一种南极适冷真菌突变方法及常温适应突变株的筛选

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1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于转座子系统的南极适冷真菌突变筛选的技术方法，本发明也涉及一株有效突变菌株geomyces sp.mp10。

背景技术：

2.南极由于极端的气候条件——极低温、季风、辐射、反复冻融等，形成了独一无二的生态环境，同时造就了极地微生物独特的生理生化特性，这些特性随着时间的积累，逐渐构成了极地丰富的微生物资源库。与极地微生物资源库庞大的数量相比，真正得到开发应用的例子却凤毛麟角，大部分研究专注于功能活性产物的单一筛选及功能研究，其中很大一部分原因在于，极地微生物很多具有独特生理生化活性的代谢产物，均需要在一定条件下才能正常生产，如低温，高湿度，高盐度等。特殊的生产条件造就了代谢产物独特的生物活性，但也限制着产物进一步的大规模开发与应用，如何平衡二者的关系，成为了探索极地微生物资源宝库的一把重要钥匙。
3.南极适冷真菌geomyces sp.wnf-15a是在南极土壤中分离出来的一株丝状真菌，在低温的培养条件下可以分泌胞外水溶性紫红素。geomyces sp.wnf-15a生产的紫红素价高，各方面稳定性好，且不含对人类致病的过敏原，是具有巨大应用价值的高潜力菌株。此外，geomyces sp.wnf-15a也具有显著的适冷真菌生理特性，即低温高产，最适生产温度为14℃，在20℃条件下培养，素产量降低80％左右。因此，本领域亟待研究优化其性能或对其进行优化改造的方案，来获得温度适应性更为理想且产素效果好的菌株。然而，南极适冷真菌的细胞壁、细胞膜与普通菌株存在差异，其原生质体的获得以及转化子的获得非常困难，一定程度上限制了其优化改造进程。
4.在微生物功能基因的鉴定以及遗传育种的研究中，随机突变体的应用是非常重要的。常规突变体的筛选有三类方法：物理诱变，化学诱变以及生物诱变。物理诱变主要通过放射性的物理因素对基因造成随机破坏，然后依赖宿主自我修复形成突变体或是造成生物体内结构成分的电离、激发从而形成结构变化；化学诱变则是通过性质不稳定的化学试剂，通过原子基团的置换等或者核酸类似物的替换等使基因序列发生突变。这两类突变方法随机性大，效率较低，且难以对功能基因进行后续的研究分析。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种南极适冷真菌突变方法及常温适应突变株的筛选。
6.在本发明的第一方面，提供一种突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m2021561。
7.在一个或多个实施方式中，所述紫红素生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其中含有紫红素，或其能够产生紫红素。
8.在本发明的另一方面，提供所述的突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细
胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于生产紫红素。
9.在一个或多个实施方式中，所述紫红素为呈现紫红的素，作为食品添加剂或工业添加剂。
10.在一个或多个实施方式中，所述应用包括常温(不高于25℃，如16～25℃，较佳地18～25℃，更佳地20～25℃；更具体如21、22、24℃)或低温(如低于15℃，如0～15℃；更具体如1、2、3、5、6、8、10、12、14℃)下的应用。
11.在本发明的另一方面，提供一种用于生产或分离紫红素的组合物，其包含所述的突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；以及微生物学上、食品学上或工业上可接受的载体。
12.在本发明的另一方面，提供一种应用所述的突变型紫红素生产菌株生产紫红素的方法，包括：在常温下发酵培养所述紫红素生产菌株，生产紫红素。
13.在一个或多个实施方式中，所述的紫红素生产菌株在接种于发酵培养基前还包括：将该菌株进行预先活化、扩大培养，之后接种入发酵培养基。
14.在一个或多个实施方式中，生产紫红素的方法包括：
15.(1)菌株活化；较佳地，将所述菌株接种至种子液体培养基，14～20℃培养2～5天，涂布于固体种子培养基平板，于14～20℃培养箱培养3～5d；
16.(2)制备种子液；较佳地，每50ml种子培养基挖块接种直径为1.7～2cm的培养3～5d的种子平板菌块，130～200rpm培养2～3d，使种子培养基有成熟的孢子，得到一级种子液；接种量为体积百分比5～10％接种二级种子，130～200rpm培养24～36h，得到活性高的二级种子液；
17.(3)发酵培养；较佳地，将种子液按6～10mg接种量(菌体干重)接种到50ml发酵培养基中，25℃130～200rpm发酵培养16d，离心，得到含胞外紫红素的上清液。
18.在一个或多个实施方式中，所述方法还包括：从培养产物(发酵液)中提纯或分离紫红素；更佳地包括：将完成发酵后的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性紫红素。
19.在一个或多个实施方式中，所述的固体种子培养基包括：葡萄糖1g，甘露醇2g，麦芽糖2g，谷氨酸钠1g，酵母浸提物0.6g，mgso4·
7h2o 0.03g，kh2po40.05g，琼脂粉3g，用蒸馏水定容至100ml，ph自然。
20.在一个或多个实施方式中，所述的种子培养基包括：葡萄糖1g，甘露醇2g，麦芽糖2g，谷氨酸钠1g，酵母浸提物0.6g，mgso4·
7h2o 0.03g，kh2po
4 0.05g，用蒸馏水定容至100ml，ph自然。
21.在一个或多个实施方式中，所述的发酵培养基包括：淀粉2.8g，蛋白胨0.185g，用蒸馏水定容至100ml，ph自然。
22.在一个或多个实施方式中，所述的固液分离的方法为离心。
23.在本发明的另一方面，提供一种用于生产紫红素的试剂盒，其中含有：容器，以及位于容器中的权利要求1所述的突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。
24.在本发明的另一方面，提供一种南极适冷真菌突变及常温适应突变株的筛选方法，所述方法基于转座子系统诱变，包括步骤：(1)建立转座子载体(包括克隆扩增以及纯
化)；较佳地，所述的转座子包括fot1和/或impala；更佳地还包括helitron；(2)制备南极适冷真菌原生质体，其中利用含有纤维素酶和蜗牛酶的酶解液进行细胞壁的酶解(破壁酶解)；(3)将(1)的转座子载体转化(2)的原生质体，获得阳性转化子；(4)从(3)获得的阳性转化子中筛选常温适应突变株。
