检测三种肺炎病原体的引物探针组合和试剂盒的制作方法

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1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及检测三种肺炎病原体的引物探针组合和试剂盒。

背景技术：

2.世界卫生组织2019年发布的统计结果显示，世界十大死因中下呼吸道感染位列第四位。目前，下呼吸道感染仍是临床上最常见的疾病之一，主要是由细菌、病毒、真菌等病原菌引起的，其中细菌感染最常见，占80％以上。近年来，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，pa)院内感染特别突出，尤其是肺部感染的发病率不断增加，为医院内感染的重要病原菌之一。流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae，hi)，是引起儿童社区获得性肺炎的常见病原菌，尤其是b型流感嗜血杆菌的毒性最强，临床感染病例最多。大肠埃希菌(escherichia co1i，ec)，可引起尿路、呼吸道、血液、伤口感染，其中以呼吸道感染和尿路感染较为常见，其感染率呈逐年上升趋势。
3.由于呼吸道细菌感染的症状体征基本相同，均表现为发烧、咳嗽、打喷嚏等，但针对不同病原体的方法却大相径庭，比如不同的细菌所需要的抗菌素种类区别很大，有些可以自愈，有些则可能导致严重的并发症危及生命，有些甚至可能导致严重呼吸道传染病的迅速传播和爆发，因此在临床诊疗中尽快确定感染病原体的种类非常关键，这对于尽快采取特异性措施，从而减少药物滥用、为提高患者治愈率和存活率争取宝贵的时间，降低社会医疗负担和支出，乃至及早发现和排查新型突发性呼吸道传染病病原体都非常重要。
4.目前常用的检测方法细菌分离培养法，存在培养条件苛刻，难度大，耗时长等缺点；免疫检测法存在灵敏度或特异度不高，容易漏诊等缺点，会给临床带来一定困难。近年来，实时荧光pcr技术因特异性强、敏感度高、操作简单、省时等特点，已是当前主要的诊断手段。
5.但在目前的临床实践中，大多数采用单个靶标的病原体体检测，医生往往依据经验从可能性较高的病原体开始检查并逐步排除，但这种做法耗时长、高成本，加剧病人痛苦、贻误的最佳时机。为此，很多时候医生只能在没有明确病原学诊断的情况下盲目经验性给药，这又造成了药物滥用，增加了毒副作用和病原体耐药的机率，还造成医疗资源浪费，同时也无益于提高疗效。
6.正因为如此，国内外学者多年来一直致力于研发多靶标同时检测的技术，但目前很少有类似技术产品获得成功。原因在于很多对引物探针存在于一个反应体系中会导致难以想象的复杂局面：
7.首先，众所周知，如果引物探针之间存在数个连续的碱基互补，则很有可能在聚合酶作用下相互结合产生扩增延伸，导致大量的非特异假阳性扩增产物。而因为所有的dna只有四种碱基组成，故连续三个碱基与其它序列相同的概率为1/4
×
1/4
×
1/4＝1/64，显然随着引物探针数量的增加，发生不同序列间相互重叠的或互补的几率将迅速增加，甚至几乎
no:14所示，该片段为流感嗜血杆菌的omp6基因。seq id no.7～8所示引物对扩增的片段如seq id no:15所示，该片段为大肠埃希菌的ydij基因。seq id no.10～11所示引物对扩增的片段如seq id no:16所示，该片段为β-珠蛋白基因。
20.一些实施方案中，所述引物探针组合还包括：
21.检测内标基因的如seq id no:10～11所示的引物对；
22.检测内标基因的如seq id no:12所示的探针。
23.本发明中，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。具体地：
24.如seq id no.3所示探针的5’端连接fam荧光基团；
25.如seq id no.6所示探针的5’端连接rox荧光基团；
26.如seq id no.9所示探针的5’端连接cy5荧光基团；
27.如seq id no.12所示探针的5’端连接hex荧光基团。
28.本发明还提供了所述的引物探针组合在制备检测检测铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和/或大肠埃希菌的试剂盒中的应用。
29.本发明还提供了检测铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和/或大肠埃希菌的多重pcr荧光检测试剂盒，包括本发明上述的引物探针组合。
30.本发明提供的多重pcr荧光检测试剂盒还包括tricine、koac、tween20、甘油、dmso、甜菜碱、nan3、dntps、rtth酶、udg酶、醋酸锰、nan3和纯化水中的一种或几种。
31.一些实施方案中，本发明提供的试剂盒中，tricine的浓度为1m/l、koac的浓度为10m/l、10％的tween20、80％的甘油、100％的dmso、dntps的浓度为25mm、rtth酶的浓度为5u/ul、udg酶的浓度为2u/ul、醋酸锰的浓度为25mm。
32.本发明还提供了同时检测铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌及大肠埃希菌的方法，以本发明所述的多重pcr荧光检测试剂盒对样品进行realtime pcr检测，根据ct值判断样品是否存在铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌或大肠埃希菌。
33.一些实施方案中，所述判断的方法为：
34.seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9所示探针通道无荧光值，且seq id no.12所示探针通道的ct值≤35，报告检测结果为阴性；
35.seq id no.3、所示探针通道的ct值≤34，报告为铜绿假单胞菌阳性；
36.seq id no.6、所示探针通道的ct值≤34，报告为流感嗜血杆菌阳性；
37.seq id no.9、所示探针通道的ct值≤33，报告为大肠埃希菌阳性；
