合成致死纳米药物组合载体及其在制备GBM靶向药物上的应用

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合成致死纳米药物组合载体及其在制备gbm靶向药物上的应用
技术领域
1.本发明属于纳米药物制备技术领域，涉及一种合成致死纳米药物组合载体及其在制备gbm靶向药物上的应用。

背景技术：

2.胶质母细胞瘤(glioblastoma，gbm)是起源于神经胶质细胞、最常见的原发性炉内恶性肿瘤。gbm的年发病率为3-8人/10万人，约占中枢神经系统所有肿瘤的27％，恶性肿瘤的80％，并且gbm还在以1～2％的年增长率逐年递增。依据肿瘤细胞是否具有核分裂多见、多形性、血管内皮细胞增殖以及坏死的特征，世界卫生组织将gbm的恶性程度定性为iv级(最高级)。目前，临床上尚无有效的gbm手段，gbm患者的1年及5年生存率分别只有30％和4％，平均中位生存时间只有12～15个月。
3.p53基因编码一种分子量为43.7kda的蛋白质。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。p53突变(tp53
mut
)高度涉及包括多形性胶质母细胞瘤(gbm)在内的各种肿瘤的发生和发展，而直接靶向tp53
mut
总是引起耐药，因此受到限制。合成致死(sl)是一种通过药物干预阻断致癌基因突变的代偿途径以诱导细胞死亡的策略，具有gbm的巨大潜力。
4.对于使用组合化学药物的手段，合理的药物比例、同步递送、有效的药物浓度、组织靶向性和准确的窗口仍然是未解决的问题，这限制了化学药物在肿瘤中的进一步应用。随机包封形成纳米药物很难精确调节药物的组合比例，而预先混合纳米药物单独封装药物可能克服这一缺点，但制备不同药物时制备的纳米颗粒的均匀性质难以控制。因此，合理指定共递送纳米平台可能是合成致死性的理想策略，通过精确可控的施加药物可以显着降低对正常细胞的毒性，减少对非目标器官或组织的潜在损害。

技术实现要素：

5.本发明目的之一在于提供一种合成致死纳米药物组合载体，具备还原、酸和螯合竞争的响应释放药物的能力，可以同时装载两种药物，两种药物释放能力高且时空可控，发挥协同增效作用。
6.本发明目的之二在于提供上述合成致死纳米药物组合载体在制备gbm靶向药物上的应用，具有良好的生物安全性，相比于游离的药物，纳米药物增强合成致死效果。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.本发明提供一种合成致死纳米药物组合载体，该组合载体包括多肽、含有多羟基的酰胺类化合物、含有联吡啶基团的酰胺类化合物、含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物、组蛋白去乙酰化酶抑制药物和含有二硫键的化合物；所述含有多羟基的酰胺类化合物与含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物通过反应生成硼酯键，所述含有联吡啶基团的酰胺类化合物与组蛋白去乙酰化酶抑制药物通过锌离子进行螯合。
9.在一个技术方案中，所述含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物为硼替佐米。
10.在一个技术方案中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制药物为帕比司他。
11.在一个技术方案中，所述多肽为巯基修饰的多肽。
12.在一个技术方案中，所述含有多羟基的酰胺类化合物选自n-丙烯酰基葡萄糖胺。
13.在一个技术方案中，所述含有联吡啶基团的酰胺类化合物选自n-(2-丙烯酰胺乙基)
ꢀ‑
[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺、n-(3-丙烯酰胺丙基)-[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺和n-(4-丙烯酰胺丁基)-[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺。
[0014]
在一个技术方案中，所述组合载体为球形结构。
[0015]
本发明还提供上述纳米药物组合载体在制备gbm靶向药物上的应用。
[0016]
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0017]
