一种内皮素受体A融合突变体蛋白及其应用的制作方法

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一种内皮素受体a融合突变体蛋白及其应用
技术领域
1.本发明涉及蛋白质表达技术领域，具体涉及一种内皮素受体a融合突变体蛋白及其应用。

背景技术：

2.膜蛋白在维持细胞的生理功能和信号传递上发挥重要作用，有超过40％的fda批准的药物靶点都是膜蛋白，g蛋白偶联受体(g protein-coupled receptors，gpcrs)家族是人类中最庞大的膜蛋白家族，也是很多药物的重要靶点。这个家族中有800多个成员。据统计，获得fda批准的靶向gpcrs的药物总计475种，占所有fda批准药物的34％。近5年来，美国fda批准了69种靶向gpcrs的新药,临床期在研药物中有321种靶向gpcrs，其中60种(19％)药物靶向的是创新gpcrs靶点。靶向gpcrs的药物销量占全球市场的27％。gpcrs一直是药物研发的重要靶点之一，因为它们能够调控多种广泛的生理过程，而且在细胞表面具有可以成药的靶点。
3.内皮素(endothelin,et)是一种由21个氨基酸组成的生物活性物质，具有显著的缩血管活性和加强平滑肌、心肌收缩，促进神经内分泌功能，也具有诱导血管生成、促分化，促进细胞有丝分裂，内皮素也参与了多种疾病的发生发展过程，例如癌症、验证、高血压、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化和蛛网膜下腔出血等疾病，内皮素是通过与内皮素受体(endothelin receptors,ednrs)结合而实现参与上述生理和病理过程的。内皮素受体属于gpcr家族，大小45-50kda，迄今为止共发现了三种同源异构体，即内皮素受体a(endothelin receptors a,ednra)、内皮素受体b(endothelin receptors b,ednrb)、内皮素受体c(endothelin receptors c,ednrc)，其中ednra和ednrb存在于哺乳动物和人体内。其中ednra在多种恶性病变组织如：结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌中被发现高表达，提示ednra与这些恶性肿瘤的病理高度相关，因此，开发ednra相关小分子抑制剂对许多恶性肿瘤的有无限光明的前景。
4.蛋白质的三维结构对了解其生物学功能以及小分子药物设计起到至关重要的作用，小分子与蛋白质复合物晶体结构解析可以帮助人们分析小分子与蛋白质如何结合和相互作用，然后根据获得的信息对小分子药物重新设计，从而获得结合力强，特异性好的小分子药物，想要得到内皮素受体a蛋白与小分子的晶体结构，需要大量的内皮素受体a蛋白，然而，内皮素受体a在昆虫细胞和哺乳动物细胞中的表达量非常低，想要纯化到足量的蛋白非常困难。
5.家蚕生物反应器被认为是目前最有经济意义的个体表达系统，有基因工程产品“微型发酵罐”之称，利用家蚕幼虫表达蛋白具有很大的优越性：1.在强有力的多角体蛋白启动子的调控下，外源基因的表达水平高，是昆虫细胞，哺乳动物细胞蛋白表达水平的100-1000倍，表达水平可高达毫克级每头蚕；2.有效地进行蛋白质翻译后的加工、转运、糖基化、脂酰化和磷酸化等，表达产物的抗原性、酶活力等生物学活性与天然蛋白质相比毫不逊；3.家蚕血淋巴具有储存蛋白的能力，血淋巴内含有蛋白分解酶的抑制物，对目的蛋白起到
保护作用，且外源蛋白又很容易从家蚕体液中分离纯化出来；4.家蚕相比昆虫和哺乳动物细胞，对毒性蛋白有很强的抵抗力；5.家蚕脂肪体细胞含有丰富的脂类，对稳定膜蛋白和易降解蛋白有很大作用；6.家蚕很容易大规模饲养，成本较昆虫培养基低廉。
6.基于上述内容，提出利用家蚕-家蚕杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中高效表达生产内皮素受体a的方法。

技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种人内皮素受体a融合突变体蛋白，以及利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中高效表达生产内皮素受体a突变体的方法。