38.seq id no.3所示探针通道ct值皆≥34，但seq id no.12所示探针通道ct值≤35，报告铜绿假单胞菌样本浓度低于检测下限；seq id no.6所示探针通道ct值皆≥34，但seq id no.12所示探针通道ct值≤35，报告流感嗜血杆菌样本浓度低于检测下限；seq id no.9所示探针通道ct值皆≥33，但seq id no.12所示探针通道ct值≤35，报告大肠埃希菌样本浓度低于检测下限；
39.当seq id no.12所示探针通道ct值≥35，出现阴性对照有ct值或呈典型s扩增曲线、阳性对照无ct值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查并排除原因，并重复试验。
40.一些实施方案中，所述样品为痰液；所述real time pcr检测的体系包括：20ul反应液1、10ul反应液2和50ul样本核酸；
41.所述反应液1包括：
[0042][0043][0044]
所述反应液2包括：
[0045][0046]
一些实施方案中，所述real time pcr检测的程序包括：
[0047][0048]
本发明通过基于该序列组合的反应体系优化，调整了反应体系中的特定组分及其浓度和参数，从而进一步保证了检测的优异性能。具体表现为：dmso的加入及其特定浓度恰当的调整了反应溶液的导热性和表面张力，以保证该复杂扩增反应的均一性；甜菜碱作为温和的dna变性剂，其在该浓度下恰当的削弱了上述引物探针组合中g-c和a-t对tm值贡献的差异，使得这些引物探针的tm值趋向一致，从而有助于多靶标检测在同一个扩增温度循环下的扩增效率和特异性协调一致。另外，作为整合了反转录和dna聚合两种活性的rtth酶，其承担核酸识别和复制的活性部位构象存在特殊性，造成锰离子、镁离子、钾离子对激活其活性的作用效果存在差异，即三者对于反转录、dna复制，以及扩增特异性和扩增效率的影响各不相同。为此在本发明中通过特殊优化其配比和浓度，使这些特性也在上述引物探针组合中得到了均衡。同时，反应体系ph值对于不同引物探针的扩增特异性和扩增效率的影响也各不相同，在本发明中也经过了特定优化，使其适配上述引物探针组合。
[0049]
本发明提供的引物探针组合中，包括针对铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌的特异性引物对和探针。该引物探针组合具有良好的特异性，结合real time pcr检测方法，能够实现对pa/hi/ec的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明，本发明的引物探针的检测pa/hi/ec的最低检测限均为500copies/ml。并且，本发明提供的包含该引物和探针的试剂盒具有良好的稳定性，2～8℃保存3、6、9、12个月的试剂都可以实现对样品的稳定检测。
附图说明
[0050]
图1示实施例5中铜绿假单胞菌的扩增图；
[0051]
图2示实施例5中流感嗜血杆菌的扩增图；
[0052]
图3示实施例5中大肠埃希菌的扩增图；
[0053]
图4示实施例6中不同浓度样本下铜绿假单胞菌扩增图，其中，图4a为利用本发明实施例1的试剂盒进行检测的结果，4b为利用对照引物探针检测的结果；
[0054]
图5示实施例6中不同浓度样本下流感嗜血杆菌的扩增图，其中，图5a为利用本发明实施例1的试剂盒进行检测的结果，5b为利用对照引物探针检测的结果；
[0055]
图6示实施例6中不同浓度样本下大肠埃希菌的扩增图，其中，图6a为利用本发明实施例1的试剂盒进行检测的结果，6b为利用对照引物探针检测的结果。
具体实施方式
[0056]
本发明提供了检测小儿肺炎的三种肺炎病原体的引物探针组合和试剂盒，本发明提供具体的实施方案，进一步阐述本发明的技术方案，此处所述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。特别需要指出的是，所有类似的变更组合、替换和改动均视为本发明。
[0057]
本发明的耗材、仪器均为市场上普通售品。
[0058]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0059]
实施例1铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂盒的制备
[0060]
试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示：
[0061]
表1引物、探针序列
[0062] 名称核苷酸序列pa上游引物seq id no：1ttacttgcggctggcttttpa下游引物seq id no：2tgggcgctgctcagaaagpa探针seq id no：3cagggcacgctcgttagcctcgthi上游引物seq id no：4ctggtgcaatggcagaagtghi下游引物seq id no：5ttgtgcaagttcttttaccaacghi探针seq id no：6cgatggtgttggcccaggttggtatec上游引物seq id no：7ttattgccgggaaaagtgtacgec下游引物seq id no：8ggtgatatcgtccacccaggtec探针seq id no：9gccgggaatggtgattaccgacg内标上游引物seq id no：10aaggtgaaggctcatggcaa内标下游引物seq id no：11tgcagctcactcagtgtggc内标探针seq id no：12ggttgtccaggtgagccaggccatc
[0063]
试剂盒中还包括：tricine的浓度为1m/l、koac的浓度为10m/l、10％的tween20、80％的甘油、100％的dmso、dntps的浓度为25mm、rtth酶的浓度为5u/ul、udg酶的浓度为2u/ul、醋酸锰的浓度为25mm。
[0064]
实施例2本发明试剂盒的检测方法
[0065]
