真菌菌渣物质新用途的制作方法

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1.本发明涉及菌渣利用技术领域，尤其是涉及flammulina属或collybia属真菌菌渣物质的新用途。

背景技术：

2.我国是世界上食用菌生产量最大的国家，总产量从2000年的608万吨稳步增长到2016年的3596万吨，占世界总产量的70％以上。其中，金针菇是生产规模最大的食用菌之一。金针菇菌渣(亦称菌糠)是我国典型的农用废弃物，年均产量5214万吨(费凡，“金针菇和醋渣废弃物资源化综合利用及其养殖蚯蚓研究”，江苏大学硕士论文，2019年6月)。由于该菌渣含有氨基酸、粗蛋白、粗纤维素、粗脂肪及铁、钙、锌、镁等营养物质，其具有较好的开发利用价值。然而目前，金针菇菌渣仅部分地被应用于食用菌二次栽培基质、菌糠饲料、肥料、提取多糖。大部分的金针菇菌渣被填埋、丢弃或燃烧，既造成资源的严重浪费，又造成了环境污染问题。因此，如何实现金针菇菌渣的资源化综合利用已成为当前的研究热点之一。
3.化合物dankasterone b是amagata和numata等从真菌菌株gymnacella denkaliensis中分离得到的已知化合物(amagata t.，et al.，“variation in cytostatic constituents of a sponge-derived gymnascella dankaliensis by manipulating the carbon source”，j.nat.prod.，2007，70：p1731-1740)。根据该研究结果，该化合物dankasterone b具有抗肿瘤活性，在p388淋巴细胞白血病测试中显示出显著的细胞毒性(ed
50
＝2.8μg ml-1
)。

技术实现要素：

4.在针对菌渣的研究中，发明人发现，金针菇(flammulina velutipes，又名collybia velutipes)菌渣的分离物能够有效地抑制种子发芽。在针对该分离物的随后的分离纯化过程中，发明人还发现，该金针菇菌渣分离物中含有的化合物dankasterone b；换言之，发明人首次发现，金针菇菌渣中含有化合物dankasterone b。由此，拓展了flammulina属或collybia属真菌菌渣物质(尤其是金针菇菌渣物质)在菌渣合理利用、生物活性物质获取等方面与化合物dankasterone b相关的新用途。
5.基于上述研究结果，在第一个方面，本发明提供了一种真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其中，该真菌为flammulina属或collybia属真菌。在根据本发明的优选实施例中，该真菌菌渣物质为金针菇菌渣物质。
6.在本发明中，金针菇(flammulina velutipes，又名collybia velutipes)，又名冬菇，另有构菌、朴菇、毛柄金钱菇、冻菇等俗称。金针菇属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，flammulina属(冬菇属)或collybia属(金钱菌属)(也或小火菇属，又名长根菇属)。根据本发明，该金针菇可以是试验菌种，也可以是栽培品种。所谓试验菌种，通常是指对真菌不同来源的子实体或同一来源的不同子实体进行组织分离、孢子培养、菇木分离获得的纯培养物(也称之为菌株)。在这些众多试验菌种中，具有遗传性状上的稳定性和生物特性上的
均一性，从而可以大规模推广栽培的菌株，才可称之为栽培品种。在本发明中，金针菇的常用栽培品种菌株可以例如为flammulina velutipes(fr)sing.；或collybia velutipes(curt.exfr.)quel.，其白变种为f.var.velutipes(赵淑英，“金针菇菌种质量及亲缘关系评价研究”，河北师范大学硕士学位论文，2008年)。
7.根据本发明，该化合物dankasterone b的结构式如下所示：
[0008][0009]
根据本发明，该真菌菌渣物质可以为至少含有flammulina属或collybia属真菌菌渣、或者至少含有来源于该真菌菌渣的含有化合物dankasterone b的混合物的物质。
[0010]
在本发明中，根据行业中的通常定义，该真菌菌渣可以为，在采收flammulina属或collybia属真菌子实体后剩余的包括部分真菌残料的培养基。根据本发明，该真菌菌渣还可以为，在采收flammulina属或collybia属真菌子实体后剩余的除去真菌残料(例如菌丝体)的培养基，或者该两种培养基的混合物。其中，真菌子实体的采收期可以根据真菌菌种而有不同，一般可根据行业惯例或者标准进行操作。在根据本发明的一个实施例中，该真菌子实体的采收期为：从接菌种之日起算，大约50-60天后采收。
[0011]