8.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
9.本发明提供了一种内皮素受体a融合突变体蛋白，所述融合突变体蛋白ednra由以下(1)-(3)构成：
10.(1)内皮素受体a突变序列，所述突变序列中的突变为(a)或(b)情形之一：
11.(a)c379a、c383a和c388a；
12.(b)r103y、d133a、q252a、s325a和i364a；
13.(2)n端的信号肽序列替换为ha信号肽序列后依次加入tev酶切位点和flag标签；
14.(3)c端添加3c酶切位点后依次加入gfp蛋白序列和10his标签蛋白序列。
15.进一步改进在于，所述融合突变体蛋白ednra中所述突变序列中的突变为(a)三突变时，其氨基酸序列如seq id no.3所示；所述融合突变体蛋白ednra中所述突变序列中的突变为(b)五突变时，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
16.进一步改进在于，所述n端的信号肽序列具体为内皮素受体a野生型氨基酸序列n端的20个氨基酸。
17.本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述融合突变体蛋白ednra。
18.进一步改进在于，所述多核苷酸的序列如seq id no.2或seq id no.4中任一所示。
19.本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒含有如上述多核苷酸且能够翻译表达出如上述融合突变体蛋白ednra。
20.进一步改进在于，所述质粒为bacmid。
21.本发明还提供了一种融合突变体蛋白ednra的表达系统，为转入上述重组质粒的杆状病毒细胞，即重组杆状病毒。
22.进一步改进在于，所述杆状病毒细胞为家蚕杆状病毒bmnpv。
23.本发明还提供了一种内皮素受体a融合突变体蛋白的表达方法，其特征在于，利用家蚕幼虫表达系统表达，包括以下步骤：
24.(1)将上述重组家蚕杆状病毒注射接种5龄家蚕幼虫；
25.(2)感染的家蚕幼虫高效表达融合突变体蛋白ednra。
26.进一步改进在于，包括以下步骤：
27.(1)将上述所述表达内皮素受体a突变体蛋白的基因进行人工合成，并克隆到bac-to-bac家蚕杆状病毒表达系统运载载体中，构建得到转移表达载体，所述家蚕杆状病毒运载载体优选为pfastbac1；
28.(2)将家蚕杆状病毒运载载体转化大肠杆菌，通过位点的特异性转座，将转移表达载体上的所述编码内皮素受体a突变体蛋白的基因整合到杆状病毒质粒完成病毒基因组的重组，通过蓝白斑筛选获得重组病毒质粒，所述杆状病毒质粒优选为bacmid；
29.(3)将上述整合了内皮素受体a突变体蛋白的基因的杆状病毒质粒转染家蚕bmn细胞，获得重组杆状病毒，将该病毒在家蚕bmn细胞进行扩增，并用该病毒接种家蚕幼虫，所述家蚕幼虫优选为5龄的家蚕幼虫，所述病毒接种量优选为2-5μl；
30.(4)接种病毒后4-5天，家蚕幼虫表达产生内皮素受体a突变体融合蛋白。
31.本发明具有如下有益效果：
32.利用被重组家蚕杆状病毒感染的家蚕幼虫高效表达融合蛋白，比直接用原核生物表达的活性高，比通过转基因植物表达的产率高；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本、大规模饲养，而且不会造成公害；蚕体中有多重天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物更加稳定。
附图说明
33.图1是bacmid质粒pcr验证图；
34.图2是ednra在蚕幼虫中表达后的荧光图；
35.图3是ednra蛋白在蚕幼虫中表达后sds-page检测图；
36.图4a是ednra蛋白在家蚕中小试表达sds-page图，图4b是ednra蛋白在昆虫细胞中小试表达sds-page图；
37.图5是ednra蛋白western blot结果图。
具体实施方式
38.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
39.1、材料
40.本发明所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
41.2、方法
