一种融合的病毒抗原及其重组亚单位疫苗的制作方法

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1.本发明属于医药技术领域，涉及一种融合的病毒抗原及其重组亚单位疫苗。

背景技术：

2.新型冠状病毒(covid-19)属于冠状病毒科冠状病毒属，是有囊膜的正链rna 病毒,于2020年1月12日被世界卫生组织正式命名，是目前已知的能感染人的第七种冠状病毒。其中hcov-nl63、hcov-229e、hcov-oc43和hku1引起感冒的症状，另外三种则对全球造成巨大的威胁：严重呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、2012年爆发并持续至今的中东呼吸综合征冠状病毒 (mers-cov)以及新型冠状病毒。人感染2019-ncov病毒的潜伏期一般为1-14天。感染病毒的人会出现程度不同的症状，有的只是发烧或轻微咳嗽，有的会发展为肺炎，有的则更为严重甚至死亡。该病毒的致死率约为2～4％。因此，开发一种安全有效的针对新型冠状病毒的疫苗就有着重要的意义。
3.新型冠状病毒表面的刺突蛋白(s蛋白)在体内可以被分成s1和s2两个亚基。其中s1亚基中包括一段信号肽sp(signal peptides)、ntd(n-terminal domain)和 rbd(receptor-binding domain)三个部分，其中rbd主要负责和宿主细胞的受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合。s2亚基包括fp区域(fusion peptide domain)、2 个七肽重复区域(heptad-repeat domain，hr1和hr2)、跨膜域以及c末端结构域，负责将病毒和宿主的细胞膜融合，从而将病毒的遗传信息导入宿主细胞中。其中 hr1构建出了s蛋白的三聚结构，而hr2则可以和hr1形成的三聚结构继续形成六聚的螺旋结构，进而通过跨膜区域将病毒的遗传信息导入宿主细胞内。
4.rbd主要负责和ace2结合，被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域，rbd蛋白作为疫苗抗原能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。但是rbd的突变体比较多，目前已知的新冠病毒的突变体大部分集中在rbd上因此以rbd蛋白为主的疫苗专一性高，但是无法快速适应目前新冠病毒的变异株。hr1和hr2是构成s蛋白聚体结构的主要部分，而且hr1和hr2在β冠状病毒中是相对保守的，很少有突变。hr1 和hr2可以形成天然的新冠病毒s蛋白的三聚体；并且hr1和hr2本身做为β冠状病毒疫苗的有效抗原靶区，也能为刺激机体产生针对融合细胞膜之前的螺旋结构产生新的广谱中和抗体，做为疫苗，针对目前新增的变异株减少对宿主的感染提供进一步的保证。
5.新型冠状病毒疫苗的靶抗原一般都是采用全长s蛋白和截短型s蛋白(s1和 rbd)形式。国内新型冠状病毒疫苗在研的种类包括腺病毒载体疫苗、mrna疫苗、dna疫苗、重组蛋白疫苗和灭活疫苗。
6.新冠亚单位疫苗使用重组蛋白作为抗原对人体进行免疫，因为重组蛋白中不含有病毒的核酸序列，所以亚单位疫苗具有安全性高且易于放大生产等特点。另外，亚单位疫苗相对mrna疫苗更加稳定，一般不需要苛刻的保存条件，便于广泛接种。但是亚单位疫苗因为仅使用部分病毒来源的重组蛋白作为抗原免疫，相对于其它类型疫苗可能免疫反应有时不
够强烈，所以通常要加入佐剂来提高其免疫效果。
7.目前已经批准上市或者正处于临床阶段的蛋白亚单位疫苗主要有两种：
8.一种是新冠病毒刺突蛋白受体结合区rbd串联形成的二聚体，使用cho细胞表达。根据公开信息显示，该疫苗对易感人具备较高的保护率，且安全性较高。但是需要注射三针，较多的注射频次会增加生产成本并影响完全接种率。另外，该疫苗因为仅含有rbd区域，因此理论上对于某些rbd突变的新冠病毒毒株可能效果会减弱。
9.另一种是新冠刺突蛋白融合trimer tag而形成稳定的三聚体蛋白，免疫时使用 cpg 1018加铝佐剂，也使用cho细胞表达。由于新冠刺突蛋白分子量巨大且具备大量糖基化位点，所以该疫苗生产工艺复杂，成本较高。目前该疫苗正处于临床iii期研究中。

技术实现要素：