根据其物理状态，该培养基通常(但不局限于)为固体。在可以实现flammulina属或collybia属真菌子实体生长的情况下，该培养基也可以为液体或者半固体。在培养基成分上，该培养基可以包括行业内通常使用的用于生产flammulina属或collybia属真菌(尤其是金针菇)的培养基成分，优选地，该培养基至少以含有淀粉的物质为碳源。该含有淀粉的物质可以为可溶性淀粉物质，或者为诸如玉米芯、玉米粉、马铃薯、米糠、啤酒糟、豆渣、豆饼粉、高粱粉等不可溶性淀粉物质中的一种或几种。在根据本发明的一个实施例中，该培养基包括玉米芯、米糠、麸皮和/或棉籽壳、豆渣、海藻渣、甜菜浆和碳酸钙等。在根据本发明的优选实施例中，该培养基包括(根据质量百分比)：玉米芯40-50％，米糠30-40％，麸皮和/或棉籽壳2-4％，豆渣5-6％，海藻渣5-6％，甜菜浆4-5％和碳酸钙2-3％。
[0012]
在本发明中，该来源于该真菌菌渣的含有化合物dankasterone b的混合物为，通过可行的技术手段，从该flammulina属或collybia属真菌菌渣中获取的含有化合物dankasterone b的混合物。本领域技术人员可以根据需要选择使用该可行的技术手段。通常情况下，发酵工程中的分离、提取和纯化技术可以适用于本发明，例如，在根据本发明的一个实施例中，该来源于该真菌菌渣的含有化合物dankasterone b的混合物为，通过乙酸乙酯提取后再经硅胶柱分离的提取物。在根据本发明的另一个实施例中，来源于该真菌菌
渣的含有化合物dankasterone b的混合物为，经过乙酸乙酯和硅胶柱二次提取和分离、并随后纯化的混合物。
[0013]
根据本发明，该真菌菌渣物质还可以含有采收到的flammulina属或collybia属真菌子实体。
[0014]
在第二个方面，本发明提供了一种含有化合物dankasterone b的真菌菌渣物质在制备抗肿瘤药物或者保健食品方面的用途，其中，该真菌为flammulina属或collybia属真菌。在根据本发明的优选实施例中，该真菌菌渣物质为金针菇菌渣物质。
[0015]
现有技术中已报道dankasterone b具有抗肿瘤活性(参见前述amagata，et al.，2007)。将从真菌子实体、发酵物或者菌渣中提取的混合物应用于药物或者保健食品(例如功能性酸奶)的制备的方法，在中国申请cn1416349a、cn103284981a和中国专利zl201510302359.9等已有报道。本发明将这些现有技术文献中有关将提取混合物应用于药物或者保健食品(例如功能性酸奶)的制备的方法的部分引入本说明书，从而在此不再赘述。
[0016]
通过上述技术方案，本发明达到了如下的有益效果：
[0017]
相较于现有技术中获取dankasterone b时通常使用的生物发酵方法，本发明通过将flammulina属或collybia属真菌(尤其是金针菇)菌渣物质用于获取化合物dankasterone b，或者将其用于制备抗肿瘤药物或者保健食品(例如功能性酸奶)，实现了真菌菌渣废料利用，即：使得通常仅作为饲料、肥料或被填埋燃烧的flammulina属或collybia属真菌(尤其是金针菇)菌渣得到了附加值更高的有效利用，从而提高了资源的综合利用，并且极大地降低了成本。
附图说明
[0018]
图1a-b为金针菇菌渣分离物在流动相石油醚∶乙酸乙酯比为2∶1时的薄层层析硅胶板结果；其中，图1a为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的薄层层析硅胶板结果，图1b为金针菇菌渣分离物w4的高浓度(左带)和低浓度(右带)的薄层层析硅胶板结果。
[0019]
图2a-c为金针菇菌渣分离物在流动相石油醚∶乙酸乙酯比为5∶1时的薄层层析硅胶板结果；其中，图2a为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的低浓度的薄层层析硅胶板结果，图2b为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的高浓度的薄层层析硅胶板结果；图2c为金针菇菌渣分离物w4在流动相石油醚∶乙酸乙酯为2∶1(加少许乙酸乙酯)时的薄层层析硅胶板结果，左带为w4结果，右带为w4二次分离后21～36管合并浓缩后所获物质的结果，此右带物质为进行结构鉴定的样品。
[0020]
图3a-c为金针菇菌渣分离物w4部分样品的lcms液质图谱；其中，图3a为220nm波长下的结果，图3b为254nm波长下的结果，图3c为质谱结果。
[0021]
图4为本发明获得的化合物dankasterone b的质谱图。
[0022]
图5a-b为金针菇菌渣分离物w4样品的lcms液质图谱；其中，图5a为整体图谱，图5b为根据整体图谱的局部放大图。
[0023]
图6为本发明获得的化合物dankasterone b的氢谱图。
[0024]
图7为本发明获得的化合物dankasterone b的碳谱图。
[0025]
图8为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的活性试验结果；其中，左上图为经w2处理，右
