靶向Her-2CAR-NK应用于肿瘤的方法与流程

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靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法
技术领域
1.本发明涉及肿瘤免疫疗法领域，特别涉及一种靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法。

背景技术：

2.在肿瘤的免疫疗法当中采用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)免疫细胞疗法可说是目前最有发展前景的选项之一。其通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(single chain fragment variable，scfv)和免疫细胞活化序列的融合蛋白即嵌合抗原受体(car)表达到免疫细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scfv通过跨膜区与免疫细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达car的免疫细胞，现有技术中通常用的是t细胞，其以抗原依赖、但非mhc限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。在car与肿瘤细胞上肿瘤相关抗原结合后为免疫提供活化信号引起免疫细胞活化，表现为cars依赖的杀伤、增殖及细胞因子释放，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。这些效应功能可用来设计合成新的car如包含多个嵌合活化区的car，如胞内具有1个、2个或3个信号基序的1代、2代和3代cars。早期设计的cars比较简单，仅有一个胞内信号区，又称第1代car，信号主要通过cd3ζ上的免疫受体酪氨酸激酶活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,itam)传导，与cd3分子相比，只有3个itam，且缺乏共刺激分子传导的第2信号，因此第1代cars只有较弱的抗肿瘤作用，由于缺乏t细胞增殖的第2信号，t细胞在结合肿瘤抗原后很难进一步增殖，因此在临床应用中效果较差；2代cars是在1代的基础上添加一个胞内信号区,而这个信号区提供共刺激信号(如cd28、cd137)；3代cars则在胞内添加了两个串联的共刺激信号区。此外，近年又出现了第4代cars，引入一个细胞内结构域，该结构域能够触发原本由细胞因子诱导的信号(signal 3)进一步增强t细胞应答。第四代cars也称为truck，即t cells redirected for universal cytokinemediated killing，既具有共刺激因子又具有促炎因子，例如白介素il-12，从而提高t细胞功效。第四代car不仅限于il-12，已开发出不同类型的分子用于构建truck。这些细胞因子包括il-15(类似于il-12，这种白介素可增强t记忆干细胞的发育)、il-18，以及组成性活跃的细胞因子受体，例如il-7受体(c7r)，其目的是克服细胞因子毒性的风险。trucks的其他一些测试包括敲除基因(pd-1或dgk)和敲入基因(trac或cxcr4)，其目的是改善car表达和抗肿瘤活性。
3.然而现有的嵌合抗原受体免疫细胞疗法在用于肿瘤上仍有许多不尽理想之处。例如car-t细胞过程中会出现多种不良反应，包括细胞因子释放综合征、神经系统毒性、肿瘤溶解综合征、血细胞减少、感染，低免疫球蛋白血症及乙肝病毒激活等。而且由于这些毒副反应的临床表现往往错综复杂，变化多端，进展迅速；而且每种car-t细胞制品因为生产工艺或car结构的不同有着独特不同的毒性反应特征，因此这些毒副作用有待进一步充分的认识及精确的评估。

技术实现要素：

4.本发明的一个优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其应用一含有靶向her-2 car序列的核酸构建体转染患者nk细胞，其中所述核酸构建体的胞外抗原结合区是来源于靶向特定目标抗原的单克隆抗体，再将转染后的car-nk细胞输回患者体内进行肿瘤免疫疗法，从而协助患者清除或减少体内肿瘤细胞。
5.本发明的一个优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其中car-nk细胞保留了通过其天然受体识别和靶向肿瘤细胞的内在能力，从而通过car靶向时，肿瘤细胞能够逃脱杀伤的可能性降低，并且car-nk细胞疗法，在临床试验中，均显示数天至数周内不会发生免疫排斥反应，相较于car-t细胞疗法，car-nk细胞疗法较安全，例如不存在细胞因子释放综合征的困扰，同时nk细胞不需要严格的hla匹配，因此不会引起移植物抗宿主病。本发明的另一优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其靶向her-2 car序列的跨膜结构域可来源于cd8、cd28和nkg2d，从而能够促进car在细胞表面表达。
6.本发明的另一优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其靶向her-2 car序列的共刺激域来源于cd28、cd137、2b4和dap10，以实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，提高nk细胞的抗肿瘤能力。
7.本发明的一个优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其靶向her-2 car序列的信号转导结构域为t细胞受体tcr/cd3ζ链或免疫球蛋白fc受体fcεriγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，itams)，以发挥细胞信号转导功能。
8.本发明的另一优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其可经由慢病毒(lentivirus)载体转染，从而具备高于γrv的转导效率、转基因负荷量更大，且基因毒性更小。
9.本发明的另一优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其可经由慢病毒载体转染，从而区别一般的逆转录病毒载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并且能将外源基因有效地整合到宿主染体上，从而达到持久性表达，此外在感染能力方面也能有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因效果，具有广阔的应用前景。