本发明制备的纳米药物组合载体具备还原、酸和螯合竞争的响应释放药物的能力，可以同时装载两种药物，药物装载效率高，两种药物释放能力高且时空可控，发挥协同增效作用。
[0018]
本发明制备的纳米药物组合载体中包括巯基修饰的多肽，相比不含多肽的纳米药物，具有主动靶向细胞膜表面高表达lrp1蛋白的gbm细胞(snb19和ln229)的能力。
[0019]
本发明利用纳米药物组合载体制备的纳米药物，在体外细胞实验和原位tp53
mut
gbm 小鼠模型中，相比于游离的药物，纳米药物增强合成致死效果；具有良好的生物安全性，对血常规、血生化、各小鼠器官和正常脑组织不产生副作用。
附图说明
[0020]
图1为本发明中aga的合成路线。
[0021]
图2为本发明aga的核磁表征结果。
[0022]
图3为本发明aga-btz的合成路线。
[0023]
图4为本发明aga-btz的核磁表征结果。
[0024]
图5为本发明aabc的合成路线。
[0025]
图6为本发明aabc的核磁表征结果。
[0026]
图7为本发明aabc-zn-lbh589的合成路线。
[0027]
图8为本发明aabc-zn-lbh589的紫外线吸收光谱。
[0028]
图9为本发明apoe-nm@(btz/lbh589)的制备方法。
[0029]
图10为本发明apoe-nm@(btz/lbh589)、nm@(btz/lbh589)、nm@btz、 nm@lbh589及apoe-nm的tem、尺寸、分散系数和表面电位。
[0030]
图11为本发明纳米药物响应性释放药物的能力，其中图11a为随时间变化的药物释放曲线；图11b为药物释放后，纳米粒子形貌变化(tem表征)。
[0031]
图12为本发明免疫印迹法表征多肽apoe的受体表达情况，包括lrp1，ldlr和lrp2，在gbm(snb19和ln229)和正常星形胶质细胞(ha1800)的细胞膜表面的表达情况。
[0032]
图13为本发明apoe对snb19和ln229细胞的靶向能力。
[0033]
图14为本发明体外bbb模型构建以及纳米药物穿越血脑屏障能力评估。
[0034]
图15为本发明纳米药物抑制细胞存活影响评估。
[0035]
图16为本发明游离药物和纳米药物对snb19和ln229细胞内质网应激的影响。
[0036]
图17为本发明游离药物和纳米药物引起snb19和ln229细胞的凋亡程度。
[0037]
图18为本发明纳米药物体内分布情况，其中图18a为ivis lumina iii成像系统实时监测纳米药物在原位荷瘤小鼠体内分布情况；18b为纳米药物注射4小时后，ivis luminaiii成像系统检测纳米药物在小鼠各器官分布情况；18c为纳米药物注射4小时后，获取小鼠脑，冷冻切片处理后，荧光显微镜检测纳米药物分布情况；18d为纳米药物注射4小时后，取小鼠正常脑组织、肿瘤组织和各器官，匀浆处理后，定量统计纳米药物的分布情况。
[0038]
图19为本发明纳米药物的原位tp53
mut
gbm实验过程及结果，其中图19a为动物实验流程图；图19b和图19c为snb19原位荷瘤模型中，小鼠体重变化及小鼠生存周期；图19d和图19e为ln229原位荷瘤模型中，小鼠体重变化及小鼠生存周期。
[0039]
图20为本发明各组的h&e染结果，其中图20a为肿瘤大小；图20b为正常脑组织和小鼠各器官是否存在病变。
[0040]
图21为本发明各组tunel阳性信号分布情况及统计学数据。
[0041]
图22为本发明各组的免疫组化分析结果，图22a为免疫组化表征在各组中 ki67和cc3阳性信号分布情况；图22b和图22c为cc3在脑的正常组织和肿瘤组织的分布情况及统计学数据。
[0042]
图23为本发明纳米药物对原位tp53
mut
gbm肿瘤中凋亡相关蛋白调控结果。
[0043]
图24为本发明纳米药物对小鼠血常规和血生化的影响，其中图24a为小鼠血常规结果，图24b为小鼠血生化结果。
[0044]
图25为本发明纳米药物对小鼠肝脏和肾脏中炎症因子表达情况的影响。
具体实施方式
[0045]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0046]
实施例一
[0047]
1、制备前药aga-btz
[0048]
1.1、制备aga
[0049]
