一种抗h1n1
流感病毒的
多肽衍生物和用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术抗流感病毒技术领域，具体来说是一种抗流感病毒多肽衍生物和应用。
背景技术：
2.流感病毒每年导致一种传染病，全世界有29万至65万人死亡，300万至500万人患有严重疾病。此外，由新出现的重组病毒引起的流行病可能对全球产生毁灭性的影响。因此，有必要继续努力改进疫苗和抗病毒药物作为对策。目前有两类抗病毒药物可供临床使用:神经氨酸酶抑制剂(nais：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦)和m2离子通道抑制剂(金刚烷胺、金刚乙胺)。然而，目前流行的流感病毒在很大程度上对m2抑制剂s3具有耐药性。此外，nais的抗病毒能力相对较弱，这类药物的另一个担忧是耐药性的出现，就像2008年至2009年耐奥司他韦的h1n1流感流行季节一样。因此，流感病毒感染的和预防需要更有效的抗病毒药物，具有新的作用机制。
3.流感病毒的异三聚体rna依赖性rna聚合酶(rdrp)由pa、pb1和pb2亚基组成。它负责在被感染细胞的细胞核中复制和转录分段的单链病毒rna基因组(vrna)。病毒mrna的转录是通过一种独特的“抢帽”机制进行的。这涉及到通过将初生的封顶转录本与pb子单元结合，然后在核苷酸处被pa子单元中的依赖于cap的内切酶(cen)切割，从而实现对宿主rna聚合酶的高劫持。由pb1subunit1的rdrp功能产生的短的、带cap酶的寡聚物作为病毒mrna转录的引物。病毒转录本在模板vrna保守的富集区域被一种机制聚腺苷酸化，以在核输出后转化为功能蛋白。由于抢帽是病毒复制的必要条件，因此cap-binding、endonuclease和rdrp活性都是小分子抑制物的有吸引力的靶点，实际上有几种针对聚合酶的新化合物正在积极的临床开发中。2014年，一种rna合成抑制剂favipiravir(avigan)在日本获得批准，尽管该适应症仅限于对其他药物没有反应的新型流感病毒。pimodivir(jnj-63623872,vx-787)是一种pb2 cap-binding inhibitor，它单独与奥司他韦联合用于简单流感的病毒学疗效，但仅对a型流感病毒有效。因此，仍然需要继续努力发现和开发性能更好的流感药物。
4.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
5.(1)本发明以蛋白质数据库中帽依赖性核酸内切酶结构作为研究的依据筛选得到具有抗流感病毒活性的多肽，并进行进一步修饰，实验结果显示，该类多肽衍生物能显著抑制抗流感病毒的增殖，提示其在抗流感病毒中具有重要的开发和应用价值，因此可用于制备抗流感药物；
6.(2)本发明与现有文献报道的抗流感病毒肽类相比较，而本发明合成的多肽由天然氨基酸组成，易于合成、分子量小，且具有抑制流感病毒活性，是一种高效、理想的抗病毒药物。
技术实现要素：
7.为解决上述问题，本发明提供了一种抗流感病毒多肽衍生物及其应用。
8.本发明的一个方面涉及一种多肽衍生物，其中包含硬脂酸修饰部分，结构式为：ala-x-his-ala-y-pro-glu-gln-lys(c
18
)，其中，x、y分别为ala、leu、ile、pro、thr、val、met中的一种，c
18
为硬脂酸。
9.在一些实施方案中，x为ala，y为ala、leu、ile、pro、thr、val、met中的一种。在另一些实施方案中，x为leu，y为ala、leu、ile、pro、thr、val、met中的一种。在又一些实施方案中，x为pro、ile、met中的一种，y为ala、leu、ile、pro、thr、val、met中的一种。
10.在一些具体的实施方案中，该多肽衍生物结构式分别为：
11.多肽衍生物1：ala-leu-his-ala-val-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
12.多肽衍生物2：ala-leu-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
13.多肽衍生物3：ala-ala-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
14.多肽衍生物4：ala-ala-his-ala-val-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
15.多肽衍生物5：ala-val-his-ala-val-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
16.多肽衍生物6：ala-ala-his-ala-ala-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
17.多肽衍生物7：ala-leu-his-ala-leu-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
18.多肽衍生物8：ala-ile-his-ala-ile-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
