新渡户线虫在不同培养基中的生长状态见图1，其中s、d1、d2分别表示实施例1、对比例1、对比例2。由图1可见，实施例1虫口数量显著高于对比例1，实施例1和对比例1虫口数量均显著高于对比例2。
44.新渡户线虫在实施例1培养基中产卵情况见图2。由图2可见，实施例1中线虫繁殖能力强，单头线虫产卵量高于150粒。
45.表1 不同培养基培养的新渡户线虫虫口数量（头）实验2分别按实施例1、对比例3方法培养新渡户线虫共14d，每组2个重复，结束后洗脱线虫并随机挑取雌成虫10头，热杀死后在光学显微镜下测量体长及体宽。记录实验结果见表2。
46.表2 不同培养基培养的新渡户线虫体型由表2可见，实施例1中新渡户线虫体型较大，线虫生长发育情况较好。
47.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

1.一种新渡户线虫培养基，其特征在于，包括：松木粉160-190g/l，琼脂15-25g/l，黄豆粉5-15g/l，蔗糖8-13g/l，麦芽粉2.5-10g/l，韦氏盐1.5-5g/l，胆固醇1.5-2.5g/l，对羟基苯甲酸甲酯0.5-3g/l，维生素a 0.5-2.0g/l，维生素c 0.5-5.0g/l。2.根据权利要求1所述新渡户线虫培养基，其特征在于，包括：松木粉170.0g/l，琼脂20.0g/l，黄豆粉10.0g/l，蔗糖10.0g/l，麦芽粉5.0g/l，韦氏盐3.0g/l，胆固醇2.0g/l，对羟基苯甲酸甲酯1.5 g/l，维生素a 0.5g/l，维生素c 3.0g/l。3.根据权利要求1或2所述新渡户线虫培养基，其特征在于，所述松木粉的粒径小于或等于0.2mm；和/或，所述松木粉为樟子松木粉或油松木粉。4.权利要求1-3任一项所述新渡户线虫培养基的制备方法，其特征在于，包括：按配方将松木粉，琼脂，黄豆粉，蔗糖，麦芽粉，韦氏盐，胆固醇，对羟基苯甲酸甲酯加入纯净水，混匀后灭菌；然后再加入维生素a和维生素c，混匀。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，采用热压灭菌。6.权利要求1-3任一项所述新渡户线虫培养基在新渡户线虫培养中的应用。7.一种新渡户线虫的培养方法，其特征在于，包括：1）提供权利要求1-3任一项所述新渡户线虫培养基，分装为培养基平板或斜面；2）接种网隙裂粉韧革菌，在25℃
±
2℃条件下避光培养8d以上；3）将分离出的新渡户线虫接种于所述新渡户线虫培养基上；4）经培养后洗脱所述培养基上生长的线虫，依次用无菌水、抗生素溶液洗涤，然后再接种于新的新渡户线虫培养基平板或斜面上。8.根据权利要求7所述新渡户线虫的培养方法，其特征在于，接种网隙裂粉韧革菌后培养至菌丝直径达到培养皿直径50%-70%，再接种新渡户线虫。9.根据权利要求7或8所述新渡户线虫的培养方法，其特征在于，步骤3）中每培养基内接种200-500头新渡户线虫；新渡户线虫接种位置为网隙裂粉韧革菌菌丝生长边缘。10.根据权利要求7或8所述新渡户线虫的培养方法，其特征在于，步骤4）包括将培养基上的新渡户线虫用无菌水洗脱，通过300目纱网，收集滤液，滤去不能通过筛网的培养基碎块及菌丝团；将滤液通过灭菌的1000目纱网，弃滤液，收集新渡户线虫成虫、幼虫及卵粒；在无菌环境下使无菌水通过承接新渡户线虫的1000目纱网，洗去新渡户线虫体表附着的细菌，随后用抗生素溶液通过筛网，进一步降低细菌污染概率。

技术总结

本发明涉及病虫害防治，尤其涉及一种新渡户线虫培养基及培养方法。新渡户线虫培养基包括：松木粉160-190g/L，琼脂15-25g/L，黄豆粉5-15g/L，蔗糖8-13g/L，麦芽粉2.5-10g/L，韦氏盐1.5-5g/L，胆固醇1.5-2.5g/L，对羟基苯甲酸甲酯0.5-3g/L，维生素A 0.5-2.0g/L，维生素C 0.5-5.0g/L。采用本发明新渡户线虫培养基可以稳定繁育新渡户线虫，提升新渡户线虫产卵量，同时降低内源细菌污染对线虫的影响。同时降低内源细菌污染对线虫的影响。同时降低内源细菌污染对线虫的影响。