25.在一个或多个实施方式中，将载体导入野生型菌株后，载体会使得菌体基因组产生变化，部分菌株就会获得野生型没有的常温适应特性，后续将这种菌株筛选出来并进行验证，故“常温”变异的关键步骤是载体的构建转化以及后续的筛选。
26.在一个或多个实施方式中，所述方法还包括步骤(5)：鉴定转座子插入位点，测定位点上下游基因序列；更佳地，通过tail pcr进行鉴定。
27.在一个或多个实施方式中，步骤(2)中：酶解液中纤维素酶按照质量体积比为3
±
0.5％(较佳地3
±
0.4％，更佳地3
±
0.3％，进一步更佳地3
±
0.2％，进一步更佳地3
±
0.1％)，蜗牛酶按照质量比为1.5
±
0.3％(较佳地1.5
±
0.2％，更佳地1.5
±
0.1％)。
28.在一个或多个实施方式中，酶解液的ph值为6.5～8，较佳地为7～7.6，更佳地为7.2～7.5。
29.在一个或多个实施方式中，步骤(3)中，利用peg进行原生质体转化，peg浓度为按照质量体积比45～62％；较佳地为50～60％。
30.在一个或多个实施方式中，步骤(3)中，用孢子直接作为pcr的模板以鉴定转化子；较佳地，模板体积占反应总体积的2～4倍(如2.5、3、3.5倍)；较佳地，以te缓冲液作为pcr反应的缓冲液。
31.在一个或多个实施方式中，通过优化过后的酶配方以及转化介质，可以获得高质量丝状真菌原生质体，具体方法为：
32.(a)制备菌丝，离心洗涤后，置于优化过后的酶解液中，28℃、40r/min混匀仪中匀速转动1.5～2h进行破壁酶解；
33.(b)过滤洗涤酶解液，用溶液c重悬，获得终浓度为10
10
个/ml的原生质体；
34.(c)加入五分之一重悬体积的转化溶液d，混匀后分装；
35.(d)将2～5μg质粒加入到200μl步骤(c)获得的南极适冷真菌geomyces sp.wnf-15a的原生质体中，混匀后置于冰上30min；加入700μl无菌溶液d，室温放置20min；
36.(e)步骤(d)所获得的转化液直接涂布在2％底层培养基，涂干后置于培养箱内培养24～36h后，加盖第二层含潮霉素(30μg/ml)的抗性软琼脂培养基，继续培养4～10天至有明显的转化子长出。
37.在一个或多个实施方式中，所述酶解液的获得方法如下：取0.3g纤维素裂解酶以及0.15g蜗牛酶，加入10ml溶液c溶解，用0.22μm细菌过滤器过滤至洁净离心管中备用；
38.在一个或多个实施方式中，所述溶液c的配制方法为：称取52.596g氯化钠，5.549g氯化钙，1.2114g tris，溶于1l去离子水中，用盐酸调整ph值至7.5，高压湿热灭菌；
39.在一个或多个实施方式中，所述溶液d的配制方法为：peg3500按60％的质量体积比溶于溶液c，0.22μm细菌过滤器过滤除菌；
40.在一个或多个实施方式中，所述质粒为选自转座载体pfc001(impala转座子)，pfc002(fot1转座子)；较佳地还包括双元载体donor、helper质粒(helitron转座子)。
41.在一个或多个实施方式中，步骤(3)中，通过优化过的孢子pcr方法进行转化子的
筛选，具体方法为：(a)挑取与对表观性状有明显差异的转化子(生长的菌落直径较大，积累的素圈直径较大、颜较深，或者生长、生产周期较快)，进行液体活化培养；(b)将步骤(a)获得的菌液用无菌水稀释两倍后均匀涂布在固体种子培养基上，于目标温度下培养3～4天，待长出单菌落；(c)用头挑取直径为5mm左右的菌落在50μl te缓冲液中反复剧烈吹打混匀，将混匀液与半瓶去离子水一同放入微波炉，高火加热3min，然后将混匀液冰上放置2min，离心，以上清液为模板，进行孢子pcr，分别用相应引物验证；所述te缓冲液为真菌基因组提取试剂盒中的溶解缓冲液；所述孢子pcr反应体系如下：模板5μl，es taq master mix 7.5μl，primer-f 0.5μl，primer-r 0.5μl，ddh2o 1.5μl；所述孢子pcr反应程序如下：98℃，5min；{95℃，30s；(tm-4)℃，1min；72℃，1kb/min}45个循环；72℃，7 min；4℃，∞；(d)验证正确的菌株，与野生型作点板对比，于目标温度下培养2～3天观察表观性状差异，选取目标突变株进行发酵验证。
42.在一个或多个实施方式中，步骤(5)中，鉴定转座子插入位点、测定位点上下游基因序列的方法为：(a)提取插入突变菌株的基因组dna；(b)根据插入的已知序列，设计三段特异性引物，进行巢式热不对称pcr；取第一、二、三轮pcr产物，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收清晰的条带，以第三轮特异性引物对pcr产物进行dna测序，即可获得插入位点侧翼的未知基因序列。
43.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
44.图1、南极真菌原生质体制备酶解液配方优化结果；其中，c表示纤维素酶，s表示蜗牛酶。
45.图2、南极真菌原生质体制备酶解液ph优化结果，呈现了不同酶解ph条件下制备的原生质体个数以及再生率。
46.图3、南极真菌最优条件下制备的原生质体镜检照片。
47.图4、南极真菌原生质体转化介质peg优化结果，呈现了不同浓度peg条件下的转化效率。
48.图5、南极真菌孢子pcr方法优化结果。
49.图6a-b、南极真菌孢子pcr优化前后对比。
50.图7、南极真菌原生质体转化子平板照片。
51.图8、转化子质粒丢失验证。
52.图9、pfc001(impala)转化子验证。
53.图10、pfc002(fot1)转化子验证。
54.图11、helitron转座子转化子验证。
55.图12、突变株与野生株点板对比。
56.图13、常温突变株摇瓶发酵验证结果，左侧纵坐标为发酵不同时间紫红素产素量的测定结果(od)，右侧纵坐标为发酵不同时间的菌体干重(dw)。
57.图14、本发明突变株与两株低温高产突变株的常温产量对比的结果。
具体实施方式
58.本发明人经过深入的研究，揭示了一种基于转座子系统的南极适冷真菌突变的筛选方法。针对南极适冷真菌的细胞壁、细胞膜与普通菌株存在差异，其原生质体的获得以及转化子的获得非常困难的问题，本发明人进行了条件优化。本发明的方法可高效获得南极适冷真菌的原生质体以及高效获得转化子，为基于转座子系统的菌株突变改造夯实了基础。同时，本发明也提供了有效突变菌株geomyces sp.mp10，其为常温适应突变株，其在常温下具有良好的产紫红素的能力。
59.术语
60.如本发明所用，所述“常温”为不高于25℃的温度，如温度范围为16～25℃，较佳地18～25℃，更佳地20～25℃；更具体如21、22、24℃。