19.多肽衍生物9：ala-met-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
20.多肽衍生物10：ala-pro-his-ala-met-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
21.多肽衍生物11：ala-thr-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
22.多肽衍生物12：ala-pro-his-ala-thr-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
23.多肽衍生物13：ala-pro-his-ala-ile-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
24.多肽衍生物14：ala-ile-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
25.多肽衍生物15：ala-met-his-ala-ile-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
26.多肽衍生物16：ala-ile-his-ala-met-pro-glu-gln-lys(c
18
)；
27.本发明另一个方面涉及上述多肽衍生物制备预防或流感疾病的药物中的用途。
28.在一些实施方案中，所述与流感病毒感染相关的疾病选自甲型h1n1流感。
29.本发明又一个方面涉及上述多肽衍生物以及药学上可接受的辅料。
30.在一些实施方案中，药物的剂型包括注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂、气雾剂、肠溶衣、毫微球、微乳或复乳。
具体实施方式
31.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
32.在本发明中使用的缩写具有下面的含义：
33.ala(alanine,a)：丙氨酸
34.glu(glutamic acid,e)：谷氨酸
35.his(histidine,h)：组氨酸
36.ile(isoleucine,i)：异亮氨酸
37.leu(leucine,l)：亮氨酸
38.lys(lysine,k)：赖氨酸
39.met(methionine,m)：甲硫氨酸
40.pro(proline,p)：脯氨酸
41.thr(threonine,t)：苏氨酸
42.gln(glutamine,q)：谷氨酰胺
43.dcm(dichloromethane)：二氯乙烷
44.dmf(n,n-dimethyl malonate)：二甲基甲酰胺
45.fmoc(fluorenylmethoxycarbonyl)：芴甲氧羰基
46.hbtu：2-(1h-1-羟基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸
47.hobt(1-hydroxylbenzotriazole anhydrous)：1-羟基苯并三氮唑
48.nmp(n-methyl pyrrolidone)：n-甲基吡咯烷酮
49.tfa(trifluoroacetic acid)：三氟乙酸
50.hplc(high performance liquid chromatography)：高效液相谱
51.maldi-tof-ms：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
52.实施例所用固相合成载体rink酰胺树脂为天津南开合成责任有限公司产品。
53.hbtu、hobt、diea以及fmoc保护的天然氨基酸或d型的非天然氨基酸为上海吉尔生化公司以及北京欧凯纳斯科技有限公司产品。n-甲基吡咯烷酮(nmp)、三氟乙酸(tfa)为北京百灵威科技有限公司产品。dmf、dcm为国药集团化学试剂有限公司产品。谱纯乙腈为fisher公司产品。其他试剂如无说明均为国产分析纯产品。
54.实施例1多肽衍生物的构建
55.本发明以蛋白质数据库中帽依赖性核酸内切酶结构作为研究的依据，筛选出一系列具有帽依赖性核酸内切酶抑制活性的多肽，其序列通式为ala-x-his-ala-y-pro-glu-gln-lys，在该多肽ala-x-his-ala-y-pro-glu-gln-lys的基础上用硬脂酸进行修饰得到多肽衍生物。这类多肽衍生物结构通式为ala-x-his-ala-y-pro-glu-gln-lys(c
18
)，其中，x为疏水性的氨基酸，y为疏水性的氨基酸,c
18
为硬脂酸。
56.实施例2多肽衍生物的合成
57.多肽衍生物合成采用标准的fmoc固相方法。选用rink amide树脂，肽链由c端向n端延长。缩合剂为hbtu/hobt/diea。脱保护剂为/dmf溶液。裂解液为三氟乙酸(tfa)，粗肽水溶解后冻干保存。用中压液相谱法或高压液相谱法(hplc)分离纯化，纯肽含量大于90％。基质辅助激光解析飞行时间质谱(maldi-tof-ms)确定肽序列分子量。
58.实施例3：体外细胞抑制试验
59.如下进行cpe抑制试验以评估测试抗体的效力。