本发明的检测方法为real time pcr，real time pcr反应过程为(1)预变性，时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃～105℃，时间一般为2～10min，预变性的目的为使双链核酸序列彻底分离为单链；(2)变性，温度一般为91℃～105℃，时间一般为10s～35s；(3)退火，使各引物退火至铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌或内标核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃～60℃，退火的时间可以是10s～60s(4)延伸，引物与模板结合，开始合成新的dna双链，延伸温度一般为40℃～80℃，延伸时间可以是10s～1min。
[0066]
每个检测体系的组成如表2：
[0067]
表2
[0068][0069]
表3
[0070]
[0071][0072]
荧光检测通道选择：(1)选择fam通道(reporter：fam，quencher：none)，检测铜绿假单胞菌；(2)选择rox通道(reporter：rox，quencher：none)，检测流感嗜血杆菌；(3)选择cy5通道(reporter：cy5，quencher：none)，检测大肠埃希菌；(4)选择hex通道，检测内标；(5)参比荧光(passive reference)设置为none。荧光定量实时反应条件如下表4所示。
[0073]
表4：荧光定量实时pcr反应条件
[0074][0075]
反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析，然后记录样本ct值和定值结果。具体测试结果分析如下：
[0076]
seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9所示探针通道无荧光值，且seq id no.12所示探针通道的ct值≤35，报告检测结果为阴性；
[0077]
seq id no.3、所示探针通道的ct值≤34，报告为铜绿假单胞菌阳性；
[0078]
seq id no.6、所示探针通道的ct值≤34，报告为流感嗜血杆菌阳性；
[0079]
seq id no.9、所示探针通道的ct值≤33，报告为大肠埃希菌阳性；
[0080]
seq id no.3所示探针通道ct值皆≥34，但seq id no.12所示探针通道ct值≤35，报告铜绿假单胞菌样本浓度低于检测下限；seq id no.6所示探针通道ct值皆≥34，但seq id no.12所示探针通道ct值≤35，报告流感嗜血杆菌样本浓度低于检测下限；seq id no.9所示探针通道ct值皆≥33，但seq id no.12所示探针通道ct值≤35，报告大肠埃希菌样本浓度低于检测下限；
[0081]
当seq id no.12所示探针通道ct值≥35，出现阴性对照有ct值或呈典型s扩增曲线、阳性对照无ct值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查并排除原因，并重复试验。
[0082]
实施例3本发明试剂盒的可行性试验
[0083]
1.最低检测限(lod)试验
[0084]
(1)铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测。
[0085]
(2)样本提取
[0086]
将管中5个不同浓度的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌痰液样本(用痰液前处理试剂处理过)用移液器混匀，利用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取及纯化试剂进行核酸dna的纯化。
[0087]
(3)样本检测
[0088]
将50ul处理好的标本上清(核酸)加入到铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂反应管中，每个浓度21个复孔，同时加入50ul纯化水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0089]
(4)结果分析
[0090]
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(lod)铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌均为500copies/ml。具体数据表5，表6、表7。
[0091]
表5：铜绿假单胞菌检测限确认
[0092]
样本浓度(copies/ml)检测重复数阳性检测数阳性检出率2000copies/ml2121100％500copies/ml212095.24％250copies/ml211257.14％125copies/ml21838.10％20copies/ml2100
[0093]
表6：流感嗜血杆菌检测限确认
[0094][0095][0096]
表7:大肠埃希菌检测限确认
[0097]
样本浓度(copies/ml)检测重复数阳性检测数阳性检出率2000copies/ml2121100％500copies/ml212095.24％250copies/ml211285.71％125copies/ml21766.67％20copies/ml2100％
[0098]
2、与其它疾病的交叉反应情况
[0099]
(1)铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂配制，通过采用实施例1的方法制备铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂。
[0100]
(2)交叉病原体样本提取：将管中含有屎肠球菌、粘质沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、白念珠菌、产酸克雷伯菌、化脓链球菌、光滑念珠菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、阴沟肠杆菌、近平滑念珠菌、脑膜炎奈瑟菌、滕黄微球菌、马红球菌、副流感嗜血杆菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、金黄葡萄球菌、耐甲氧西林金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、人偏肺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、耐甲氧凝固酶阴性葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌的痰液样本用移液器混匀,利用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取及纯化试剂进行核酸dna的纯化。