10.本发明的另一优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其可经由慢病毒载体转染，从而搭配使用hiv-1rev response element(rre)允许rev辅助的未剪接病毒mrna出核；3’terminal truncated ltr去除了u3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；启动下游car结构基因表达的启动子，如人自身的泛素c启动子、ef1a启动子，efs启动子等；以及cppt和wpre元件，提高转导效率和转基因的表达效率。
11.本发明的一个优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其用于car导入的nk细胞来源可以是自体的、同种异体、干细胞分化或特定细胞系。
12.本发明的另一优势在于提供一靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其方法易操作且成本效益高。
13.为了达到以上至少一种优势，本发明提出了一种靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其包括步骤：向受试者施用含有靶向her-2 car序列的核酸构建体的nk细胞，其
中所述核酸构建体表现核酸序列选自seq id no:1-7中的至少一种或其组合。
14.根据本发明的一些实施例，其具体包含如下步骤：
15.s1.准备含有靶向her-2 car序列的核酸构建体；
16.s2.准备nk细胞；
17.s3.将含有靶向her-2 car序列的核酸构建体导入所述nk细胞，制成靶向her-2 car-nk细胞；以及
18.s4.将所述靶向her-2 car-nk细胞施用给受试者，实现car修饰免疫细胞。
19.根据本发明的一些实施例，其其中所述步骤s2进一步包括下列步骤：
20.s21.从患者体内获取血液，加入抗凝剂防止血液凝固；
21.s22.用白细胞分离术以除去血液中的血小板和红细胞，获得外周血单核细胞(pbmc)；以及
22.s23.从外周血单核细胞中分离出目标免疫效应细胞，通过进一步富集并激活免疫效应细胞，进行体外扩增培养。
23.根据本发明的一些实施例，其所述含有靶向her-2 car序列的核酸构建体的nk细胞被包含在载体中。
24.根据本发明的一些实施例，其所述载体是慢病毒载体。
25.根据本发明的一些实施例，其所述方法应用于乳腺癌。
26.根据本发明的另外一方面，本发明还提供一种靶向her-2 car-nk细胞在制备用于肿瘤的药物中的用途，其中所述her-2 car-nk细胞包含选自seq id no:1-7中的至少一种或其组合的核酸构建体。
附图说明
27.图1是根据本发明的优选实施例的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法的流程图。
28.图2是根据本发明的优选实施例的含有靶向her-2 car序列的核酸构建体转染的ps-nk细胞对肿瘤细胞杀伤力检测。
29.图3是根据本发明的优选实施例的含有靶向her-2 car序列的核酸构建体转染的car-nk细胞与不同细胞共培养后ifn-γ分泌水平。
具体实施方式
30.以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
31.为达到理想效果，嵌合抗原受体car常由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域以及包含或不包含共刺激结构域的细胞内信号传导结构域序贯串联组成。
32.其中，信号肽是负责把新合成的蛋白质引导到细胞含不同膜结构亚细胞器内的短(长度5-30个氨基酸)肽链，一般位于蛋白的n端。根据本发明的优选实施例提供的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法采用的核酸构建体的cd8a信号肽，其核酸及多肽序列分别
domain、以及nkg2d transmembrane domain，共适合于连接于铰链区cd8 hinge,其核酸及多肽序列分别如下：
[0050]-cd8 transmembrane domain
[0051]
核酸序列
[0052]
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcacc
[0053]
多肽序列
[0054]
iyiwaplagtcgvlllslvit
[0055]-cd28 transmembrane domain
[0056]
核酸序列
[0057]
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg
[0058]
多肽序列
[0059]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv
[0060]-nkg2d transmembrane domain
[0061]
核酸序列
[0062]
ccattttttttctgctgcttcatcgctgtagccatgggaatccgtttcattattatggtaaca
[0063]
多肽序列
[0064]
pfffccfiavamgirfiimvt
[0065]
另外，共刺激域可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，提高nk细胞的抗肿瘤能力。根据本发明的优选实施例提供的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法采用的核酸构建体的cd137 costimulatory domain、cd28costimulatory domain、dap10 costimulatory domain、以及2b4 costimulatory domain，其核酸及多肽序列分别如下：
[0066]-cd137 costimulatory domain
[0067]
核酸序列
[0068]
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
[0069]
多肽序列
[0070]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0071]-cd28 costimulatory domain