10.为了解决目前重组亚单位疫苗中存在的生产成本高、免疫滴度弱和产生的中和抗体单一等问题，本发明旨在提供一种新的疫苗形式，该形式的疫苗具有增强的免疫原性，可以同时产生两种类型的中和抗体，且具有全天然的病毒序列。
11.为实现上述目的，本发明第一个方面提供了一种融合的病毒抗原，其含有第一病毒来源的蛋白vp(virus protein)以及第二病毒的heptad重复区域hr1和/或hr2，其中第一病毒来源的蛋白vp指人体或动物体会对其产生病毒中和抗体的蛋白，第二病毒指其hr1可形成三聚体结构，且与同来源的hr2可进一步相互作用形成六聚体结构的病毒。进一步，所述第一病毒与所述第二病毒可相同或不同。
12.进一步，所述第一病毒来源的蛋白vp与第二病毒的hr1和/或hr2之间通过连接序列l相连，所述连接序列l由0个或任意个数的氨基酸残基组成。
13.在本发明的较佳实施方式中，所述融合的病毒抗原的连接形式可选自以下任意一种：vp-l-hr1、hr1-l-vp、vp-l-hr2、hr2-l-vp、vp-l1-hr1-l2-hr2、vp-l1
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hr2-l2-hr2、hr1-l1-hr2-l2-vp、hr2-l1-hr1-l2-vp、vp-l1-hr1-l2-vp、vp
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l1-hr2-l2-vp，其中l、l1、l2由0个或任意个数的氨基酸残基组成，l1与l2可以相同或不同，序列的连接方向为从n端至c端。
14.本发明所述的融合的病毒抗原由于引入了第二病毒的heptad重复区域hr1和/或 hr2，使其容易形成三聚或六聚结构，如图9所示，a为vp-l-hr1形成的三聚体结构示意图，b为三个vp-l1-hr1-l2-hr2在hr区域形成六聚结构的示意图，c为 vp-l-hr2的单体结构示意图，d为三个vp-l-hr1与三个vp-l-hr2聚合成的六聚体结构示意图。因此，本发明进一步提供了一种寡聚体，该寡聚体包括上述融合的病毒抗原中的任意一种或几种，组成所述寡聚体的单体数量为2～10个，优选为3个或 6个。
15.当本发明所述融合的病毒抗原是一种融合的冠状病毒抗原时，所述vp优选为冠状病毒s蛋白，更优选为冠状病毒s蛋白的受体结合区域rbd；但由于s蛋白和 rbd的突变体比较多，因此这里所述的s蛋白包括原有的天然s蛋白及其天然突变体，rbd包括原有的天然rbd及其天然突变体；所述突变体与突变前序列具有至少 70％的序列同源性，且至少保留突变前序列的抗原性。
16.优选地，所述冠状病毒抗原为新型冠状病毒抗原，所述vp为新型冠状病毒s蛋白的受体结合区域covid-19rbd。
17.在本发明的一种较佳实施方式中，所述融合的冠状病毒抗原的连接形式可选自以下任意一种：rbd-l-hr1、hr1-l-rbd、rbd-l-hr2、hr2-l-rbd、rbd-l1-hr1
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l2-hr2、rbd-l1-hr2-l2-hr2、hr1-l1-hr2-l2-rbd、hr2-l1-hr1-l2-rbd、 rbd-l1-hr1-l2-rbd、rbd-l1-hr2-l2-rbd，其中l、l1、l2由0个或任意个数的氨基酸残基组成，l1与l2可以相同或不同，序列的连接方向为从n端至c端。
18.本发明的另一种实施方式提供了一种融合的新型冠状病毒抗原，其含有新型冠状病毒s蛋白的受体结合区域rbd(covid-19rbd)以及冠状病毒的heptad重复区域hr1和/或hr2，两者之间通过由0个或任意个数的氨基酸残基组成的连接序列l 相连。其连接形式优选为covid-19rbd-l-hr1、covid-19rbd-l-hr2或 covid-19rbd-l1-hr1-l2-hr2。
19.进一步，所述covid-19rbd包含：genbank登录号为mn908947.3的s蛋白 (seq id no.9)的第319～550位氨基酸序列(seq id no.10)、第912～990位氨基酸序列(seq id no.11)以及第1168～1203位氨基酸序列(seq id no.12)，或该段氨基酸序列的天然突变体；所述突变体与突变前序列具有至少70％的序列同源性，且至少保留突变前序列的抗原性。