[0101]
(3)样本检测:将50ul处理好的标本上清(核酸)加入到铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测反应管中，同时加入50ul纯化水到检测液中作为阴性对照，提取的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌作为阳性对照试验，按照实例2中检测方法进行检测。
[0102]
(4)结果分析：通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌以外的其它病原体进行检测，结果表明：本发明试剂盒对铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，屎肠球菌、粘质沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、白念珠菌、产酸克雷伯菌、化脓链球菌、光滑念珠菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、阴沟肠杆菌、近平滑念珠菌、脑膜炎奈瑟菌、滕黄微球菌、马红球菌、副流感嗜血杆菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、金黄葡萄球菌、耐甲氧西林金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、人偏肺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、耐甲氧凝固酶阴性葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特异性，具体结果如表8。
[0103]
表8：交叉反应实验
[0104][0105][0106]
3、抗干扰性
[0107]
(1)铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂配制。
[0108]
(2)样本处理
[0109]
选取铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌混合检测限浓度样本，同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(cmax)加入到细菌样本中，采用实例3中交叉反应方法处理样本，按照实例2中检测方法进行检测。
[0110]
(3)结果分析
[0111]
试验表明，当样本中含有粘蛋白、血液、氯化钠、地塞米松、盐酸组胺、薄荷脑、奥司他韦、莫匹罗星、妥布霉素，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到干扰，具体见表9。
[0112]
表9：外源物质的抗干扰性实验
[0113]
药物名称检测结果粘蛋白阳性血液阳性氯化钠阳性地塞米松阳性盐酸组胺阳性薄荷脑阳性奥司他韦阳性莫匹罗星阳性妥布霉素阳性
[0114]
实施例4本发明试剂盒的2-8℃稳定性考核
[0115]
1.加速稳定性试验
[0116]
(1)铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测。
[0117]
(2)样本提取
[0118]
将管中检出限浓度的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌痰液样本用移液器混匀,利用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取及纯化试剂进行核酸dna的纯化。
[0119]
(3)样本检测
[0120]
将50ul提取获得的标本上清(即样本中的核酸)加入到37℃加速7、14、21天的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂反应管中，每个靶标20例阳性样本，同时加入50ul纯化水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0121]
(4)结果分析
[0122]
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对37℃加速7、14、21天的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂进行检测，具体数据表10。
[0123]
表10：加速稳定性试验
[0124]
加速(37℃)时间(d)检出情况7稳定检出14稳定检出21稳定检出
[0125]
2.实时稳定性试验
[0126]
(1)铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测。
[0127]
(2)样本提取
[0128]
将管中检出限浓度的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌痰液样本用移液器混匀,利用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取及纯化试剂进行核酸dna的纯化。
[0129]
(3)样本检测
[0130]
将50ul处理好的标本上清(核酸)加入到2-8℃运输7天2-8℃保存3、6、9、12个月的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂反应管中，每个靶标20例阳性样本，同时加入50ul纯化水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。
[0131]
(4)结果分析
[0132]