[0072]
核酸序列
[0073]
aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc
[0074]
多肽序列
[0075]
·
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs
[0076]-dap10 costimulatory domain
[0077]
核酸序列
[0078]
ctgtgcgcacgcccacgccgcagccccgcccaagatggcaaagtctacatcaacatgccaggcaggggc
[0079]
多肽序列
[0080]
lcarprrspaqdgkvyinmpgrg
[0081]-2b4 costimulatory domain
[0082]
核酸序列
[0083]
tggaggagaaagaggaaggagaagcagtcagagaccagtcccaaggaatttttgacaatttacgaagatgtcaaggatctgaaaaccaggagaaatcacgagcaggagcagacttttcctggaggggggagcaccatctactctatgatccagtcccagtcttctgctcccacgtcacaagaacctgcatatacattatattcattaattcagccttccaggaagtctggttccaggaagaggaaccacagcccttccttcaatagcactatctatgaagtgattggaaagagtcaacctaaagcccagaaccctgctcgattgagccgcaaagagctggagaactttgatgtttattcc
[0084]
多肽序列
[0085]
wrrkrkekqsetspkefltiyedvkdlktrrnheqeqtfpgggstiysmiqsqssaptsqepaytlysliqpsrksgsrkrnhspsfnstiyevigksqpkaqnparlsrkelenfdvys
[0086]
信号转导结构域通常为t细胞受体tcr/cd3ζ链或免疫球蛋白fc受体fcεriγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，itams)。发挥细胞信号转导功能。根据本发明的优选实施例提供的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法采用的核酸构建体的cd3ζsignaling domain，其核酸及多肽序列分别如下：
[0087]
核酸序列
[0088]
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
[0089]
多肽序列
[0090]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0091]
优选地，基于上述序列，根据本发明的多个优选实施例提供的靶向her-2car-nk应用于肿瘤的方法采用的核酸构建体的序列组合分别如下，其具体核酸及多肽序列如前述：
[0092]
seq id no:1-cd8 sp-her-2scfv(frp5)-cd8 h-cd8 tmd-cd137 cd-cd3ζsd核酸构建体
[0093]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacaactgcagcagtctggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagactcggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctct-ggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttct-gacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactcca
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[0094]
seq id no:2-cd8 sp-her-2scfv(frp5)-cd8 h-cd28 tmd-cd28 cd-cd3ζsd核酸构建体
[0095]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacaactgcagcagtctggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagactcggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctct-ggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttct-gacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacgttcggctcggggacaaaattggagatcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
[0096]
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[0097]
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[0098]
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[0099]
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[0100]