20.可选地，所述突变体包含突变点c538s、c538a、s477n、t478k、n439k、 e484q、l452r、l452q、f490s、n501y、n354d、d364y、v367f、w436r、 i358f、y365f、y365w以及f392w中的一个或多个。
21.优选地，所述融合的新型冠状病毒抗原包含如seq id no.3、seq id no.4、 seq id no.7或seq id no.8所示的序列。
22.优选地，所述hr1和/或hr2为冠状病毒的heptad重复区域hr1和/或hr2，更优选为新型冠状病毒的heptad重复区域hr1和hr2。
23.进一步，上述任意一种或几种融合的新型冠状病毒抗原可形成寡聚体，优选为三聚或六聚。
24.本发明第二个方面提供了一种编码上述融合的病毒抗原的核酸分子；优选地，所述融合的病毒抗原为融合的冠状病毒抗原，更优选为融合的新型冠状病毒抗原。
25.进一步，本发明还提供了包含上述核酸分子的载体，以及包含该载体的基因工程细胞。
26.本发明第三个方面提供了一种重组亚单位疫苗，包括上述融合的病毒抗原，该疫苗还包括可药用赋形剂。
27.优选地，所述疫苗中的抗原为融合的冠状病毒抗原，进一步优选为融合的新型冠状病毒抗原，选自上述融合的新型冠状病毒抗原中的任意一种或几种。
28.优选地，所述疫苗中的融合的病毒抗原为寡聚体，进一步优选为三聚体或六聚体。
29.本发明第四个方面提供了上述融合的病毒抗原的制备方法，包括步骤：对编码所述融合的病毒抗原的核酸分子进行克隆，筛选正确的重组子，然后转染重组细胞进行表达，表达后纯化即得到融合的病毒抗原。
30.优选地，所述重组细胞可选自昆虫细胞、真核细胞和原核细胞。其中所述昆虫细胞包括但不限于：昆虫细胞sf9、昆虫细胞系hi5，所述真核细胞包括但不限于： cho细胞、vero细胞、hek293细胞、expi293细胞，所述原核细胞包括但不限于：大肠杆菌、棒状杆菌、枯草芽孢杆菌。
31.进一步，上述制备方法中所述纯化可包括步骤：
32.1)将表达所述抗原的细胞上清液过滤除去细胞碎片，或细菌包涵体先变性后复性；
33.2)通过阴离子交换柱以流穿模式去除杂质和多聚体，对目的蛋白进行粗纯；
34.3)含有目的蛋白的组分经过ph调节后上样阳离子交换柱，进行盐梯度洗脱，将得到的含有目标蛋白的洗脱峰合并。
35.进一步，当纯化细菌包涵体时，上述步骤还可包括：4)用孔径适当的膜截留浓缩；此外，上述步骤还可包括：5)用疏水层析柱进一步纯化及浓缩。
36.优选地，步骤1)中所述细菌包涵体变性所用变性剂为6～8m的尿素或5～7m的盐酸胍，ph值为7～10，温度为室温；优选地，变性液含有20～50mm的dtt。
37.优选地，步骤1)中所述细菌包涵体在复性液中的浓度为0.1-1mg/ml。
38.优选地，步骤1)中复性所用复性液中含有尿素2～5m或盐酸胍1.5～4m；复性液中使用的还原剂选自谷胱甘肽、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺中的一种或几种，氧化剂在复性液中的浓度优选为0.05～0.5mm，还原剂在复性液中的浓度优选为0.05～2mm；复性温度优选为4～10℃，复性时间优选为16～60小时。
39.优选地，步骤2)中所述阴离子交换柱选自cytiva公司的q sepharosebigbeads、q sepharose fastflow，东曹公司的toyopearl q-550c、toyopearl q
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650m，博格隆公司的q bestaroseff。
40.优选地，步骤3)中所述阳离子交换柱选自cytiva公司的sp sepharose hp、 source 30s，merck公司的eshmuon cps，东曹公司的toyopearl sulfate-650f，博格隆公司的sp bestarose hp。
41.优选地，步骤3)中所述ph调节至4.0～5.0。
42.优选地，步骤4)中所述孔径适当的膜为密理博公司的10kda mwco膜。
43.优选地，步骤5)中所述疏水层析柱所用填料选自cytiva公司的phenylsepharose fastflow(highsub)、phenyl sepharose fastflow(lowsub)、butyl sepharosefastflow,博格隆公司的phenyl bestarose ff(hs)、butyl bestarose4 fastflow。