61.如本发明所用，所述的“南极适冷真菌”是指来自于南极或南极附近，适应于在低温下生长以及发挥其生理功能(如产生某些代谢物)的真菌。通常，需要为此类菌株营造相对低的温度环境。
62.如本发明所用，术语“geomyces sp.突变株”、“突变株geomyces sp.mp10”，“geomyces sp.mp10”、“紫红素生产菌株geomyces sp.mp10”或“mp10菌株”可互换使用，都指保藏号为cctcc no:m2021561的地丝霉属的菌株。
63.本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
64.如本发明所用，“工业学上可接受的载体”或“微生物学上可接受的载体”是用于与本发明的紫红素生产菌株或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物混合的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的培养基、溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持紫红素生产菌株或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的活性的载体。
65.突变菌株筛选方法
66.生物体内普遍存在大量转座子，转座子标签技术也广泛应用在细菌、真菌、动植物等领域。然而，在丝状真菌中，转座子的研究相对较少。本发明人发现，南极适冷真菌是一种难以大量获取原生质体、转化效率底的菌株。为了实现对南极适冷真菌的改造/筛选，本发明提供了改进的方案，可一次性获得大量的原生质体，以及有利于提高转化效率。本发明的技术方案尤其适用于基于转座子系统的南极适冷真菌突变的筛选，可极大地提高筛选的效率。
67.fot1，impala，helitron是三种自主性转座子，在转座过程中会随机插入到宿主基因组中，导致插入位点基因的失活，从而影响基因功能的正常发挥，造成表观性状的变化，后续可以根据已知的插入转座子标签对相关插入位点进行定位测序。
68.本发明公开一种基于fot1，impala，helitron转座子系统的南极适冷真菌突变菌株筛选的方法。所述方法包括如下步骤：(1)转座子载体的克隆扩增以及纯化；(2)南极真菌原生质体的制备与转化；(3)筛选阳性转化子并验证转座效果；(4)通过tail pcr鉴定转座子插入位点，测定位点上下游基因序列。
69.针对难以较高效率地获得南极真菌原生质体的问题，本发明人仔细分析了南极真菌的细胞壁、细胞膜的特点，经过反复实验、分析了多种多样的裂解试剂以及实验条件，优
化了用于裂解细胞壁的裂解酶的种类，以及优化了裂解酶的用量。作为本发明的优选方式，以纤维素酶以及蜗牛酶的组合作为酶解液的主要活性组分；更优选地，酶解液中纤维素酶按照质量体积比为3
±
0.5％，蜗牛酶按照质量比为1.5
±
0.3％。作为本发明的优选方式，酶解液的ph值为6.5～8，较佳地为7～7.6。
70.本发明人也优化了原生质体转化的试剂及其浓度，运用peg进行原生质体的转化。作为本发明的优选方式，peg浓度为按照质量体积比45～62％，更佳地为50～60％。
71.为了鉴定转化子，本发明人用孢子直接作为pcr的模板以鉴定转化子，这一操作简单便捷。作为本发明的优选方式，模板体积占反应总体积的2～4倍。作为本发明的优选方式，以te缓冲液作为pcr反应的缓冲液。
72.本发明在南极适冷真菌geomyces sp.wnf-15a中构建了有效的转座子系统，并建立了完整的遗传转化方法，可以获得大量插入突变的稳定遗传转化子。原生质体的转化效率可达25-50个转化子/μg dna。
73.通过本发明人构建的转座体系，筛选到了可在室温下正常生产素的突变菌株。并且，本发明人以该菌株为对象，通过热不对称pcr到了插入位点，扩增出了可能与geomyces sp.wnf-15a低温生产有关的调控蛋白编码序列。
74.本发明建立了一个极地微生物的高效筛选平台，为极地微生物资源进一步的开发利用奠定基础。本发明的方法属于生物诱变法，通过t-dna或者转座子这种可移动的dna片段进行修饰，从而改造宿主基因组，此类方法最大的优势便在于可以准确定位到突变位置，为后续研究提供了便利。本发明的技术方案尤其适用于基于转座子系统的南极适冷真菌突变的筛选，可极大地提高筛选的效率。
75.菌株、其细胞代谢物等及其应用
76.利用本发明的方法，本发明人筛选到了常温适应突变株geomyces sp.mp10(保藏号cctcc m 2021561)。
77.本发明所述的geomyces sp.mp10菌株具有如下的特征：
78.菌落颜：白；
79.菌落形态：菌落中心凸起，边缘整齐；
80.适宜生长温度：14～25℃。
81.本发明的geomyces sp.mp10显示与出发菌株存在显著的共同点，包括菌落的部分生长形态近似及都能产生紫红素等；但是也存在一些不同，主要在于其对于常温具有显著的适应性。
82.本发明的菌株是活体细胞，一旦获得了本发明的geomyces sp.mp10菌株，就可以用接种传代、再生等手段来大批量地获得该菌株。这通常是将其接种到固体平板培养基或液体培养基中进行菌株的扩大培养而获得本发明的活体细胞。而获得的活体细胞可进一步进行实验室驯化、遗传育种和分子遗传操作等来获得突变体和转化子。此外，也可利用本发明的菌株作为异源表达的生物工程宿主细胞。
83.进一步地，本发明的高产紫红素的geomyces sp.mp10菌株可作为出发菌株，通过实验室驯化、遗传育种、分子遗传操作等手段进行进一步改良而获得产量更高或酶系更为优化的衍生菌株。以本发明的geomyces sp.mp10菌株作为出发菌株，通过这些人工操作手段进一步筛选优化获得的菌株，也应被包含在本发明的整体范围内。
84.本领域的技术人员熟知的方法能用于进一步诱变/改造本发明的活体菌株。诱变/改造可是以上一种方法或多种方法的多代诱变/改造，且不限于这些方法。基于本发明提供的菌株，可以进一步进行物理化学等方式进行育种，也可以导入新的紫红素调控基因和其它相关调控基因，获得的突变体和转化子产酶性能可获得进一步提高，所述的育种方法为上述的一种或一种以上相结合。
85.本领域的技术人员熟知的方法能用于构建表达构建物(载体)和进一步改造本发明菌株。例如，对于菌株中已发现或新发现的与紫红素生产相关的信号途径、信号通路及其中涉及的蛋白进行进一步的改良(例如增加有益因子的表达，减少有害因子的表达)。
86.用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。所用的步骤在本领域众所周知。