上图为经w3处理，左下图为经w4处理，右下图为空白对照组ck。
[0026]
图9a-d为其他食用菌菌渣粗样或者食用菌子实体粗样的质谱图。其中，图9a为平菇菌渣；图9b、9c和9d分别为金针菇、平菇和海鲜菇。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明，但本发明不应受下面公开的具体实施例的限制。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。对下述实施例中的测试数据结果所能够表明的结论，可以是本领域技术人员可以基于本技术领域常识而合理推论得出的结论，而不局限于下面公开的文字记载。
[0028]
实施例1从金针菇菌渣中分离提纯化合物dankasterone b
[0029]
金针菇菌渣取自武汉如意情工厂堆积的新鲜菌渣废弃物，经晒干处理后备用。该金针菇菌渣所含有的培养基是行业内通常使用的培养基，具体包括(根据质量百分比)：玉米芯40-50％，米糠30-40％，麸皮和/或棉籽壳2-4％，豆渣5-6％，海藻渣5-6％，甜菜浆4-5％和碳酸钙2-3％。从接菌种到采收，大约50-60天。
[0030]
1.1金针菇菌渣的一次分离
[0031]
一次分离的方法具体如下：
[0032]
1)称取1.5千克干菌渣(鲜菌渣含水量为55％)，用15升乙酸乙酯提取获得114.13克膏体；
[0033]
2)取42.21克膏体，用碳酸钠去除乙酸，得到32克膏体；
[0034]
3)将32克膏体与32克(80～100目)硅胶混合；
[0035]
4)称取600克(200目)硅胶，用直径8厘米的柱子，石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)冲洗，200ml一管收集，进行层析分离；
[0036]
5)经薄层层析硅胶板上样检测后，根据所含物质的不同极性，将各管进行合并，减压浓缩后得到4部分分离物样品，具体如下表1所示：
[0037]
表1
[0038]
样品名称相应的分离管浓缩后质量(克)w11～11管23w212～20管2.3w321～30管2.6w4剩余的，仅用乙酸乙酯冲洗2.22
[0039]
在表1中所示出的四个分离物样品中，将分离物w2、w3和w4用乙酸乙酯溶解后，经薄层层析硅胶板上样检测。其结果分别如图1、2所示。
[0040]
图1为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4在流动相石油醚：乙酸乙酯比为2：1时的薄层层析硅胶板结果(图1a)，其中还示出了金针菇菌渣分离物w4在流动相石油醚∶乙酸乙酯比为2∶1时的相对高浓度(上样量)(图1b左带)和相对低浓度(上样量)(图1b右带)的薄层层析硅胶板结果。图2为金针菇菌渣分离物在流动相石油醚∶乙酸乙酯比为5∶1时的薄层层析硅胶板结果；其中，图2a为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的低浓度的薄层层析硅胶板结果，图2b为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的高浓度的薄层层析硅胶板结果。
[0041]
从图1、图2示出的薄层层析硅胶板结果可以看出，从金针菇菌渣中提取的混合物，
按照其极性差异，得到了较好的分离。
[0042]
1.2对如上述1.1中分离而得的金针菇菌渣分离物w4进行二次分离
[0043]
具体分离方法如下：
[0044]
1)将w4样品用乙酸乙酯溶解后，减压浓缩获得1.4克样品；
[0045]
2)将1.4克样品与1.4克硅胶(200目)混合；
[0046]
3)称取30克(20目)硅胶，用直径3厘米小柱，进行层析分离；依次石油醚和乙酸乙酯按2∶1、1∶1、1∶2进行梯度冲洗，最后用乙酸乙酯冲洗剩余部分，20ml一管收集，具体如下表2所示：
[0047]
表2
[0048]
相应的分离管洗脱液1～26管石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)27～45管石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)46～56管石油醚∶乙酸乙酯(1∶2)57管乙酸乙酯冲洗58管甲醇冲洗
[0049]
根据硅胶板上样结果，将21～36管合并，以获得中间较纯的部分，得到0.55克物质，作为样品进行结构鉴定。其薄层层析硅胶板结果如图2c所示。图2c中，流动相为石油醚∶乙酸乙酯比为2∶1(加少许乙酸)，左带为w4，右带为21～36管合并后浓缩物质。从上样结果看，分离物较单一，无拖尾情况。
[0050]
1.3对如上述1.2中分离而得的金针菇菌渣分离物样品进行lcms分析
[0051]
具体方法如下：取少量上述用于结构鉴定的样品，用dmso和乙腈(谱级)溶解于ms瓶中，进行lcms(shimadzu lcms2020)分析。样品分析图谱如图3所示。