60.将96孔组织培养板中的mdck细胞与测试抗体和甲型流感(ifva/wsn/33(h1n1))在低感染率下于37℃培养72小时，通过添加0.5％甲醛来固定培养板，然后用0.5％结晶紫染，随后，用微盘分析仪(multiskan ascent,thermo)测波长570nm的吸光值，相对于病毒对照组，测试抗体将病毒诱导的cpe降低50％所需的浓度，表示50％有效剂量(ec50)，以及cc50值。用cpe抑制试验评估各多肽衍生物，其中，对ifv a/wsn/33流感病毒，多肽衍生物4
和9的ec
50
值小于10nm。
61.表1各候选多肽衍生物对ifv a/wsn/33的抑制活性
62.多肽衍生物编号ec
50
(nm)cc
50
(nm)多肽衍生物113》1000多肽衍生物222》1000多肽衍生物3108》1000多肽衍生物48.8》1000多肽衍生物585》1000多肽衍生物675》1000多肽衍生物7105》1000多肽衍生物888》1000多肽衍生物98.7》1000多肽衍生物1045》1000多肽衍生物1110.8》1000多肽衍生物12102》1000多肽衍生物1378》1000多肽衍生物1456》1000多肽衍生物1579》1000多肽衍生物1678》1000
技术特征：
1.一种多肽衍生物，其特征在于：以硬脂酸修饰多肽序列得到，其结构式为：ala-x-his-ala-y-pro-glu-gln-lys(c
18
)，其中，x、y均为疏水性氨基酸，c
18
为硬脂酸。2.根据权利要求1所述的多肽衍生物，其特征在于：所述的x、y分别为ala、leu、ile、pro、thr、val、met中的一种。3.根据权利要求1或2所述的多肽衍生物，其特征在于：所述的多肽衍生物分别为：多肽衍生物1：ala-leu-his-ala-val-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物2：ala-leu-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物3：ala-ala-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物4：ala-ala-his-ala-val-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物5：ala-val-his-ala-val-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物6：ala-ala-his-ala-ala-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物7：ala-leu-his-ala-leu-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物8：ala-ile-his-ala-ile-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物9：ala-met-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物10：ala-pro-his-ala-met-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物11：ala-thr-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物12：ala-pro-his-ala-thr-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物13：ala-pro-his-ala-ile-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物14：ala-ile-his-ala-pro-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物15：ala-met-his-ala-ile-pro-glu-gln-lys(c
18
)；多肽衍生物16：ala-ile-his-ala-met-pro-glu-gln-lys(c
18
)；4.权利要求1-3任一项的多肽衍生物在制备预防或流感疾病的药物中的用途。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述与流感病毒感染相关的疾病为甲型h1n1流感。6.一种用于预防或流感疾病的药物，其特征在于：包括权利要求1-3中任一项所述的多肽衍生物，以及药学上可接受的辅料。7.根据权利要求6中所述的用于预防或流感疾病的药物，其特征在于：药物的剂型包括注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂、气雾剂、肠溶衣、毫微球、微乳或复乳。
技术总结
本发明提供了一种抗H1N1流感病毒的多肽衍生物和用途，具体地，本发明的多肽衍生物结构通式为Ala-X-His-Ala-Y-Pro-Glu-Gln-Lys(C
技术研发人员：
葛瑞
受保护的技术使用者：
北京凯因格领生物技术有限公司
技术研发日：
2022.10.10
技术公布日：
2023/2/23