87.在获得了所述的geomyces sp.mp10菌株的基础上，本发明还提供了所述的紫红素生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有以下的特性：含有紫红素。
88.在获得了本发明的菌株后，本领域技术人员可以方便地获得其培养物，例如可参考本发明具体实施例中提供的一些培养基或培养工艺、或利用与本发明的实施例中存在适当改变但也能获得培养物的培养基或培养工艺，从而获得细胞培养物。所述的细胞培养物中含有活性菌株，从而产生紫红素。
89.所述的细胞代谢产物，是本发明的菌株在培养过程中产生或分泌的一类物质，其可以是由细胞直接分泌到培养基中，或者经过一定处理后被与细胞分离。所述的细胞产物可被分离、纯化或浓缩。
90.所述的细胞培养上清，是在培养本发明的菌株的过程或培养结束后，去除细胞以及固体杂质后，剩余的培养液，其可以是未经浓缩或浓缩的。通常，细胞以及固体杂质可以通过诸如离心、过滤等方式被排除。
91.所述的细胞裂解产物，是在培养本发明的菌株的过程或培养结束后，利用裂解细胞的试剂来裂解细胞，从而构成的混合物。所述的细胞裂解产物可以是在裂解后去除了固体杂质后的产物。根据需要，其可以是经纯化的或经浓缩的产物。
92.本发明还提供了所述的紫红素生产菌株的应用，用于：生产紫红素，或用于制备所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；进一步地，所述紫红素、细胞培养物、培养上清或代谢产物等可被应用于食品工业中。
93.本发明的geomyces sp.mp10菌株可以实现长期生长和稳定传代。应用于培养本发明的geomyces sp.mp10菌株的培养基和培养方法并不限于实施例中所公布的那些，其它常规应用于培养地丝霉属的菌的培养基和培养方法也可以应用于本发明中。可以理解的是，菌株的培养基组分可能可被功能类似的其它组分替换，在不同的情形下也可根据特定菌株的特性适当添加其它组分或去除其中的部分组分或改变其中部分组分的含量。
94.本发明所述的培养体系或发酵体系可以进行体系放大以进行工业生产，根据体系的大小不同，本领域技术人员根据所掌握的一般知识可以进行适当的调整以有利于菌株的生长或生产。
95.本发明也提供了一种制备食品/饲料/工业制品组合物的方法，包括以本发明的geomyces sp.mp10菌株生产紫红素，分离纯化后添加在需要增处理的食品/饲料/工业
制品中，形成含有紫红素的食品/饲料/工业制品组合物。所述的紫红素生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物在经过适当的加工、提纯、无毒化处理后，也可以应用于作为素添加剂，添加到所述的食品/工业制品组合物中。
96.比较实验发现，本发明的菌株geomyces sp.mp10具有良好的常温适应性，在25℃培养条件下，出发菌以及其他菌株均没有活性，而该菌株仍然保留一定的产素能力，因此其与出发菌株相比有着更为广泛的工业应用价值。
97.本发明的有益效果：
98.真菌的原生质体由于没有细胞壁支撑，在制备提取以及转化等实验过程中，更加容易受到外界因素的影响，导致破碎、失活。本发明的原生质体制备方法是经过一定优化的，酶解液的配方、转化介质等均调整至了最适状态，大大提高了南极真菌原生质体的数量、完整性以及高活力。此外，还对转化介质以及南极真菌孢子pcr的方法进行了相应的优化，建立了南极适冷真菌geomyces sp.wnf-15a较为完善系统的遗传操作体系。
99.本发明的筛选方案中个，构建了三种有效的转座体系和完整的筛选流程，为该菌的遗传研究以及突变方法进行了有效的补充，并通过该方法筛选得到了一株与亲本表型发生明显变化的突变菌株，该菌株可以在25℃下生产素，并通过该菌株确定了一个可能参与南极真菌低温调控的基因靶点。
100.本发明的极端微生物的高效筛选平台，为南极适冷真菌geomyces sp.wnf-15a基因功能的研究提供了便利条件，为极地微生物资源的进一步的开发利用奠定基础。
101.本发明获得了具有常温适应性的菌株，应用其生产紫红素时，无需控制温度至低温状态，具有节能性、简化了产素工艺，大大节约了发酵产素的成本，有着更为广泛的工业应用价值。
102.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
103.实施例1、南极真菌原生质体的制备——酶配方优化
104.1)菌丝体培养：将20℃培养3天的南极适冷真菌geomyces sp.wnf-15a固体平板用ypd培养基洗菌，并在20℃、130r/min条件下震荡培养36h。
105.所述ypd培养基的配方为：2g蛋白胨、1g酵母粉，溶于100ml去离子水中，121℃高压灭菌20min。50％(w/v)葡萄糖单独配成溶液，过滤除菌或115℃高压灭菌20min。使用时每100ml ypd溶液加4ml 50％葡萄糖溶液。
106.2)原生质体制备：称取湿重为1.5g的菌丝体，离心洗涤后置于不同配方的酶解液中，室温、40r/min混匀仪中匀速转动混匀1.5h进行破壁酶解；所述酶解液分别用如下方法获得：配制多组酶解液，裂解酶比例如表1，用10ml溶液c溶解裂解酶，用0.22um的细菌过滤器过滤至洁净离心管中备用，酶解液现用现配。
107.表1、溶液a(酶解液)配方(*％代表质量体积比)
108.109.溶液c的配制方法：称取52.596g氯化钠，5.549g氯化钙，1.2114g tris，溶于1l去离子水中，用盐酸调整ph值至7.0，121℃高压灭菌20min。
110.酶解过程中多次取样观察原生质体制备状况。用无菌玻璃漏斗(灭菌前先内置玻璃棉)过滤裂解液，冷冻离心机4℃、700g条件下(升降加速度均调整为1)离心5min，移除上清液，分别用20ml氯化钠溶液(0.9mol/l，121℃高压灭菌20min)洗涤两遍、溶液c洗涤一遍。再用2.5ml溶液c重悬原生质体，取样镜检，使用细胞计数板计量原生质体浓度。每200μl分装一管。
111.3)原生质体再生：将新鲜制备的原生质体用溶液c梯度稀释10,000倍，并用血球计数板统计稀释终液原生质体浓度，大约控制在104个/ml。在2ml再生培养基中加入10μl稀释过的原生质体，轻轻混匀后，在20℃、80％湿度的恒温培养箱中避光、静置培养2天，将培养液倒入微温的固体再生培养基，混匀后倒入洁净平板中，等待凝固，封口膜封好平板，避光、倒置于20℃、80％湿度的恒温培养箱中培养3天，观察再生状态。对照组则用正常的pdb培养基(不含甘露醇)培养再生，以去除未酶解断裂的菌丝和孢子的影响。
112.所述再生培养基配方为：28g/l pdb培养基粉末，109.3g/l(0.6mol/l)甘露醇，去离子水加热溶解至澄清，固体再生培养基添加10g/l琼脂，于121℃下高压灭菌20min。