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[0101]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacaactgcagcagtctggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagactcggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctct-ggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttct-gacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacgttcggctcggggacaaaattggagatcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatccattttttttctgctgcttcatcgctgtagccatgggaatccgtttcattattatggtaacatggaggagaaagaggaaggagaagcagtcagagaccagtcccaaggaatttttgacaatttacgaagatgtcaaggatctgaaaaccaggagaaatcacgagcaggagcagacttttcctggaggggggagcaccatctactctatgatccagtcccagtcttctgctcccacgtcacaagaacctgcatatacattatattcattaattcagccttccaggaagtctggttccaggaagaggaaccacagcccttccttcaatagcactatctatgaagtgattggaaagagtcaacctaaagcccagaaccctgctcgattgagccgcaaagagctggagaactttgatgtttattccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
[0102]
seq id no:6-cd8 sp-her-2scfv(frp5)-cd8 h-nkg2d tmd-2b4 cd-dap10 cd-cd3ζsd核酸构建体
[0103]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacaactgcagcagtctggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagactcggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctct-ggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttct-gacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacgttcggctcggggacaaaattggagatcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggct
ggacttcgcctgtgatccattttttttctgctgcttcatcgctgtagccatgggaatccgtttcattattatggtaacatggaggagaaagaggaaggagaagcagtcagagaccagtcccaaggaatttttgacaatttacgaagatgtcaaggatctgaaaaccaggagaaatcacgagcaggagcagacttttcctggaggggggagcaccatctactctatgatccagtcccagtcttctgctcccacgtcacaagaacctgcatatacattatattcattaattcagccttccaggaagtctggttccaggaagaggaaccacagcccttccttcaatagcactatctatgaagtgattggaaagagtcaacctaaagcccagaaccctgctcgattgagccgcaaagagctggagaactttgatgtttattccctgtgcgcacgcccacgccgcagccccgcccaagatggcaaagtctacatcaacatgccaggcaggggcagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
[0104]
seq id no:7-cd8 sp-her-2scfv(frp5)-cd8 h-nkg2d tmd-cd137cd-2b4 cd-cd3ζsd核酸构建体
[0105]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacaactgcagcagtctggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtatcctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaacacctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagactcggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacggctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctct-ggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttct-gacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaacttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacgttcggctcggggacaaaattggagatcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatccattttttttctgctgcttcatcgctgtagccatgggaatccgtttcattattatggtaacaaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgtggaggagaaagaggaaggagaagcagtcagagaccagtcccaaggaatttttgacaatttacgaagatgtcaaggatctgaaaaccaggagaaatcacgagcaggagcagacttttcctggaggggggagcaccatctactctatgatccagtcccagtcttctgctcccacgtcacaagaacctgcatatacattatattcattaattcagccttccaggaagtctggttccaggaagaggaaccacagcccttccttcaatagcactatctatgaagtgattggaaagagtcaacctaaagcccagaaccctgctcgattgagccgcaaagagctggagaactttgatgtttattccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
[0106]