[0052]
由样品分析，以ms为355/875/357/444/331作为目标物ms(参见图4图谱峰)，可以确定rt＝1.577min-1.646min为目标峰，进行分离纯化。
[0053]
1.4对如上述1.2中分离而得的金针菇菌渣分离物进行分离纯化
[0054]
1)将如上述1.2中分离而得的金针菇菌渣分离物用3ml乙酸乙酯，另外加dmso、乙腈(谱级)等混合溶剂溶解，并用0.45μm滤头过滤。将样品转移至5ml尖底刻度离心管中，总体积约为15ml，用ms-trigger制备型高效液相谱仪进行制备，收集ms含有355/875/357/444/331物质作为馏分。
[0055]
制备谱条件：
[0056]
a相：0.1％三氟乙酸(谱级)水溶液；b相：乙腈(谱级)
[0057]
谱柱：shim-pack c18 150*25mm*10μm
[0058]
流速：25ml/min
[0059]
分离梯度表如下：
[0060]
时间(分钟)a％b％0.01406012.00109012.2059515.000100
15.204060
[0061]
制备图谱如图5所示。
[0062]
收集目标物馏分，根据ms值不同，并按照其保留时间，将馏分分为如下3组分：
[0063]
组分1：rt＝11.810min-12.251min；ms值为444/875/449；
[0064]
组分2：rt＝12.262min-13.039min；ms值为355；
[0065]
组分3：rt＝14.824min-15.696min；ms值为331/357。
[0066]
2)馏分后处理：对分离得到的3组分馏分分别进行旋蒸、冷冻干燥。
[0067]
其中，对于组分1，馏分冻干(labconco冻干机)后，进行称重(xpe205dr电子分析天平)，得到目标物13.0mg，此为化合物1；
[0068]
对于组分2，馏分冻干后，进行称重，得到目标物22.0mg，此为化合物2；
[0069]
对于组分3，馏分冻干后，进行称重，得到目标物21.6mg，此为化合物3。
[0070]
1.5对如上述1.4中分离纯化而得的化合物进行结构鉴定
[0071]
通过核磁共振1d/2d nmr对如1.3中分离纯化而得的化合物1、2、3进行了结构确证。结果表明，化合物2、3分别为具有如下结构式的硬脂酸甘油酯衍生物。
[0072]
化合物2：
[0073]
化合物3：
[0074]
化合物1即为化合物dankasterone b，其中，针对化合物1的结构鉴定结果具体如下：
[0075]
通过核磁共振1d/2d nmr对该化合物进行结构确证，其核磁氢谱(图6)和碳谱(图7)，核磁数据参见下表3：
[0076]
表3：化合物的1d/2d nmr数据：
[0077]
[0078][0079]
注：s-单重态，d-二重态，t-三重态，m-多重态，ov-重叠。
[0080]
通过核磁共振1d/2d nmr解析，该化合物的结构式与如下结构式相符(立体构型未考察)：
[0081][0082]
经检索，该化合物为已知化合物dankasterone b，与文献报道(参见前述amagata，et al.，2007)一致。
[0083]
实施例2金针菇菌渣分离物的活性试验
[0084]
针对实施例1中一次分离时获得的金针菇菌渣分离物w2、w3和w4进行了活性试验。
[0085]
其具体方法如下：将0.1g左右金针菇菌渣分离物分别用5ml乙酸乙酯溶解后，取该乙酸乙酯溶液1ml滴入干燥的滤纸(事先称重)上，待乙酸乙酯挥发后，再次称重确定滤纸上物质的质量，将滤纸放入培养皿内，根据滤纸重量差加入适量纯净水，配制成1000倍浓度溶液(假定分离物全溶于水)，然后在培养皿中放入30粒白菜籽后，置于27℃恒温培养箱内培
养，5日后观察记录发芽情况。试验设置滤纸加纯净水为空白对照组(ck)，每处理重复3次。
[0086]
活性试验的结果如图8所示。从图8中可以清楚地看出，在使用空白参照物ck、以及金针菇菌渣分离物w2和w3的处理下，培养皿中的种子均可观察到发芽现象；与之相比，使用金针菇菌渣分离物w4处理的种子(图8的左下图)没有发芽。该结果表明，金针菇菌渣分离物w4具有抑制种子发芽的活性。
[0087]
比较例1其他食用菌菌渣中关于化合物dankasterone b的检测
[0088]
在本比较例1中，通过lcms的方法检测了其他食用菌菌渣如平菇菌渣中是否含有化合物dankasterone b。
[0089]
具体方法如下：
[0090]
首先，取平菇菇渣(周边种植户提供)若干，晒干后，称取100g菇渣，用乙酸乙酯提取，经减压浓缩，得到5g膏体；随后，称取0.5克样品，溶于3ml乙酸乙酯溶液，送lcms分析，安捷伦液相谱g6500系列、四级杆-飞行时间质谱联用仪(agilent/1260+6530)。
[0091]
谱条件与分离梯度表参见上面实施例1.4中所述，其中，流速更换为：5ml/min。
[0092]