113.所述再生率计算方式如下：再生培养基平板上生长出来的菌落数记为r，正常的pdb培养基(不含甘露醇)上生长出来的菌落数记为r0，原生质体的再生率r计算方法如下(单位为％)：
[0114][0115]
上述过程中用到的移液头均需剪掉尖口以减小混匀过程中对原生质体的剪切力作用。
[0116]
多组酶解液的制备的原生质体个数以及再生率如图1所示，3％纤维素酶+1.5％蜗牛酶的配方制备的原生质体数量最多，可以达到3.28
×
10
10
个/ml，再生率达到了33.8％。这个配方下制备得到的原生质体数量以及质量较为平衡。
[0117]
用于破壁酶解黄玉茜等(黄玉茜；木霉菌t23菌株原生质体制备及再生研究；上海交通大学学报(农业科学版)；2005，23(003):303-307)，对木霉菌进行原生质体优化，使用1.5％的崩溃酶裂解3h得到1.11
×
107个/ml原生质体；李豪等(产辅酶q10的米曲霉原生质体制备条件研究；中国调味品；2015，08:35-38)；王公坤(不同条件对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率的影响；科技资讯；2013，000(010):123)使用2％蜗牛酶裂解0.5h，获得产黄青霉原生质体的再生率仅为6.3％。相比于这些已报道的丝状真菌原生质体制备方法，本发明优化过后的酶液配方制备得到的原生质体数量大幅度提高，再生率也处于较高水平，为之后该菌的分子生物学研究奠定了良好的基础。
[0118]
实施例2、南极真菌原生质体的制备——酶解ph优化
[0119]
1)菌丝体培养同实施例1。
[0120]
2)原生质体制备同实施例1。
[0121]
所述酶解液配制方法如下：取0.3g纤维素裂解酶以及0.15g蜗牛酶，加入10ml溶液c溶解(即含有3％纤维素酶+1.5％蜗牛酶)，用0.22um的细菌过滤器过滤至洁净离心管中备用。酶解液现用现配。所述溶液c的配制方法同实施例1。
[0122]
3)原生质体再生同实施例1。
[0123]
不同酶解ph条件下制备的原生质体个数以及再生率如图2所示，当酶解液ph为7.5时，制备的原生质体数量进一步提高了，达到了3.96
×
10
10
个/ml，原生质体的再生率也进一步增大至36.6％。
[0124]
以上优选条件下制备的原生质体镜检如图3所示，该条件下制备的原生质体形状饱满，分散均匀，且无未观察到没有断裂的菌丝，酶解程度较为完全。
[0125]
实施例3、南极真菌原生质体的转化
[0126]
制备好的原生质体用溶液c重悬过后，加入五分之一重悬体积的溶液d，分装。将3μg相应质粒加入到200μl前一步制备好的的原生质体中，混匀后置于冰上30min；加入500μl不同浓度的无菌溶液d，室温放置20min。所获得的转化液直接涂布在2％底层培养基，涂干后置于分别于20℃、25℃的培养箱内倒置培养12h后，加盖第二层含潮霉素(30μg/ml)抗性的软琼脂培养基，继续培养10天至有明显的转化子长出，统计转化效率。
[0127]
所述溶液c的配制方法同实施例1。
[0128]
不同浓度的溶液d的配制方法：peg3500分别按30％，45％，50％，60％，65％，70％的质量体积比溶于溶液c，过滤除菌。
[0129]
2％底层培养基的配方：葡萄糖10g/l，甘露醇20g/l，麦芽糖20g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸镁0.3g/l，酵母膏6g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，琼脂20g/l。
[0130]
软琼脂培养基配方：葡萄糖10g/l，甘露醇20g/l，麦芽糖20g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸镁0.3g/l，酵母膏6g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，琼脂7.5g/l。
[0131]
转化效率计算方法如下：将抗性种子固体培养基上长出的菌落数记为t1，连续抗性培养2代后，挑取菌落进行孢子pcr，用抗性引物对hyg-f(5
’‑
gcagacaggaacgaggacat-3’(seq id no:1))，hyg-r(5
’‑
gctccatacaagccaaccac-3’(seq id no:2))进行验证，得到正确条带的菌落数记为t2，原生质体的转化效率t如下计算，单位为％。
[0132][0133]
上述过程中用到的移液头均需剪掉尖口以减小混匀过程中对原生质体的剪切力作用。
[0134]
多组不同peg浓度下，原生质体的转化效率如图4所示，当peg浓度为60％时，达到了51％的最大转化效率。当用2μg dna转化时，可得到50-100个转化子，如此高的数量，有利于提高分子改造实验的效率。
[0135]
实施例4、针对孢子pcr的优化
[0136]
由于用孢子直接作为pcr的模板时实验效果不理想，所以本发明人针对孢子pcr的方法进行了优化。its序列是核糖体rdna内转录间隔区，在同一物种内高度保守，可用来作为孢子pcr方法效果的参照。
[0137]
用头挑取直径为5mm左右的菌落在50μl不同缓冲液中反复剧烈吹打混匀制备孢子液，进行孢子液前处理。以处理液为模板，进行pcr反应，用引物对its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’(seq id no:3))，its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’(seq id no:4))扩增验证。
[0138]
优化方式包括：增加孢子液前处理(微波加热3min)、改变溶解缓冲液种类、增加
pcr体系中模板的体积。
[0139]
孢子液前处理方式如下：将eppendorf管与半瓶去离子水(硅胶塞子盖好)一同放入微波炉，高火加热2min，然后将混匀液冰上放置5min，13400g离心1min，上清液即为处理液。
[0140]
缓冲液包括ddh2o、eb buffer、te buffer，均购买于天根生化科技有限公司。
[0141]
所述增加模板体积是指，模板体积由1μl增加至5μl。
[0142]
所述pcr反应体系如下：模板1μl，es taq mastermix 7.5μl，primer-f 0.5μl，primer-r 0.5μl，补充ddh2o至总体积15μl。
[0143]
所述孢子pcr反应程序如下：94℃，5min；{94℃，1min；55℃，1min；72℃，40s}，40个循环；72℃，10min；4℃，∞。
[0144]