42.2.1质粒构建及家蚕杆状病毒制备
43.本发明使用的所有质粒均使用常规的分子生物学手段进行引物设计，pcr及载体片段重组构建得到，所有重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致。
44.pcr及载体片段重组方式为将编码人改造过的内皮素受体a野生型(内皮素受体a野生型氨基酸序列如seq id no.5所示、基因序列如seq id no.6所示)和突变体融合蛋白的基因克隆到pfastbac1载体中(其中突变体融合蛋白的基因包括三突变(氨基酸序列如seq id no.3所示、基因序列如seq id no.4所示)和五突变(三突变和五突变仅突变不同，其n端和c端均相同)氨基酸序列如如seq id no.1所示，基因序列如seq id no.2所示)，得到pfastbac1-转移质粒，所有重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致，改造过的内皮
素受体a融合蛋白大小为75kda。
45.2.1.1内皮素受体a融合蛋白质粒转化大肠杆菌感受态细胞
46.从-80℃冰箱取出感受态细胞于冰上化冻，超净台内将所述重组质粒使用常规分子生物学手段转化bmdh10bac大肠杆菌感受态细胞，转化条件为：
47.(1)取10μl杆状病毒转移野生型质粒pfastbac1-flag-tev-ednra-3c-egfp-10his、三突变质粒pfastbac1-flag-tev-ednra(c379a,c383a,c388a)-3c-egfp-10his和五突变质粒pfastbac1-flag-tev-ednra(r103y,d133a,q252a,s325a,i364a)-3c-egfp-10his加入到bmdh10bac感受态细胞，冰上放置30min，42℃水浴90s，冰上放置2min；
48.(2)然后加入450μl soc培养基(soc培养基：40g蛋白胨，10g酵母粉，1.16g氯化钠，0.38g氯化钾，4.06g六水氯化镁，4.92g七水硫酸镁，7.2g葡萄糖，水2000ml)中，37℃摇床250rpm摇菌4h；
49.(3)取4μl，涂lb平板(lb平板含：2g蛋白胨，1g酵母粉，2g氯化钠，3g琼脂粉，200ml水，经121℃，灭菌20min，取出待温度降至50～60℃(手握可忍受5s左右)时，加入600ul三抗，1ml x-gal和33ul iptg，终浓度为：卡纳霉素50μg/ml，庆大霉素7μg/ml，四环素10μg/ml，x-gal 100μg/ml，iptg 40μg/ml)，于37℃培养箱正向放置30min后，倒置培养2d；
50.2.1.2重组杆状病毒质粒bacmid提取及家蚕杆状病毒制备
51.(1)通过2.1.1中步骤(3)培养的菌落进行蓝白斑筛选，挑选单个白菌落至含有三抗的lb液体培养基中过夜培养，然后提取bacmid，获得重组病毒质粒bacmid，通过m13引物进行pcr验证，获得与理论分子量大小一致的目的条带(4361bp)，表明重组ba cmid含有目的基因，如图1所示；
52.(2)在生物安全柜内取1个1.5ml ep管，每管依次加入100μl转染培养基、15μg上述提好的bacmid(用头轻轻弹匀)、7μl x-treme转染试剂(用头轻轻弹匀)，室温孵育20min。从摇床取出前一天传代的bmn细胞，在安全柜内吸取200μl细胞，用20μl移液器取20μl台盼蓝至离心管盖上，再将细胞吹打均匀，取20μl细胞至盖中，与台盼蓝混合均匀，取20μl样品打入细胞计数板孔中，不可有气泡，打入板中3-8分钟用计数仪计数。将细胞密度稀释到1.0
×
106。在安全柜内吸取3ml稀释过的细胞到25ml摇瓶中。孵育时间结束时，把x-treme-dna复合物滴加到sf9细胞中，慢慢混匀。将摇瓶放入摇床中培养，27℃，100rpm培养4天,获得p0病毒。
53.(3)按1ml p0/50ml(1.5
×
106cell/ml)细胞，加入p0病毒。放入恒温摇床中培养，细胞培养温度为27℃，转速100rpm，72h后收获p1病毒,并对细胞计数，测定细胞浓度、细胞活性及直径，并作好记录。
54.(4)按4ml p1/200ml(1.5
×
106cell/ml)细胞，加入p1病毒。放入恒温摇床中培养，细胞培养温度为27℃，转速100rpm，72h后收获p2病毒,并对细胞计数，测定细胞浓度、细胞活性及直径，并作好记录。