44.本发明第五个方面提供了前述三聚体的制备方法，包括将纯化后的含有vp和 hr1的融合的病毒抗原溶于溶液中。
45.进一步，前述六聚体的制备方法可包括步骤：将纯化后的含有vp和hr1的融合的病毒抗原溶于溶液中形成三聚体，然后将含有vp和hr2的融合的病毒抗原按一定比例加入，其中含有vp和hr1的融合的病毒抗原与含有vp和hr2的融合的病毒抗原的比例优选为1:2～1:5，最优选为1:3。
46.在本发明的一种较佳实施方式中，融合的冠状病毒抗原的六聚体制备方法包括步骤：将纯化后的rbd-l-hr1溶解在溶液中形成三聚体，然后按一定比列加入rbd
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l-hr2使其混合，即可在溶液中迅速形成六聚体。进一步可以通过阳离子柱纯化去除多余的rbd-l-hr1或rbd-l-hr2。
47.本发明第六个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如上所述的融合的病毒抗原或其寡聚体，以及药学上可接受的赋形剂。
48.进一步，本发明还提供了所述融合的病毒抗原或其寡聚体在制备病毒感染药
物中的应用。
49.本发明开发了一种基于病毒作用区域以及天然β冠状病毒的heptad重复区域设计及重组构建表达，形成三聚或六聚结构的新方法，从而提供了一种新的重组亚单位疫苗，该疫苗具有以下有益技术效果：
50.1)针对目前重组亚单位疫苗生产成本高的问题，本发明中的亚单位疫苗可同时使用廉价的原核大肠杆菌表达或者哺乳动物细胞表达，且该亚单位疫苗结构简单，易于纯化制备，生产成本较低；
51.2)针对亚单位疫苗产生的中和抗体类型单一的问题，本发明中的亚单位疫苗可同时诱导产生针对vp和hr的两种中和抗体，大大降低了因为病毒突变而导致疫苗效力减弱的风险；
52.3)针对单一的vp免疫效价低的问题，本发明通过融合vp和hr而形成三聚体或者六聚体，从而大大提高了免疫的效价；
53.4)本发明中所用的序列均为病毒来源的序列，不涉及任何的外源序列。
54.本发明在新型冠状病毒疫苗的应用方面提供了天然rbd-hr1/hr2寡聚体新冠疫苗，克服了rbd单体免疫原性不足的缺点，大大提高了小鼠针对2019-ncov的中和抗体产生的滴度。同时，由于同时使用了rbd和hr1、hr2作为抗原，理论上该疫苗能够同时诱导产生针对rbd和hr区域的两种不同类型的中和抗体，这对增加疫苗的有效性和对抗病毒的快速突变有积极作用。
55.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
56.图1是实施例1中covid-19重组rbd抗原在大肠杆菌工程菌中表达结果的电泳图，其中箭头所指是分别是rbd-hr1和rbd-hr2的蛋白条带，bi为未诱导表达样品，m为marker，s为表达样品超声后的上清，p为表达样品超声后的沉淀；
57.图2是实施例2中covid-19重组rbd抗原在expi293重组细胞中表达结果的电泳图，其中箭头所指是分别是rbd-hr1和rbd-hr2的蛋白条带，nr为非还原 (non-reducing)状态上样，r为还原(reducing)状态上样；
58.图3是实施例3中sec-hplc的结果图；
59.图4是实施例4中纯化后蛋白和ace2结合实验的结果图；
60.图5是实施例6中抗rbd抗体滴度结果统计图；
61.图6是实施例7中假病毒中和活性结果统计图；
62.图7是实施例8中使用spr的方法检测免疫后小鼠血清中含有的抗hr1、hr2 抗体的结果统计图；
63.图8是实施例9中使用elisa方法检测部分小鼠血清中抗hr1和抗hr2抗体的滴度结果统计图；
64.图9是含有病毒的作用区域vp和hr1、hr2的融合抗原的单体、三聚体、六聚体的结构示意图。
具体实施方式
65.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
66.实施例1表达covid-19重组rbd抗原的大肠杆菌工程菌的制备
67.本实施例中，对covid-19重组rbd抗原进行了基因合成及大肠杆菌表达。