结果如图5所示，以its1/its4为引物，在pcr反应体系模板体积为1μl条件下，分别尝试了ddh2o(泳道3-6)，eb(泳道7-10)，以及te(泳道11-12)三种缓冲洗脱液。结果发现，只有te缓冲液有正确的its序列条带(570bp)，且条带相比于阳性对照更为暗淡。增加模板体积后，出现了明亮且正确的条带(泳道13-14)。
[0145]
优化过后的孢子pcr方法，可以更高效地验证转化子基因型，优化前后的效果对比如图6a-b所示，可以看到明亮清晰的条带。
[0146]
实施例5、转座子突变菌株筛选
[0147]
(一)转座子载体的克隆扩增以及纯化
[0148]
(1)通过srfi和paci两种限制性内切酶对pfc332质粒进行双酶切，电泳回收得到5921bp的ama1片段；所述pfc332质粒载体来自于丹麦技术大学。pfc332(genbank:kt031985.1)载体携带构巢曲霉组成型启动子p
tef1
控制的cas9编码表达盒，以及来自构巢曲霉氨酸启动子p
trpc
控制的潮霉素抗性基因hph。
[0149]
(2)用加了同源臂的引物对wf-f1/wf-r1，从质粒pfc332上扩增回收tef1终止子、潮霉素抗性表达盒及大肠杆菌质粒元件序列(4669bp)。
[0150]
(3)将回收得到的两个片段通过无缝组装试剂盒clonexpress multis one step cloning kit进行组装，得到质粒pfc-wf1。
[0151]
(4)用加了同源臂的引物对wf-f2/wf-r2，从质粒pfc-wf1上扩增回收tef1启动子序列(951bp)。
[0152]
(5)通过sphi和paci两种限制性内切酶对pfc332质粒进行双酶切，线性化质粒，电泳回收。
[0153]
(6)将(4)-(5)两步回收得到的两个片段通过无缝组装试剂盒clonexpress multis one step cloning kit进行组装，得到转座载体骨架pfc000。
[0154]
(7)在fot1以及impala转座元件序列(genbank:af443562.1,genbank:af282722.1)两端加上sphi/paci/限制性内切酶的位点，人工合成片段。
[0155]
(8)用sphi/paci限制性内切酶双酶切载体骨架pfc000，线性化质粒，电泳回收。
[0156]
(9)分别用含有同源臂的引物对f-f1/f-r1，i-f1/i-r1从公司合成的载有转座元件的质粒上将目标序列扩增下来(fot1:1926bp；impala:1282bp)。
[0157]
(10)将第(9)步回收得到的片段分别通过无缝组装试剂盒clonexpress multis one step cloning kit与线性化载体骨架进行组装，得到两种转座载体pfc001和pfc002。
[0158]
表2、构建所用引物(
*
下划线标示限制性酶切位点)
[0159][0160]
(11)将构建好的转座载体pfc001(impala)，pfc002(fot1)，donor、helper分别转化至大肠杆菌内，在含氨苄青霉素的抗性平板上涂布培养12h。
[0161]
(12)挑取生长正常的单克隆菌落，接种于含有相应抗性的液体lb培养基中过夜培养，进行扩增。
[0162]
(13)收集菌体，并使用质粒提取试剂盒提取足量的转座载体质粒。
[0163]
(二)南极真菌原生质体的制备与转化
[0164]
1)菌丝体培养：将20℃培养3天的南极适冷真菌geomyces sp.wnf-15a固体平板用ypd培养基洗菌并在20℃，130r/min条件下震荡培养36h。
[0165]
所述ypd培养基的配方为：2g蛋白胨、1g酵母粉溶于100ml去离子水中，121℃高压灭菌20min。50％(w/v)葡萄糖单独配成溶液，过滤除菌或115℃高压灭菌20min。使用时每100ml ypd溶液加4ml 50％葡萄糖溶液。
[0166]
2)原生质体制备：获得的菌丝离心洗涤后，置于酶解液中，室温、40r/min混匀仪中匀速转动混匀1.5h进行破壁酶解，酶解过程中多次取样观察原生质体制备状况。用无菌玻璃漏斗(灭菌前先内置玻璃棉)过滤裂解液，冷冻离心机4℃、700g条件下(升降加速度均调整为1)离心5min，移除上清液，分别用20ml氯化钠溶液洗涤两遍、溶液c洗涤一遍。再用2.5ml溶液c重悬原生质体，取样镜检，使用细胞计数板计量原生质体浓度为2.2
×
10
10
个/ml，加入0.5ml的溶液d，缓慢充分混匀后分装；
[0167]
所述酶解液的获得方法如下：取0.3g纤维素裂解酶以及0.15g蜗牛酶，加入10ml溶液c溶解(即含有3％纤维素酶+1.5％蜗牛酶)，用0.22um的细菌过滤器过滤至洁净离心管中备用。
[0168]
所述氯化钠溶液为0.9mol/l的氯化钠溶液，121℃高压灭菌20min。
[0169]
所述溶液c的配制方法同实施例1。
[0170]
所述溶液d的配制方法为：peg3500按60％的质量体积比溶于溶液c，过滤除菌。
[0171]
3)原生质体转化：将3μg相应质粒加入到200μl前一步制备好的的原生质体中，混匀后置于冰上30min；加入500μl无菌溶液d，室温放置20min。所获得的转化液直接涂布在2％底层培养基，涂干后置于分别于20℃、25℃的培养箱内倒置培养12h后，加盖第二层含潮霉素(30μg/ml)的抗性软琼脂培养基，继续培养10天至有明显的转化子长出。
[0172]
2％底层培养基的配方：葡萄糖10g/l，甘露醇20g/l，麦芽糖20g/l，谷氨酸钠10g/l，七水合硫酸镁0.3g/l，酵母膏6g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，琼脂20g/l。
[0173]
软琼脂培养基配方：葡萄糖10g/l，甘露醇20g/l，麦芽糖20g/l，谷氨酸钠10g/l，七
水合硫酸镁0.3g/l，酵母膏6g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，琼脂7.5g/l。
[0174]
上述原生质体制备与转化过程中，移液头均剪掉尖口以减小混匀过程中对原生质体的剪切力作用。
[0175]
(三)筛选阳性转化子并验证转座效果
[0176]
1)用移液头底端挖块挑取与对照平板生长状态有明显差异的转化子：生长的菌落直径较大，积累的素圈直径较大、颜较深，或者生长、生产周期较快的转化子。将菌落挑取至含有1ml种子培养基的2ml无菌ep管中，于目标温度下，130r/min摇床中震荡培养2天，对照组野生型菌株进行相同操作。转化平板照片如图7所示。
[0177]
2)获得的菌液用无菌水稀释两倍后均匀涂布在固体种子培养基上，于目标温度下培养3天，待长出单菌落，使转化进入的游离载体质粒丢失。
[0178]