55.2.2ednra蛋白在蚕幼虫中的表达
56.(1)取500ul或1ml微量注射器，取准备好的p2病毒，从蚕背部节间处往血腔注射稀释后的病毒(10-20ul)，注射好的蚕放入对应的准备好的笼盒中，每注射10只蚕更换新的注射器。注射病毒后的3-5天，在紫外光或者蓝光下观察家蚕幼虫是否有绿荧光，有绿荧光的蚕表明有融合了gfp的ednra蛋白表达，如图2所示，这些发绿荧光的蚕是感染了家蚕
杆状病毒的家蚕，实验结果显示注射野生型ednra蛋白病毒的蚕体基本无颜，注射三突变和五突变的ednra蛋白病毒的蚕体均有绿荧光。此外，根据荧光强度可知，五突变ednra蛋白在家蚕幼虫中有的表达比三突变更高。
57.为了进一步验证发绿荧光的蛋白是否为目的蛋白，各取1只蚕幼虫，收集脂肪体细胞，用pbs冲洗后放入提前准备的ep管中，用组织匀浆机将收集的脂肪体匀浆后加入5ml缓冲液(100mm tris-hcl(ph 7.5),150mm nacl,5％glycerol,1％ddm,0.2％chs,smne,1mm mgcl2,1mm ptu,1mm pmsf)，进行超声破碎。将离心后的上清转移到加入200ul预处理的flag填料的管中，4℃孵育2h，加入100ul洗脱液(100mm tris-hcl(ph7.5),150mm nacl,5％glycerol,0.05％ddm,0.005％chs，200ug/ml flag peptid e)孵育30分钟，4500rpm离心，取上清进行sds-page检测。实验结果见图3，注射野生型ednra蛋白的蚕脂肪体未观察到明显的蛋白表达，注射三突变和五突变ednra蛋白均有分子量约为78kda的条带，说明两者均明显表达。且五突变的蛋白表达量比三突变蛋白表达要高。
58.2.3ednra蛋白在蚕幼虫和昆虫细胞中产量比较
59.根据2.2中的结果可知，ednra五突变蛋白表达量较高，为了进一步比较ednra在不同表达细胞中的表达情况，用ednra五突变蛋白进行同时比较其在家蚕和昆虫细胞中的表达情况。
60.2.3.1ednra五突变在家蚕系统中的产量
61.提取ednra蛋白：取5只感病，发绿荧光，大小均一的蚕幼虫，剪去头部及尾部，沿腹中线剪开，去掉肠道、马氏管、丝腺，收集脂肪体细胞，用pbs冲洗后放入提前准备的ep管中，用组织匀浆机将收集的脂肪体匀浆，加入5ml缓冲液(100mm tris-hcl(ph 7.5),150mm nacl,5％glycerol,1％ddm,0.2％chs,smne,1mm mgcl2,1mm ptu,1mm pmsf)，利用单通道超声破碎仪200-300w,超声3min，16000rpm，4℃离心15min。将离心后的上清转移到加入200ul预处理的flag填料的管中，4℃孵育2h，加入100ul洗脱液(100mm tris-hcl(ph 7.5),150mm nacl,5％glycerol,0.05％ddm,0.005％chs，200ug/ml flag peptide)孵育30分钟，4500rpm离心，取上清。
62.取10ul上述上清样品进行sds-page验证表达情况，如图4a所示，在75kda处有明显的条带，与理论分子量一致，通过nanodrop测定浓度为0.52mg/ml，计算每只蚕幼虫的表达量约100μg。为了进一步验证ednra蛋白是否在家蚕幼虫中正确表达，进行了western blot验证，如图5所示，ednra蛋白在78kda左右处出现抗flag抗体的特异性条带，证明在家蚕幼虫中正确表达了ednra蛋白。
63.2.3.2ednra五突变在家蚕系统中的产量
64.取sf21细胞进行细胞计数，测定细胞浓度、细胞活性及直径。细胞浓度要求在1.8-2.2
×
106cell/ml，将细胞分到250ml无菌培养瓶中，每瓶30ml，按照3ul/0.5ml的比例将2.1中的p2病毒接至sf21细胞中，48h小时后取10ml细胞，计数测量细胞感染状况，3500rpm，离心2min，收集细胞沉淀，在细胞沉淀中加入5ml缓冲液(100mm tris-hcl(ph 7.5),150mm nacl,5％glycerol,1％ddm,0.2％chs,smne,1mm mgcl2,1mm ptu,1mm pmsf)，进行超声破碎。将离心后的上清转移到加入200ul预处理的flag填料的管中，4℃孵育2h，加入100ul洗脱液(100mm tris-hcl(ph 7.5),150mm nacl,5％glycerol,0.05％ddm,0.005％chs，200ug/ml flag peptide)孵育30分钟，4500rpm离心，取上清进行sds-page检测。实验结果