68.委托苏州金唯智生物科技有限公司合成原核covid-19rbd-hr1(seq idno.1)和原核covid-19rbd-hr2的基因(seq id no.2)，并克隆到pet41a载体的ndei和xhoi位点之间，从而得到表达所用质粒。按照《分子克隆》提到的操作方法，进行质粒提取，转化表达菌株bl21(de3)。按照生物蛋白原核表达常规方法进行covid-19重组rbd抗原的表达。表达的目的蛋白序列是seq id no.3和seq idno.4。
69.表达结果如图1所示，蛋白表达成功，而且都是包涵体表达。
70.实施例2表达covid-19重组rbd抗原的expi293重组细胞的制备
71.本实施例中，对covid-19重组rbd抗原进行了基因合成及expi293细胞重组表达。
72.委托苏州金唯智生物科技有限公司合成真核covid-19rbd-hr1基因(含有信号肽)(seq id no.5)和真核covid-19rbd-hr2的基因(含有信号肽)(seq idno.6)，并克隆到pzd载体的ecori和hindiii位点之间，从而得到表达所用质粒。按照《分子克隆》提到的操作方法，进行转化克隆菌株dh10b和质粒大提。按照生物蛋白expi293细胞瞬时表达常规方法进行covid-19重组rbd抗原的表达，表达的目的蛋白序列(不包含信号肽序列)是seq id no.7和seq id no.8。
73.表达结果如图2所示，蛋白表达成功，而且表达量都较高。
74.实施例3covid-19重组rbd-hr1和rbd-hr2抗原大肠杆菌或细胞表达的纯化及鉴定
75.将实施例1中的大肠杆菌表达菌体，以1:20(w/v)重悬于ph 8.0的tris缓冲液中，用高压匀浆仪900bar
×
3次破碎后离心得到包涵体。将包涵体用20mm乙二醇、8m尿素、50mm dtt，ph 8.0溶解变性，然后将其以0.1-1mg/ml的终浓度加入到含20mm tris(ph 8.0)、3m尿素、0.05mm胱胺、1mm半胱胺的复性液中复性20小时。调节复性上清液ph值到7.0，用10000
×
g离心1小时，取上清液通过 cytiva q sepharose fastflow以流穿模式纯化去除hcp(宿主蛋白，host cell protein) 和多聚体，对目标蛋白进行粗纯；然后将流穿液ph值调节到5.0，用cytiva spsepharose hp以结合模式做进一步精细纯化，目标蛋白用1m nacl梯度洗脱，合并含有目标蛋白的洗脱峰，用密理博10kda mwco膜截留浓缩并换液到2
×
pbs缓冲液中。sec-hplc的结果如图3所示，rbd-hr1样本的峰出现在大于158kd处，说明形成了三聚体，rbd-hr1和rbd-hr2混合样本的峰出现在158kd和670kd之间且大于rbd-hr1样本峰，说明形成了六聚体，而rbd-hr2样本只有小于100kd的单体峰。因此可以得出结论，rbd-hr1可以形成三聚体，而rbd-hr1和rbd-hr2 按一定比例混合可以形成六聚体。
76.将实施例2中的表达所述抗原的细胞上清液过滤除去细胞碎片。细胞上清液调节 ph至7.0，通过cytiva q fastflow阴离子交换柱以流穿模式去除hcp和多聚体对目的蛋白进行粗纯，流穿液调节ph至4.0后上样阳离子交换柱cytiva sp sepharose hp 进一步精细纯化，用1m nacl溶液进行梯度洗脱，合并含有目标蛋白的洗脱峰，并换液到2
×
pbs缓冲液中。通过sec-hplc同样可以得出结论(如图3所示)，rbd
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hr1可以形成三聚体，而rbd-hr1和
rbd-hr2的按一定比例混合可以形成六聚体。
77.实施例4纯化后的蛋白与ace2的结合实验(spr/fortebio)
78.用超纯水预湿ar2g biosensor 10分钟，将20mm edc和10mm s-nhs混合用于激活ar2g biosensor，将实施例3中制备的蛋白用ph 6的10mm醋酸缓冲液稀释为50μg/ml，用于固定在ar2g biosensor表面。将ar2g biosensor浸入ph 8.5的1 m乙醇胺洗脱未固定的rbd。将固化有rbd的ar2g biosensor转移至1
×ꢀ
pbs+0.05％tween 20的缓冲液中平衡，再将ar2g biosensor转移至用缓冲液(1