采用d-(+)-半乳糖胺盐酸盐和丙烯酰氯(阿拉丁，中国)制备n-丙烯酰基葡萄糖胺 (aga)，具体合成路线如图1所示。将20ml含有0.02mol d-(+)-半乳糖胺盐酸盐的1mol/lk2co3放入反应瓶，并置于冰浴中冷却。在剧烈搅拌下，向溶液中缓慢滴加0.024mol丙烯酰氯。将反应在0-4℃下维持4小时，然后缓慢恢复至室温持续24小时用以恢复未反应的丙烯酰氯。随后，将粗产物冷冻干燥，并通过柱层析方法以甲醇/乙酸乙酯(20/80v/v)混合物作为洗脱液在硅胶柱上对产物aga进行纯化。使用1h nmr(300mhz)以dmso-d6 作为溶剂对aga进行检测，结果如图2所示。核磁(1hnmr)结果显示，aga被成功制备且纯度接近100％。
[0050]
1.2、制备aga-btz
[0051]
硼替佐米(btz)是哺乳动物细胞中26s蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂。aga 与btz反应生成aga-btz，aga-btz中的硼酯键具有酸响应能力，可实现药物的可控释放，aga-btz合成路线如图3所示。
[0052]
将相同摩尔质量的aga和btz(南京康满林)分别溶解在ddh2o和甲醇中，并加入反应瓶中。用naoh将反应溶液ph调节至8.5～9.0，反应持续48小时。先通过旋转蒸发仪除去甲醇，再用冷冻干燥机将样品冻干，最后使用柱层析法在硅胶柱上纯化产物aga-btz。使用1h nmr(300mhz)以cd3od作为溶剂对aga-btz纯度进行检测，结果如图4所示。核磁(1hnmr)结果显示，aga-btz被成功制备且纯度接近100％。
[0053]
2、制备前药aabc-zn-lbh589
[0054]
2.1、制备aabc
[0055]
aabc合成路线如图5所示。将[2,2
’‑
联吡啶]-5-羧酸(0.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺(edc，1.2mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.8mmol)分别分散于四氢呋喃(thf)中，并加入反应瓶中，反应2h以活化羧基，然后将n-(2-氨基乙基)丙烯酰胺(0.8mmol)分散于ddh2o中，并加入反应瓶，继续反应24小时。用旋转蒸发仪移除thf后，使用乙酸乙酯萃取得到产物n-(2-丙烯酰胺乙基)-[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺 (aabc)。并用1h nmr检测。使用1h nmr(400mhz)以dmso-d6作为溶剂对aabc 进行纯度检测，结果如图6所示。核磁(1hnmr)结果显示，aabc被成功制备且纯度接近100％。
[0056]
类似地，本发明还可以依据图6所示的合成路线将n-(2-氨基乙基)丙烯酰胺替换为 n-(3-氨基丙基)丙烯酰胺、n-(4-氨基丁基)丙烯酰胺，分别得到n-(3-丙烯酰胺丙基)
ꢀ‑
[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺(aabc-1)和n-(4-丙烯酰胺丁基)-[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺 (aabc-2)。
[0057]
2.2、制备aabc-zn-lbh589
[0058]
帕比司他(panobinostat，lbh589)是一种强效的口服组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂。将lbh589的异羟肟酸和aabc的联吡啶之间进行锌离子螯合制备前药 aabc-zn-lbh589，合成路线如图7所示。
[0059]
首先将等摩尔的aabc缓慢滴加到znso4·
7h2o溶液中，螯合15分钟后，将等摩尔的 lbh589(南京康满林)加入反应液中并搅拌过夜。最后通过紫外线吸收光谱测定是否成功制备aabc-zn-lbh589，结果如图8所示。紫外吸收光谱仪检测结果显示，通过锌离子螯合，aabc与lbh589被成功地连接，得到aabc-zn-lbh589。
[0060]
3、制备apoe-peg
[0061]