粗品分析质谱图如图9a所示。从图9a中可以看出，在其他食用菌菌渣中，在相应的时间段内，未检测到目标物ms值425/449/472/875。
[0093]
比较例2食用菌子实体中关于化合物dankasterone b的检测
[0094]
在本比较例2中，通过如比较例1中所述的方法检测了市售食用菌如金针菇、平菇(pleurotus ostreatus)、海鲜菇(hypsizygus marmoreus(peck)h.e.bigelow)的子实体中是否含有化合物dankasterone b。
[0095]
结果如图9b-d所示。从图9b-d中可以看出，在食用菌如金针菇、平菇、海鲜菇的子实体中，在相应的时间段内，未检测到dankasterone b的特征图谱(ms值为425/449/472/875)。
[0096]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：

1.一种真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其中，所述真菌为flammulina属或collybia属真菌。2.根据权利要求1所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述flammulina属或collybia属真菌为金针菇(flammulina velutipes)或者(collybia velutipes)。3.根据权利要求1所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述真菌菌渣物质为至少含有flammulina属或collybia属真菌菌渣的物质。4.根据权利要求3所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述真菌菌渣为，在采收flammulina属或collybia属真菌子实体后剩余的包括部分真菌残料的培养基，和/或，在采收flammulina属或collybia属真菌子实体后剩余的除去真菌残料的培养基。5.根据权利要求4所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述真菌子实体的采收期为：从接菌种之日起算50-60天后采收。6.根据权利要求4所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述培养基为固体，或者，为能够实现flammulina属或collybia属真菌子实体生长的液体或者半固体。7.根据权利要求4所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述培养基至少以含有淀粉的物质为碳源。8.根据权利要求7所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述含有淀粉的物质为可溶性淀粉物质，或者为选自玉米芯、玉米粉、马铃薯、米糠、啤酒糟、豆渣、豆饼粉、高粱粉中的一种或几种。9.根据权利要求7所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述培养基包括玉米芯、米糠、麸皮和/或棉籽壳、豆渣、海藻渣、甜菜浆和碳酸钙。10.根据权利要求9所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述培养基中各组分的质量百分比为：玉米芯40-50％，米糠30-40％，麸皮和/或棉籽壳2-4％，豆查5-6％，海藻渣5-6％，甜菜浆4-5％和碳酸钙2-3％。11.根据权利要求1所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述真菌菌渣物质为至少含有来源于所述真菌菌渣的含有化合物dankasterone b的混合物的物质。12.根据权利要求3或11所述的真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone b方面的用途，其特征在于，所述真菌菌渣物质还含有采收到的flammulina属或collybia属真菌子实体。13.一种含有化合物dankasterone b的真菌菌渣物质在制备抗肿瘤药物或者保健食品方面的用途，其中，所述真菌为flammulina属或collybia属真菌。

技术总结

本发明提供了一种真菌菌渣物质在获取化合物dankasterone B方面的用途，以及含有化合物dankasterone B的真菌菌渣物质在制备抗肿瘤药物或者保健食品方面的用途，其中，所述真菌为Flammulina属或Collybia属真菌。相较于现有技术中获取dankasterone B时通常使用的生物发酵方法，本发明实现了真菌菌渣废料利用，即使得通常仅作为饲料肥料或被填埋燃烧的Flammulina属或Collybia属真菌(尤其是金针菇)菌渣得到了附加值更高的有效利用，从而提高了资源的综合利用，并且极大地降低了成本。并且极大地降低了成本。