3)用头挑取直径为5mm左右的菌落在50μl te缓冲液中反复剧烈吹打混匀，将混匀液与半瓶去离子水一同放入微波炉，高火加热3min，然后将混匀液冰上放置2min，13400g离心1min。以上清液为模板，进行孢子pcr，分别用相应引物：am-f/am-r，iyz-f/iyz-r，fyz-f/fyz-r，hyg-f/hyg-r验证。转座子引物(iyz-f/iyz-r，fyz-f/fyz-r，hyg-f/hyg-r)验证有大小正确的条带，载体骨架引物(am-f/am-r)验证无条带即为正确菌株。质粒丢失验证结果如图8所示，impala验证结果如图9所示，fot1验证结果如图10所示，helitron验证结果如图11所示。
[0179]
所述孢子pcr反应体系如下：模板5μl，es taq mastermix 7.5μl，primer-f0.5μl，primer-r 0.5μl，ddh2o 1.5μl。
[0180]
所述孢子pcr反应程序如下：98℃，5min；{95℃，30s；54℃，1min；72℃，40s}45个循环；72℃，7min；4℃，∞。
[0181]
所述引物如下：
[0182]
am-f：5
’‑
accaatgcttaatcagtgaggc-3’(seq id no:13)；
[0183]
am-r：5
’‑
gagtattcaacatttccgtgtcg-3’(seq id no:14)(条带857bp)。
[0184]
iyz-f：5
’‑
gggtgcaataagtttgaatacatct-3’(seq id no:15)；
[0185]
iyz-r：5
’‑
tacacctagaggtaccgacgatcg-3’(seq id no:16)(条带1253bp)。
[0186]
fyz-f：5
’‑
agacacgtcttcagacgcg-3’(seq id no:17)；
[0187]
fyz-r：5
’‑
agccgcttttcgaattgaga-3’(seq id no:18)(条带1203bp)。
[0188]
hyg-f：5
’‑
gcagacaggaacgaggacat-3’(seq id no:19)；
[0189]
hyg-r：5
’‑
gctccatacaagccaaccac-3’(seq id no:20)(条带889bp)。
[0190]
4)验证正确的菌株，用头挑取直径为5mm左右的菌落在20μl无菌水中反复吹打混匀备用。对混匀液镜检，并用计数板对孢子进行计数，将对照组野生型菌株的混匀液进行适量稀释后，取5μl处理获得的混匀液滴落至固体种子培养基(突变株)，以同样方法在突变株菌液旁边滴落相应对照组(野生型)的液滴，超净台内吹干，于目标温度下培养3天观察表观性状差异。选择与对照组野生型菌株相比，产生紫红素的量更多(例如紫深度更深(表明浓度大)或紫圈范围更大)的目标菌株。
[0191]
实施例6、高产紫红素的菌株及其产素性能
[0192]
1、菌株geomyces sp.mp10及其产素性能
[0193]
经过如前述实施例的筛选，本发明人到生产紫红素效果尤其理想的菌株，相
应菌株的点板结果如图12所示，根据目测可发现该突变株的产素量特别高(培养皿左半部分)，远高于出发菌株(培养皿右半部分)。获取目标突变株(简称为mp2)，进行发酵验证。
[0194]
在25℃条件下发酵验证结果如图13所示，从产素量(520nm波长下的吸光值)来看，从第1天起始发酵开始，突变株的产素量就大大高于出发株。野生型在25℃下不产生红素(图中野生型的数据是实验本底数据，不代表野生型常温下红素的产量)。从发酵菌株的干重来看，突变株与出发株在起始阶段干重相近，在发酵中后期，突变株的干重大于出发株。
[0195]
本发明人进一步将本发明菌株与geomyces sp.m210、geomyces sp.m300两株菌株进行比较。本发明突变株与低温高产突变株的常温产量对比如图14。结果显示，25℃条件下，geomyces sp.m210、geomyces sp.m300几乎不产素，而本发明的菌株则具有显著的产素量。
[0196]
上述发酵验证显示，本发明人获得了一株可以在25℃下生产素的突变菌株geomyces sp.mp10。
[0197]
2、通过tail pcr鉴定转座子插入位点
[0198]
1)提取插入突变菌株的基因组dna，采用试剂盒法。
[0199]
2)插入序列验证：分别用引物fyz-f/fyz-r对基因组模板进行pcr扩增，然后对pcr产物进行测序确证。
[0200]
所述引物如下：
[0201]
fyz-f：5
’‑
agacacgtcttcagacgcg-3’(seq id no:21)；
[0202]
fyz-r：5
’‑
agccgcttttcgaattgaga-3’(seq id no:22)。
[0203]
3)第一轮pcr：以简并引物ap1和特异性引物sp1(远端)为引物对，以突变菌株基因组dna为模板进行热不对称pcr扩增，扩增产物进行100倍稀释后备用。
[0204]
4)第二轮pcr：以第一轮pcr产物稀释液为模板，以简并引物ap1为上游引物，特异性引物sp2(近远端)为下游引物，进行热不对称pcr，扩增产物稀释100倍后备用。
[0205]
5)第三轮pcr：以第二轮pcr产物稀释液为模板，以ap1简并引物为上游引物，特异性引物sp3(近端)为下游引物，进行热不对称pcr。
[0206]
所述pcr程序同第二轮pcr。
[0207]
6)取第一、二、三轮pcr产物各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收清晰的条带，以sp3为引物对回收得到的pcr产物进行dna测序。
[0208]
所述引物如下(简并引物为试剂盒提供)：
[0209]
sp1：5
’‑
tccacttccttcctaatggcgcat-3’(seq id no:23)，
[0210]
sp2：5
’‑
ggccgagcttttcctatcgcagaa-3’(seq id no:24)，
[0211]
sp3：5
’‑
tttcgcggcggtcttcaaagagac-3’(seq id no:25)。
[0212]
3、菌株培养
[0213]
在以下条件培养所述紫红素生产菌株：
[0214]
(1)菌株活化：将geomyces菌株接种至种子液体培养基，14～20℃培养2～5d后，取适量均匀涂布于固体种子培养基平板，于14～20℃培养箱培养3～5d。
[0215]
(2)种子液的制备：每50ml种子培养基挖块接种直径为1.7～2cm的培养3～5d的种子平板菌块，130～200rpm培养2～3d，使种子培养基有成熟的孢子，得到一级种子液；接种
量为体积百分比5～10％接种二级种子，130～200rpm培养24～36h，得到活性高的二级种子液.