多肽apoe序列为lrklrkrlllrklrkrllc，是一种具有较高的脑靶向效率的氨基酸复合物。将巯基修饰的多肽apoe(apoe-sh，强耀生物)、丙烯酸酯peg2000马来酰亚胺(acrylamide-peg2000-mal，简称apeg-mal，5μmol)和三乙胺(15μmol)分别分散于提前除氧的二甲基亚砜(dmso)，混合后在氮气保护的无氧条件下，避光在37℃反应 24小时。为了除去未参与反应的apoe-sh、apeg-mal和三乙胺，将反应溶液放入3.4kda 截留分子量的透析袋中，在ddh2o中透析2天(换透析液6次)，随后冷冻干燥得到产物 apoe-peg。最后，通过bca蛋白定量的方法检测apeg的纯度。bca蛋白定量结果证实， apoe与peg的连接比例接近100％。
[0062]
4、制备和表征纳米药物
[0063]
4.1、制备纳米药物
[0064]
为了制备纳米药物apoe-nm@(btz/lbh589)，首先向反应瓶中通氮气30min以除去氧气，接着将0.60μmol aabc-zn-lbh589(分散于乙醇/ddh2o(3/1)的混合溶液中)， 0.18μ
mol aga-btz、0.045μmolapoe-peg、0.135μmolapeg和0.18μmoln,n
′‑
双(丙稀酰) 胱胺(baca)在氮气保护下混合加入放置于冰浴中的反应瓶中，搅拌混匀15分钟。随后，在氮气保护下将四甲基乙二胺(temed，0.88nmol)和过硫酸铵(aps，0.88nmol)加入到反应瓶中，封闭反应瓶，在冰浴中聚合反应2小时。反应终止后，将聚合物溶液逐滴加入到1
×
pbs缓冲液中即形成纳米药物。最后，为了纯化纳米药物，使用截留分子量为30kda 的超滤离心管除去多余的组分并用1
×
pbs洗涤纳米药物3次，最终得到纳米药物 apoe-nm@(btz/lbh589)。具体路线如图9所示。
[0065]
在制备纳米药物nm@(btz/lbh589)时，无需添加apoe-peg，添加apeg的摩尔量为0.18μmol，其他成分及步骤与制备apoe-nm@(btz/lbh589)相同。
[0066]
在制备纳米药物nm@btz时，将aga-btz替换为等摩尔的aga，其他成分及步骤与制备apoe-nm@(btz/lbh589)相同。
[0067]
在制备纳米药物nm@btz时，将aabc-zn-lbh589替换为等摩尔的aabc，其他成分及步骤与制备apoe-nm@(btz/lbh589)相同。
[0068]
在制备不装载药物的纳米粒子apoe-nm时，将aabc-zn-lbh589替换为等摩尔的 aabc，aga-btz替换为等摩尔的aga，其他成分及步骤与制备apoe-nm@(btz/lbh589) 相同。
[0069]
另外，为了制备装载cy5的纳米药物，在聚合时加入n-(2-氨基乙基)丙烯酰胺(0.09 μmol)和nhs-cy5(0.09μmol)，其它步骤不变。
[0070]
4.2、药物装载效率
[0071]
取超滤离心管中的外液，使用高效液相谱仪(hplc)检测apoe-nm@(btz/lbh589)、 nm@(btz/lbh589)中btz和lbh589的含量，即为多余的未形成纳米药物的游离药物，然后计算得到药物装载效率(dle)。结果如表1所示。结果与分析：nm@btz/lbh589 对btz和lbh589的装载效率分别约为68.7％和75％；apoe-nm@btz/lbh589对btz 和lbh589的装载效率分别约为65.3％和79.5％。nm@btz对btz的装载效率约为65.3％； nm@lbh589对lbh589的装载效率约为71.6％。
[0072]
表1纳米药物对btz和lbh589的装载效率
[0073]
纳米药物btz-dle(％)lbh589-dle(％)apoe-nm@(btz/lbh589)68.7
±
0.975.0
±
5.0nm@(btz/lbh589)65.3
±
6.079.5
±
5.6nm@btz65.3
±
1.9/nm@lbh589/71.6
±
0.5
[0074]
4.3、表征纳米药物
[0075]
为了检测各种纳米药物是否制备成功，采用动态光散射仪(dls)和透射电子显微镜 (tem)分别检测纳米药物的水动力学尺寸、分散系数、表面电位和形貌等。结果如图10 所示。结果与分析：纳米药物尺寸小于200nm，且尺寸分布均一(pdi《0.3)，结构为圆球形，表面呈现负电荷。
[0076]
5、响应物释放性能
[0077]
由于baca中的二硫键具有谷胱甘肽(gsh)或二硫苏糖醇(dtt)响应能力，aga-btz 中的硼酯键具有酸响应能力，aabc-zn-lbh589具有螯合竞争能力，本发明在体外模拟这些化学键的刺激响应能力以及响应造成的药物释放和纳米粒子结构破坏情况。