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2-8℃运输7天2-8℃保存3、6、9、12个月的铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌核酸检测试剂进行检测，具体数据表11。
[0133]
表11：实时稳定性试验
[0134]
加速(2-8℃)时间(mouth)检出情况3稳定检出6稳定检出9稳定检出12稳定检出
[0135]
实施例5阴阳性临床样本符合率验证
[0136]
采用质检合格的本试剂盒，对采集的临床样本进行验证。对铜绿假单胞菌/流感嗜血杆菌/大肠埃希菌各10临床阳性样本核酸及20例阴性样本进行验证，为保证试剂盒检测结果可信，设置阴阳性质控品对照，结果表明，临床样本阴阳性符合率100％。具体数据图1，图2、图3。试剂盒检测结果如下：
[0137]
表12：临床阴阳性符合率试验
[0138]
样本名称检测结果阳性通道内标出值情况铜绿假单胞菌阳性fam阳性流感嗜血杆菌阳性rox阳性大肠埃希菌阳性cy5阳性阴性样本阴性无阳性
[0139]
实施例6灵敏度检测的对比试验
[0140]
配制反应液1和反应液2进行混合，并用其它细菌对应的引物探针(见表13)配制体系，然后分别加入各自体系对应的样本核酸50ul，样本核酸浓度分别为5
×
106copies/ml、5
×
104copies/ml、5
×
103copies/ml、5
×
102copies/ml，共同上机检测。结果如图4～6所示，其中，图4a、5a和6a为利用本发明实施例1的试剂盒进行检测的结果，4b、5b和6b为利用对照引物探针检测的结果。
[0141]
表13对照引物、探针序列
[0142] 核苷酸序列对照pa上游引物ccagagcttcgtcagccttg对照pa下游引物agcagccactccaaagaaacc对照pa探针tctgaccgctaccgaagacgcagc对照hi上游引物cgtgcagatgcagttaaaggttat对照hi下游引物tgcaggtttttcttcaccgtaag对照hi探针ctggtaaaggtgttgatgctggtaaattaggcac对照ec上游引物ccgtctggtcgaaaaattaggt对照ec下游引物atatgctgggctttgccatt对照ec探针ccagcctgtgttactgccattttcgc
[0143]
结果显示，3种细菌用本发明的体系在4个梯度浓度下均可以检测到，用其它引物探针的体系在5
×
102copies/ml均检测不到，其效果远不如本发明的检测效果，本发明的检测灵敏度要比其它引物探针高。
[0144]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.引物探针组合，其特征在于，包括：检测铜绿假单胞菌的如seq id no.1～2所示的引物对和seq id no.3所示的探针；检测流感嗜血杆菌的seq id no.4～5所示的引物对和seq id no.6所示的探针；检测大肠埃希菌的seq id no.7～8所示的引物对和seq id no.9所示的探针。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括：检测内标基因的如seq id no:10～11所示的引物对；检测内标基因的如seq id no:12所示的探针。3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，如seq id no.3所示探针的5’端连接fam荧光基团；如seq id no.6所示探针的5’端连接rox荧光基团；如seq id no.9所示探针的5’端连接cy5荧光基团；如seq id no.12所示探针的5’端连接hex荧光基团。5.权利要求1～4任一项所述的引物探针组合在制备检测检测铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和/或大肠埃希菌的试剂盒中的应用。6.检测铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和/或大肠埃希菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组合。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括tricine、koac、tween20、甘油、dmso、甜菜碱、nan3、dntps、rtth酶、udg酶、醋酸锰、nan3和纯化水中的一种或几种。8.非诊断目的同时检测铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌及大肠埃希菌的方法，其特征在于，以权利要求6或7所述的试剂盒对样品进行real time pcr检测，根据荧光信号判断样品是否存在铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌或大肠埃希菌。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品为痰液；所述real time pcr检测的体系包括：20ul反应液1、10ul反应液2和50ul样本核酸；所述反应液1包括：
所述反应液2包括：所述反应液2包括：10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述real time pcr检测的程序包括：

技术总结

本发明属于生物检测技术领域，具体公开了检测三种肺炎病原体的引物探针组合和试剂盒。所述三种肺炎病原体为铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌及大肠埃希菌。本发明所述引物探针和试剂盒可简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测小儿细菌性肺炎三种病原体的感染，实现了单管PCR对三种细菌的检测，灵敏度高、特异性好、检测时间短、结果准确可靠，大大减少患者的痛苦，节省社会资源，同时避免病原菌由于使用抗菌药物压力过大而产生耐药，具有很大的临床实用性。用性。