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pbs+0.05％tween 20)稀释的rhace2中，稀释浓度分别为200nm、100nm、50 nm、25nm。结合后将ar2g biosensor转移至1
×
pbs+0.05％tween 20的缓冲液中进行解离。每个步骤具体情况详见下表：
79.步骤步骤名称试剂反应时间1平衡h2o600s2激活edc/s-nhs300s3固化rbd600s4洗脱1m乙醇胺300s5平衡1
×
pbs+0.05％tween20120s6结合rhace2120s7解离1
×
pbs+0.05％tween20300s
80.结果如图4所示，本发明所生产出的三聚体rbd相较于单体rbd与重组人 ace2蛋白具有更高的亲和力。
81.实施例5小鼠免疫实验
82.实施例3中制备的免疫原与铝佐剂(alhydrogel cas no:21645-51-2， invivogen)混合形成含0.1mg/ml抗原及1.25mg/ml氢氧化铝的悬浊液用于动物免疫接种。4～6周龄balb/c雌性小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司，经检验及驯养选择合格且体重相近的40只动物进入实验，分为5组，分别为阴性对照组，4 个待测样品组(rbd单体、rbd-hr1三聚体、rbd-hr1+rbd-hr2六聚体、rbd 二聚体)。
83.动物每2周接种一次，共接种三次，分别在第1、15、29天进行。每次向动物后肢肌肉注射10μg/0.1ml抗原，阴性对照组注射等体积氯化钠注射液。在第1天接种前、第14、28天采用异氟烷麻醉动物，经眼眶静脉丛取血；第43天安乐死时由后腔静脉采血；离心后取血清保存于-80℃用于后续检测。
84.实施例6小鼠血清中的不同类型中和抗体的检测实验(elisa)
85.血清特异性抗rbd抗体检测
86.按照每孔50ng rbd包被酶标板，用含3％bsa的dpbs-t溶液于37℃封闭1小时，洗涤3次后拍干。用稀释液(含1％bsa的dpbs)稀释待测血清，各组动物首次接种前样本以1:100稀释，阴性对照组样本均以1:100稀释，其他组均按8种稀释倍数进行稀释，分别为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:6400、1:25600和 1:102400，加样量100μl/孔，37℃孵育约1小时。洗板6次后拍干。将兔抗小鼠igg-hrp用稀释液稀释20000倍，混匀后按100μl/孔加入酶标板中，37℃孵育约1 小时。洗板6次后拍干。加入tmb显液100μl/孔，室温避光孵育约10分钟。加入终止液50μl/孔，450nm测定od值。
87.将同期阴性对照组血清样本od值的平均值乘以2.1作为cut-off值，计算血清抗体
滴度。
88.实验结果如图5所示，显示不同免疫原均使小鼠产生了抗rbd抗体，免疫次数的增加会提高血清抗体滴度。且含有hr区域的免疫原能够诱导更多抗rbd抗体产生。
89.实施例7小鼠血清假病毒实验
90.参考nie j等在nature protocol中发表的方法构建新冠病毒covid-19及其突变株 delta、lambda的假病毒(nature protocol,2020,11；15(11):3699-3715)。
91.将待测血清置于56℃水浴中灭活30分钟，使用dmem完全培养基稀释60倍，并进行3倍梯度稀释至14580倍。使用dmem完全培养基将假病毒稀释至1.3
×
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4 tcid50/ml，每100μl稀释血清与50μl假病毒混匀，使血清稀释倍数为90～21870 倍，每孔的假病毒量为650tcid50/孔，置于细胞培养箱中(37℃、5％co2)孵育1 小时。
92.将汇合率达80％～90％的vero细胞消化计数后用dmem完全培养基稀释到2
×
105个/ml，向上述血清及假病毒板中每孔加入100μl，放入培养箱中，37℃、5％co2培养24小时。
93.培养完成后用多道移液器从每孔中吸弃150μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2分钟。反应结束后，于平板振荡器震荡混匀，放入多功能读板机中读取发光值.