[0078]
将制备好的纳米药物apoe-nm@(btz/lbh589)装于透析袋中，并分别分散于条件为 ph 7.4、ph5.0、甘氨酸(gly，n(gly)/n(aabc-zn-lbh589)＝10/1)、ph 5.0/dtt(10mm) 和gly(n(gly)/n(aabc-zn-lbh589)＝10/1)/dtt(10mm)的1
×
pbs缓冲溶液中，放在温度为37℃、转速为100rpm的摇床中，在不同的时间点(2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时)取透析的外液。最后通过高效液相谱仪检测外液中被释放的btz 和lbh589的含量。在模式药物释放的第24h时，取出透析袋内的“纳米药物”，并用动态光散射仪和透射电子显微镜分别对其粒径和形貌进行检测，以表征刺激响应后药物释放对纳米结构的影响。结果如图11所示。结果显示：在响应性刺激下，随着时间延长，药物缓慢释放。在24小时时，在ph7.4条件下，几乎没有药物释放；在ph5.0条件下，约有44％btz 从纳米粒子中释放；在ph5.0/dtt(10mm)条件下，约有77％ btz从纳米粒子中释放；在gly(n(gly)/n(aabc-zn-lbh589)＝10/1)条件下，约有53％ lbh589从纳米粒子中释放；在gly(n(gly)/n(aabc-zn-lbh589)＝10/1)/dtt(10mm)条件下，约有75％ lbh589 从纳米粒子中释放。tem表征结构显示，在响应物释放24小时时，纳米粒子结构被破坏，呈现不规则结构。
[0079]
6、受体表达和apoe靶向能力检测
[0080]
6.1、gbm细胞膜上apoe的受体表达情况
[0081]
以正常星形胶质细胞ha1800为对照，研究snb19和ln229细胞膜上lrp1、lrp2 和ldlr的表达。
[0082]
首先根据细胞膜和细胞浆蛋白提取试剂盒的使用说明提取细胞膜蛋白，然后用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，再将蛋白质溶液(20μg/样品)与1
×
sds-page上样缓冲液混合并在95℃下变性10分钟。然后将蛋白样品添加于7.5％sds-聚丙烯酰胺凝胶孔道中，恒压80v电泳至蛋白marker完全分开，再将样品转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上(300 ma，1.5小时)。5％脱脂牛奶封闭pvdf膜1小时后，根据蛋白marker分子量及位置将pvdf 膜进行裁剪，并分别与一抗anti-lrp1 rabbit(1:1000稀释)，anti-lrp2 rabbit(1:1000稀释)， anti-ldlr rabbit(1:1000稀释)和anti-β-actin rabbit(1:1000稀释)在4℃孵育过夜。收集一抗，用1
×
tbst清洗膜3次，每次10分钟，然后将pvdf膜与二抗在室温下孵育1小时。收集二抗，用1
×
tbst清洗膜3次后，添加ecl超敏化学发光显影液，并用amersham imager680rgb仪器进行发光成像。结果如图12所示。结果显示：相比于正常星形胶质细胞ha1800， snb19和ln229细胞膜上lrp1蛋白高表达。
[0083]
6.2、apoe修饰的纳米药物对gbm细胞的靶向能力检测
[0084]
为了检测apoe修饰的纳米药物是否具有靶向snb19和ln229细胞的能力，将制备好的纳米药物nm@(btz/lbh589/cy5)和apoe-nm@(btz/lbh589/cy5)在相同的cy5含量下(酶标仪测定)，分别与snb19和ln229细胞共孵育4小时。移除培养液，并用1
×
pbs 清洗细胞3次，消化、离心并收集细胞，采用流式细胞仪收集并检测细胞中cy5荧光信号，然后用flowjo_v10软件进行结果分析；或者向细胞中加入4％多聚甲醛，10分钟后，用1
×ꢀ
pbs清洗细胞2次，接着加入dapi(10μg/ml)染细胞核10分钟，用1
×
pbs清洗细胞3 次，然后通过激光共聚焦显微镜采集荧光信号并成像(在各个样品中，采集cy5荧光时，保持参数一致)。结果如图13所示。结果显示：相比于nm@btz/lbh589/cy5，表面修饰apoe的纳米药物apoe-nm@btz/lbh589能够更多地进入snb19和ln229细胞，说明 apoe能够特异性与lrp1结合，发挥了主动靶向snb19和ln229细胞的能力。