使用根据本发明的多个优选实施例提供的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的
方法时，将car导入的nk细胞的来源可以是自体的、同种异体、干细胞分化或特定细胞系，本发明在此不受限制。
[0107]
与car-t细胞不同，本发明的靶向her-2 car-nk细胞保留了通过其天然受体识别和靶向肿瘤细胞的内在能力，从而通过car靶向时，肿瘤细胞能够逃脱杀伤的可能性降低。其次，靶向her-2 car-nk细胞疗法，数天至数周内不会发生免疫排斥反应。因此，与许多car-t细胞疗法的临床试验相比，靶向her-2 car-nk细胞疗法均未表现出类似的安全问题，例如不存在细胞因子释放综合征的困扰。最后，nk细胞不需要严格的hla匹配，因此不会引起移植物抗宿主病，这是car-nk细胞疗法的巨大优势，同时也是car-t细胞免疫的重大风险。
[0108]
在转染技术方面，用于将核酸构建体导入免疫细胞的方法有很多，其中若利用标准试剂方法不易导入dna和rna，而慢病毒载体(lentiviral vector)、逆转录病毒载体(retroviral vector,rv)、转座子和mrna电穿孔技术则是较为常见转导方法。优选地，本发明使用慢病毒载体具有最大优势，包括由于慢病毒载体含有顺式作用元件中央多聚嘌呤区(central polypurine tract，cppt)使其能有效感染静止t细胞，并且慢病毒载体转导效率高于γrv；转基因负荷量更大，可容纳6.5kb的外源基因且基因毒性更小等等，但本发明在此不受限制。
[0109]
此外，慢病毒表达载体还包含用于质粒复制的原核复制子puc ori序列；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子sv40ori序列；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件：来自于rous sarcoma virus的转录增强子和启动子(rsv enhancer/promoter)元件来起始慢病毒mrna的转录；来自于hiv-1的截短5
‘
长重复序列(hiv-1truncated 5
′
ltr)来介导病毒包装和病毒基因组的反转录及病毒包装信号hiv-1psi(ψ)；hiv-1rev response element(rre)，该元件允许rev辅助的未剪接病毒mrna出核；3’terminal truncated ltr去除了u3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；启动下游car结构基因表达的启动子，如人自身的泛素c启动子、ef1a启动子，efs启动子等；以及cppt和wpre元件，提高转导效率和转基因的表达效率。
[0110]
导入编码car核酸序列的慢病毒表达载体与包装载体共转染293t细胞后共转染包装细胞(如293t细胞)，在细胞中进行病毒的包装，收集上清中包装好的病毒颗粒，用于感染免疫细胞(如nk细胞)，使car序列整合进入免疫细胞的基因组中后在免疫细胞上稳定表达，进一步发挥设计的生理作用。
[0111]
具体地，请参考图1，根据本发明的多个优选实施例提供的靶向her-2car-nk应用于肿瘤的方法的流程优选如下：
[0112]
s1.准备含有靶向her-2 car序列的核酸构建体，其中所述核酸构建体表现之多肽序列选自seq id no:1-7中的至少一种或其组合；
[0113]
s2.准备nk细胞；
[0114]
s3.将含有靶向her-2 car序列的核酸构建体导入所述nk细胞，制成靶向her-2 car-nk细胞；以及
[0115]
s4.将所述靶向her-2 car-nk细胞输给患者，实现car修饰免疫细胞。
[0116]
其中，在步骤s1当中的核酸构建体可依据上述本发明提供的seq id no:1-7序列
自行制作、委外制作或购买，其中可选的制作方式也将于后方关于实验的部份具体描述。
[0117]
其次，在步骤s2当中如采用患者自体nk细胞，可包含下列步骤：
[0118]
s21.从患者体内获取一定量的血液，加入抗凝剂防止血液凝固；
[0119]
s22.用淋巴细胞分离术以除去血液中的血小板和红细胞，获得外周血单核细胞(pbmc)；以及
[0120]
s23.从pbmc中分离出目标免疫效应细胞，通过进一步富集并在一定条件下利用il-2、cd3等激活免疫效应细胞，进行体外扩增培养。
[0121]
另外，在步骤s3当中可选择使用慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、mrna电穿孔技术、或甚至传统标准试剂方法将含有靶向her-2 car序列的核酸构建体导入所述nk细胞，本发明在此不受限制。优选地，在在步骤s2当中采用慢病毒载体将含有靶向her-2 car序列的核酸构建体导入所述nk细胞，其中，mrna在胞质中经核糖体翻译后表达car，dna通过整合到免疫效应细胞的基因组中使免疫效应细胞能够表达car。此外，可选地，也可根据需求，在体外进行进一步扩增培养，获得剂量数目的car修饰免疫细胞。
[0122]
最后，在步骤s4当中可包含下列步骤：
[0123]
s41.对获得的所述靶向her-2 car-nk细胞进行免疫分型、存活力、内毒素等方面的检测，确保生产的所述靶向her-2 car-nk细胞细胞纯度和安全性；以及
[0124]
s42.将检测后的所述靶向her-2 car-nk细胞输给患者，实现car修饰免疫细胞。
[0125]
以下为具体实验部分，首先构建含有efs启动子启动外源基因表达的慢病毒载体作为穿梭载体，使用efs-turborfp-t2a-zsgreen1序列插入clai(2)-kpni(2337)处插入替换起始载体pcdh-ubc-dsred-luc-ef1 hygro(addgene#129437)的clai(1925)-kpni(7692)，获得plenti-efs-turborfp-t2a-zsgreen载体。辅助载体采用pmd2.g载体并以hindiii+noti酶切接入baevrless片段得到pbaevr。根据本发明所提供的上述序列合成anti-her2 car序列，并以xbal+xhoi酶切接入plenti-efs-turborfp-t2a-zsgreen载体，得到pher2-car1。然后使用低传代数293t细胞进行慢病毒包装及滴度测定确认，确保获得适当含有根据本发明提供的靶向her-2 car序列的核酸构建体的慢病毒。
[0126]