94.实验结果如图6所示，显示本发明所示的4种免疫原诱导小鼠产生的抗体能有效阻断加病毒感染vero细胞，有较好的中和活性，而且rbd-hr1形成的三聚体和 rbd-hr1+rbd-hr2形成的六聚体所产生的抗体显示出更高的中和活性。
95.实施例8使用spr方法检测免疫后小鼠血清中含有的抗hr1或者抗hr2抗体
96.本实验是使用biacore-spr 8k系统检测免疫后的小鼠血清中是否含有抗hr1或者抗hr2的抗体。具体实验步骤如下：1.使用ge公司生产的cm5芯片，按照该公司提供的说明书方法，在酸性缓冲溶液中，将fc-hr1或者fc-hr2融合蛋白固定于 cm5芯片上(其中fc为人免疫球蛋白igg4的保守区fc片段)，固定量为10000ru 左右。使用的流动体系为含有0.05％吐温-20的pbs缓冲液。2.将小鼠血清10000转离心10分钟后取上清并用pbs稀释200倍。将稀释后的小鼠血清装入标准96孔板后，使用spr检测其是否含有能和hr1或者hr2结合的抗体。
97.实验结果如图7，经过rbd-hr1免疫的小鼠均检测到有抗hr1抗体产生，而其它小鼠没有检测到有抗hr1抗体产生。另外，所有小鼠均没有检测到有抗hr2抗体产生。
98.实施例9使用elisa方法测定部分免疫后小鼠血清中抗hr1和抗hr2的滴度
99.为了进一步验证rbd-hr1三聚体能够诱导小鼠产生抗hr1的抗体，所以我们选取了部分小鼠的血清进行了elisa实验，以测定其中小鼠血清中抗hr1或者抗hr2 抗体的滴度。在该实验中，使用ph 9.6碳酸氢钠缓冲液将fc-hr1或者fc-hr2包被于96孔板中，加入不同稀释度的血清后使用3％bsa封闭后经洗板机洗涤。最后将 hrp-山羊抗小鼠二抗1:20000进行稀释，37度结合1小时。经洗板机洗涤后每孔加入100μl tmb，10-20分钟后终止实验，读数时使用450/630双波长检测。该实验结果如图8所示，结果显示，随机选择的两个rbd-hr1三聚体免疫的小鼠经大约 50000倍稀释后仍然可检测到读数，表明产生的较多的抗hr1抗体。本实验未检测到抗hr2抗体存在。
100.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的
技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：

1.一种融合的病毒抗原，其特征在于，含有第一病毒来源的蛋白vp以及第二病毒的heptad重复区域hr1和/或hr2，其中所述第一病毒来源的蛋白vp指人体或动物体会对其产生病毒中和抗体的蛋白，所述第二病毒指其hr1可形成三聚体结构，且与同来源的hr2可进一步相互作用形成六聚体结构的病毒。2.如权利要求1所述的融合的病毒抗原，其特征在于，所述vp与所述hr1和/或hr2之间通过连接序列l相连，所述连接序列l由0个或任意个数的氨基酸残基组成。3.如权利要求2所述的融合的病毒抗原，其特征在于，连接形式选自以下任意一种：vp-l-hr1、hr1-l-vp、vp-l-hr2、hr2-l-vp、vp-l1-hr1-l2-hr2、vp-l1-hr2-l2-hr2、hr1-l1-hr2-l2-vp、hr2-l1-hr1-l2-vp、vp-l1-hr1-l2-vp、vp-l1-hr2-l2-vp，其中l、l1、l2由0个或任意个数的氨基酸残基组成。4.如权利要求1所述的融合的病毒抗原，其特征在于，所述vp为冠状病毒s蛋白，所述s蛋白包括原有的天然s蛋白及其天然突变体。5.如权利要求1所述的融合的病毒抗原，其特征在于，所述vp为冠状病毒s蛋白的受体结合区域rbd，所述rbd包括原有的天然rbd及其天然突变体。6.如权利要求5所述的融合的病毒抗原，其特征在于，所述rbd与所述hr1和/或hr2之间的连接形式选自以下任意一种：rbd-l-hr1、hr1-l-rbd、rbd-l-hr2、hr2-l-rbd、rbd-l1-hr1-l2-hr2、rbd-l1-hr2-l2-hr2、hr1-l1-hr2-l2-rbd、hr2-l1-hr1-l2-rbd、rbd-l1-hr1-l2-rbd、rbd-l1-hr2-l2-rbd，其中l、l1、l2由0个或任意个数的氨基酸残基组成。7.如权利要求1所述的融合的病毒抗原，其特征在于，所述vp为新型冠状病毒s蛋白的受体结合区域covid-19rbd，所述covid-19rbd包括原有的天然covid-19rbd及其天然突变体。8.如权利要求1所述的融合的病毒抗原，其特征在于，所述hr1和/或hr2为冠状病毒的heptad重复区域hr1和/或hr2。9.一种融合的新型冠状病毒抗原，其特征在于，含有covid-19蛋白的受体结合区域covid-19rbd以及冠状病毒的heptad重复区域hr1和/或hr2，两者之间通过由0个或任意个数的氨基酸残基组成的连接序列l相连。