如图4b，从sds-page结果来看，昆虫细胞中ednra五突变蛋白表达量没有家蚕中高，计算其产量为1μg/2
×
107细胞。其产量比家蚕系统要低100倍。
65.以上所述表明，本发明通过对内皮素受体a蛋白序列进行了5个突变，增加了蛋白的稳定性，利用家蚕幼虫表达系统成功表达ednra蛋白，该蛋白在大肠杆菌不表达，在昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统中表达量很低，在昆虫细胞中表达量约1μg/2
×
107细胞，很难富集到蛋白。本发明中该蛋白在家蚕幼虫表达系统中表达量可达到100μg/蚕，是昆虫细胞表达的100倍，可为后续药物开发提供物质基础。
66.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种内皮素受体a融合突变体蛋白，其特征在于，所述融合突变体蛋白ednra由以下(1)-(3)构成：(1)内皮素受体a突变序列，所述突变序列中的突变为(a)或(b)情形之一：(a)c379a、c383a和c388a；(b)r103y、d133a、q252a、s325a和i364a；(2)n端的信号肽序列替换为ha信号肽序列后依次加入tev酶切位点和flag标签；(3)c端添加3c酶切位点后依次加入gfp蛋白序列和10his标签蛋白序列。2.根据权利要求1所述的一种内皮素受体a融合突变体蛋白，其特征在于，所述融合突变体蛋白ednra中所述突变序列中的突变为(a)时，其氨基酸序列如seq id no.3所示；所述融合突变体蛋白ednra中所述突变序列中的突变为(b)时，其氨基酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的一种内皮素受体a融合突变体蛋白，其特征在于，所述n端的信号肽序列具体为内皮素受体a野生型氨基酸序列n端的20个氨基酸。4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1-3任一所述的融合突变体蛋白ednra。5.根据权利要求4所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如seq id no.2或seq id no.4中任一所示。6.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有如权利要求4-5任一所述的多核苷酸且能够翻译表达出如权利要求1-3任一所述融合突变体蛋白ednra。7.根据权利要求6所述的一种重组质粒，其特征在于，所述质粒为bacmid。8.一种融合突变体蛋白ednra表达系统，其特征在于，为转入权利要求6-7任一所述重组质粒的杆状病毒，即重组杆状病毒。9.根据权利要求8所述的表达系统，其特征在于，所述杆状病毒为家蚕杆状病毒bmnpv。10.一种内皮素受体a融合突变体蛋白的表达方法，其特征在于，利用家蚕幼虫表达系统表达，包括以下步骤：(1)将权利要求9中的重组家蚕杆状病毒注射接种5龄家蚕幼虫；(2)感染的家蚕幼虫高效表达融合突变体蛋白ednra。

技术总结

本发明公开了一种内皮素受体A融合突变体蛋白及其应用，涉及蛋白质表达技术领域，所述融合突变体蛋白EDNRA由以下(1)-(3)构成：(1)内皮素受体A突变序列；(2)N端的信号肽序列替换为HA信号肽序列后依次加入TEV酶切位点和Flag标签；(3)C端添加3C酶切位点后依次加入GFP蛋白序列和10His标签蛋白序列。本发明利用被重组家蚕杆状病毒感染的家蚕幼虫高效表达融合蛋白，比直接用原核生物表达的活性高，比通过转基因植物表达的产率高；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本、大规模饲养，而且不会造成公害；蚕体中有多重天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物更加稳定。更加稳定。更加稳定。