在免疫细胞部份，采取20ml新鲜抗凝血，用淋巴分离液(购自ge公司)分离外周血单核细胞(pbmc)。分离的细胞计数后，按2.5x10^6/孔密度在包被过cd16的6孔板中刺激培养72h，之后再换普通的6孔板继续培养扩增72h。用nk磁珠分选纯化细胞(购自miltenyi biotec公司)，加含10％fbs+200iu/ml il-2的1640(购自thermo scientific)培养基继续进行诱导培养，得到纯化的nk细胞，并用流式检测表型比例，确认制备的nk细胞比例大于90％。
[0127]
得到纯化后的nk细胞，按每孔约2.5
×
10 6
nk细胞接种到24孔板(bd biosciences)中，并在终浓度protamine sulfate 8ug/ml(sigma-aldrich)及bx795 1.5um(sigma-aldrich)的存在下与适量的病毒上清液混合，最终体积不超过1ml。补充细胞因子，并将板在室温下以1000
·
g离心1小时。离心后，不除去病毒上清液，将板在37℃，5％co 2下孵育4-6小时。孵育结束后，在室温下以1000
·
g的速度进行第二次离心1小时，然后从孔和1ml新鲜的nk细胞生长培养基。将细胞在每天添加细胞因子的培养基中维持2天后，从而获得表达her-2 car-nk细胞，并进行进一步检测鉴定，包括使用不同转染试剂效果比较、慢病
毒按不同moi感染nk细胞效果比较、转染效率鉴定(将转染后nk细胞用重组human her-2蛋白孵育15min,4℃，洗涤后用鼠抗人anti-igg1孵育15min,4℃，进一步行流式检测)、以及嵌合肿瘤抗原受体表达鉴定确认检测到nk细胞膜上car分子的表达。
[0128]
请参见图2，其显示了根据本发明的优选实施例的含有靶向her-2 car序列的核酸构建体转染的ps-nk细胞对肿瘤细胞杀伤力检测结果，其中检测方式为将her-2阳性乳腺癌细胞bt474用培养基调整到1x10^6/ml，加入终浓度为5ug/ml calcein-am进行标记，37度孵育1h，用pbs洗涤三遍后，用无酚红1640完全培养基重悬细胞，计数。接着，调整肿瘤细胞10000/孔加入到96孔圆底板中。按e:t为10:1；5:1；2.5:1；1.25:1；0.625:1；分别加入nk细胞、空载体转染的mock nk细胞及car-nk细胞1x105；5x104；2.5x104；1.25x104；0.625x104。肿瘤细胞再加一组2％triton x-100及不处理组，100g离心5分钟，37度共培养3h后，300g离心5分钟，每孔吸取100ul转移至96平底板中检测od值。检测结果表明car-nk细胞对her-2阳性乳腺癌细胞杀伤力显着高于对照nk细胞，足以证实根据本发明的优选实施例的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法具有疗效，特别是对于乳腺癌而言。
[0129]
其次，请参见图3，其显示了根据本发明的优选实施例的含有靶向her-2 car序列的核酸构建体转染的car-nk细胞与不同细胞共培养后ifn-γ分泌水平。其中检测方式为将淋巴母细胞lcl、her-2阳性乳腺癌细胞bt474及her-2阴性乳腺癌细胞mda-mb-231按e:t为2.5:1与nk细胞、空载体转染的mock nk细胞及car-nk细胞共培养12小时后取上清行elisa检测上清中ifn-γ的浓度。检测结果显示含有靶向her-2 car序列的核酸构建体转染的car-nk细胞对于her-2阳性乳腺癌细胞bt474的ifn-γ的浓度显着高于nk细胞及空载体转染的mock nk细胞，这也证实根据本发明的优选实施例的靶向her-2car-nk应用于肿瘤的方法具有疗效，特别是对于乳腺癌而言。
[0130]
本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

技术特征：

1.一种靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其特征在于包括步骤：向受试者施用含有靶向her-2 car序列的核酸构建体的nk细胞，其中所述核酸构建体表现核酸序列选自seq id no:1-7中的至少一种或其组合。2.根据权利要求1所述的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其具体包含如下步骤：s1.准备含有靶向her-2 car序列的核酸构建体；s2.准备nk细胞；s3.将含有靶向her-2 car序列的核酸构建体导入所述nk细胞，制成靶向her-2 car-nk细胞；以及s4.将所述靶向her-2 car-nk细胞施用给受试者，实现car修饰免疫细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤s2进一步包括下列步骤：s21.从患者体内获取血液，加入抗凝剂防止血液凝固；s22.用白细胞分离术以除去血液中的血小板和红细胞，获得外周血单核细胞(pbmc)；以及s23.从外周血单核细胞中分离出目标免疫效应细胞，通过进一步富集并激活免疫效应细胞，进行体外扩增培养。4.根据权利要求1至3中任一所述的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其中所述含有靶向her-2 car序列的核酸构建体的nk细胞被包含在载体中。5.根据权利要求4所述的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其中所述载体是慢病毒载体。6.根据权利要求1至3中任一所述的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其中所述方法应用于乳腺癌。7.根据权利要求5所述的靶向her-2 car-nk应用于肿瘤的方法，其中所述方法应用于乳腺癌。8.一种靶向her-2 car-nk细胞在制备用于肿瘤的药物中的用途，其中所述her-2 car-nk细胞包含选自seq id no:1-7中的至少一种或其组合的核酸构建体。9.根据权利要求8所述的靶向her-2 car-nk细胞在制备用于肿瘤的药物中的用途，其中所述her-2 car-nk细胞还包含慢病毒载体。10.根据权利要求8至9中任一所述的靶向her-2 car-nk细胞在制备用于肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤是乳腺癌。

技术总结

本发明公开一靶向Her-2CAR-NK应用于肿瘤的方法，其包括下列步骤：准备含有靶向Her-2CAR序列的核酸构建体、准备NK细胞、将含有靶向Her-2CAR序列的核酸构建体导入所述NK细胞，制成靶向Her-2CAR-NK细胞、以及将所述靶向Her-2CAR-NK细胞输给患者，实现CAR修饰免疫细胞。细胞。细胞。