10.如权利要求9所述的融合的新型冠状病毒抗原，其特征在于，连接形式为covid-19rbd-l-hr1、covid-19rbd-l-hr2或covid-19rbd-l1-hr1-l2-hr2。11.如权利要求9所述的融合的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述covid-19rbd包含genbank登录号为mn908947.3的s蛋白的第319～550位氨基酸序列、第912～990位氨基酸序列以及第1168～1203位氨基酸序列，或该段氨基酸序列的天然突变体。12.如权利要求11所述的融合的新型冠状病毒抗原，其特征在于，所述突变体包含突变点c538s、c538a、s477n、t478k、n439k、e484q、l452r、l452q、f490s、n501y、n354d、d364y、v367f、w436r、i358f、y365f、y365w以及f392w中的一个或多个。13.如权利要求11所述的融合的新型冠状病毒抗原，其特征在于，包含如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.7或seq id no.8所示的序列。14.一种寡聚体，其特征在于，包括如权利要求1-13中任一项所述的融合的病毒抗原或融合的新型冠状病毒抗原。15.如权利要求14所述的寡聚体，其特征在于，组成所述寡聚体的单体数量为2～10个。
16.如权利要求14所述的寡聚体，其特征在于，所述寡聚体为三聚体或六聚体。17.一种核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1-13中任一项所述的融合的病毒抗原或融合的新型冠状病毒抗原。18.一种载体，其特征在于，含有如权利要求17所述的核酸分子。19.一种基因工程细胞，其特征在于，其含如有权利要求18所述的载体。20.一种重组亚单位疫苗，其特征在于，包括如权利要求1-13中任一项所述的融合的病毒抗原或融合的新型冠状病毒抗原以及可药用赋形剂。21.一种重组亚单位疫苗，其特征在于，包括如权利要求14-16中任一项所述的寡聚体以及可药用赋形剂。22.如权利要求1-8中任一项所述的融合的病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括步骤：对编码所述融合的病毒抗原的核酸分子进行克隆，筛选正确的重组子，然后转染重组细胞进行表达，表达后纯化即得到融合的病毒抗原。23.如权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述重组细胞选自昆虫细胞、真核细胞和原核细胞。24.如权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞包括昆虫细胞sf9、昆虫细胞系hi5，所述真核细胞包括cho细胞、vero细胞、hek293细胞、expi293细胞，所述原核细胞大肠杆菌、棒状杆菌、枯草芽孢杆菌。25.如权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括步骤：1)将表达所述抗原的细胞上清液过滤除去细胞碎片，或细菌包涵体先变性后复性；2)通过阴离子交换柱以流穿模式去除杂质和多聚体，对目的蛋白进行粗纯；3)含有目的蛋白的组分经过ph调节后上样阳离子交换柱，进行盐梯度洗脱，将得到的含有目标蛋白的洗脱峰合并。26.一种融合的冠状病毒抗原的六聚体的制备方法，其特征在于，包括步骤：将纯化后的rbd-l-hr1溶解在溶液中形成三聚体，然后按一定比列加入rbd-l-hr2使其混合。27.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-13中任一项所述的融合的病毒抗原或融合的新型冠状病毒抗原，或如权利要求14-16中任一项所述的寡聚体，以及药学上可接受的赋形剂。28.如如权利要求1-13中任一项所述的融合的病毒抗原或融合的新型冠状病毒抗原，或如权利要求14-16中任一项所述的寡聚体在制备病毒感染药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种基于第一病毒来源的蛋白(Virus protein，以下简称为VP)与第二病毒的heptad重复区域HR1和HR2融合形成的病毒抗原及其重组亚单位疫苗，其中第一病毒来源的蛋白VP指人体或动物体会对其产生病毒中和抗体的蛋白，第二病毒指其HR1可形成三聚体结构，且与同来源的HR2可进一步相互作用形成六聚体结构的病毒。该融合的病毒抗原可形成三聚或六聚结构，能显著提高宿主中和抗体的水平，并且能够同时产生针对VP和HR1或者HR2的中和抗体。制备方法简单、蛋白无纯化标签且易于纯化，无生物安全风险，能较快、低成本的应用于临床的使用。用。用。