[0216]
(3)发酵培养：将种子液按6～10mg接种量(菌体干重)接种到50ml发酵培养基中，25℃130～200rpm发酵培养16d，离心，得到含胞外紫红素的上清液，检测胞外素的产量。
[0217]
固体种子培养基：葡萄糖1g，甘露醇2g，麦芽糖2g，谷氨酸钠1g，酵母浸提物0.6g，mgso4·
7h2o 0.03g，kh2po
4 0.05g，琼脂粉3g，用蒸馏水定容至100ml，ph自然。
[0218]
种子培养基：葡萄糖1g，甘露醇2g，麦芽糖2g，谷氨酸钠1g，酵母浸提物0.6g，mgso4·
7h2o 0.03g，kh2po
4 0.05g，用蒸馏水定容至100ml，ph自然。
[0219]
发酵培养基：淀粉2.8g，蛋白胨0.185g，用蒸馏水定容至100ml，ph自然。
[0220]
生物材料的保藏
[0221]
本发明的突变菌株(常温适应突变株)geomyces sp.mp10已在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)保藏，保藏日期：2021年5月19日，其保藏编号为cctcc no:m 2021561。
[0222]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.一种突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2021561。2.权利要求1所述的突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于生产紫红素。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述紫红素为呈现紫红的素，作为食品添加剂或工业添加剂；或，所述的应用包括常温或低温下的应用。4.一种用于生产或分离紫红素的组合物，其包含权利要求1所述的突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物；以及微生物学上、食品学上或工业上可接受的载体。5.一种应用权利要求1所述的突变型紫红素生产菌株生产紫红素的方法，包括：在常温下发酵培养所述紫红素生产菌株，生产紫红素；较佳地，所述的紫红素生产菌株在接种于发酵培养基前，还包括：将该菌株进行预先活化、扩大培养，之后接种入发酵培养基；更佳地，生产紫红素的方法包括：(1)菌株活化；较佳地，将所述菌株接种至种子液体培养基，14～20℃培养2～5天，涂布于固体种子培养基平板，于14～20℃培养箱培养3～5d；(2)制备种子液；较佳地，每50ml种子培养基挖块接种直径为1.7～2cm的培养3～5d的种子平板菌块，130～200rpm培养2～3d，使种子培养基有成熟的孢子，得到一级种子液；接种量为体积百分比5～10％接种二级种子，130～200rpm培养24～36h，得到活性高的二级种子液；(3)发酵培养；较佳地，将种子液按6～10mg接种量接种到50ml发酵培养基中，25℃130～200rpm发酵培养16d，离心，得到含胞外紫红素的上清液；更佳地，所述方法还包括：从培养产物中提纯或分离紫红素；更佳地包括：将完成发酵后的发酵液进行固液分离，取液体，得到胞外水溶性紫红素。6.一种用于生产紫红素的试剂盒，其特征在于，其中含有：容器，以及位于容器中的权利要求1所述的突变型紫红素生产菌株或其细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。7.一种南极适冷真菌突变及常温适应突变株的筛选方法，其特征在于，所述方法基于转座子系统诱变，包括步骤：(1)建立转座子载体；较佳地，所述的转座子包括fot1和/或impala；更佳地还包括helitron；(2)制备南极适冷真菌原生质体，其中利用含有纤维素酶和蜗牛酶的酶解液进行细胞壁的酶解；(3)将(1)的转座子载体转化(2)的原生质体，获得阳性转化子；(4)从(3)获得的阳性转化子中筛选常温适应突变株。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括步骤(5)：鉴定转座子插入位点，测定位点上下游基因序列；更佳地，通过tailpcr进行鉴定。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中：酶解液中纤维素酶按照质量体积比为3
±
0.5％，蜗牛酶按照质量比为1.5
±
0.3％；或
酶解液的ph值为6.5～8，较佳地为7～7.6，更佳地为7.2～7.5。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：利用peg进行原生质体转化，peg浓度为按照质量体积比45～62％；较佳地为50～60％；或用孢子直接作为pcr的模板以鉴定转化子；较佳地，模板体积占反应总体积的2～4倍；较佳地，以te缓冲液作为pcr反应的缓冲液。

技术总结

本发明提供了一种南极适冷真菌突变方法及常温适应突变株的筛选。所述方法基于转座子系统的诱变。本发明的方法可高效获得南极适冷真菌的原生质体以及高效获得转化子，为基于转座子系统的菌株突变改造夯实了基础。同时，本发明也提供了有效突变菌株Geomyces sp.MP10，其为常温适应突变株，其在常温下具有良好的产紫红素的能力。紫红素的能力。