[0085]
7、纳米药物穿越血脑屏障能力评估
[0086]
为了检测纳米药物穿越bbb的能力，本发明在体外建立血脑屏障模型。将bend.3(50,000个细胞/孔)接种在transwell小室中，并在下层孔板中(24孔板)加入800μl细胞培养液。在37℃、5％co2的无菌细胞培养箱中培养，当跨内皮细胞电子阻抗(teer)值高于200ωcm2时，向小室中加入具有相同cy5含量的纳米药物nm@(btz/lbh589/cy5)或apoe-nm@(btz/lbh589/cy5)，然后分别在4小时、12小时、24小时时从孔板中取出50μl培养液。最后，通过酶标仪检测培养液中cy5荧光值。结果如图14所示。结果显示：在24小时时，表面修饰apoe的纳米药物apoe-nm@btz/lbh589穿越bbb的数量约为nm@btz/lbh589/cy5的1.76倍。
[0087]
8、mtt法检测纳米药物对gbm细胞存活的影响
[0088]
将各种gbm细胞接种在96孔板(5,000个细胞/孔)中，在37℃、5％co2的无菌细胞培养箱中培养24小时后，将药物载体apoe-nm、不同药物浓度的游离药物btz/lbh589或纳米药物nm@btz+nm@lbh589nm@(btz/lbh589)、apoe-nm@(btz/lbh589)分别加入到培养液中，孵育48小时。接着将10μlmtt(5mg/ml)溶液加入培养液并孵育4小时后，移除培养液并向样品孔中加入150μl二甲基亚砜，在室温下摇晃孵育15分钟，最后，使用酶标仪测量波长为490nm的吸光值。每个样品有三个复孔。结果如图15所示。结果显示：不负载药物的纳米粒子几乎没有细胞毒性，展现良好的生物相容性；装载药物的纳米粒子影响细胞存活，且共装载btz和lbh589的纳米药物nm@(btz/lbh589)抗细胞增殖效果强于apoe-nm@(btz/lbh589)，并且由于apoe的修饰，apoe-nm@btz/lbh589能够更多的进入细胞，相比于nm@btz/lbh589展现更佳的抑制细胞存活的效果。
[0089]
9、er-tracker表征纳米药物引起的内质网应激
[0090]
将gbm细胞接种在6孔板(150,000个细胞/孔)中，在37℃、5％co2的无菌细胞培养箱中培养24小时后，将apoe-nm，游离药物btz/lbh589或纳米药物nm@btz+nm@lbh589、nm@(btz/lbh589)、apoe-nm@(btz/lbh589)、以浓度4.0nm/8.0nm(btz/lbh589)分别加入到培养液中，孵育48小时。接下来，移除培养液，并用1
×
pbs清洗细胞2次，向细胞中加入提前在37℃预热的er-trackerred工作液，并在37℃下共孵育20分钟。去除er-trackerred染工作液，用细胞培养液洗涤细胞2次。消化、离心并收集细胞，采用流式细胞仪收集并检测细胞中er-trackerred荧光信号，然后用flowjo_v10软件进行结果分析。结果如图16所示。结果显示：相同药物浓度下，游离药物不能引起内质网应激，而纳米药物引起内质网应激，且apoe-nm@(btz/lbh589)引起内质网应激的程度在snb19和ln229细胞中分别是nm@(btz/lbh589)的2.5和1.3倍；nm@(btz/lbh589)引起内质网应激的程度在snb19和ln229细胞中分别是nm@btz+nm@lbh589的2.3和1.2倍。
[0091]
10、流式细胞仪检测纳米药物对gbm细胞凋亡的影响
[0092]
将各种gbm细胞接种在12孔板(70,000个细胞/孔)中，在37℃、5％co2的无菌细胞培养箱中培养24小时后，将游离药物btz/lbh589或纳米药物nm@(btz/lbh589)、apoe-nm@(btz/lbh589)、apoe-nm以浓度4.0nm/8.0nm(btz/lbh589)分别加入到培养液中，孵育48小时。分别收集孔板中所有细胞，离心(400
×
g，3分钟)并用1
×
pbs清洗细胞2次后，将细胞分散于1
×
annexinv-fitc结合液，在室温下，加入5μlannexinv-fitc并轻轻混匀，5分钟后，加入10μl碘化丙啶染液(pi)并轻轻混匀，15分钟后，将细胞放置于冰上，用流式细胞仪收
集并检测细胞中荧光信号，用flowjo_v10软件进行结果分析。结果如图17所示。结果表明：相同药物浓度下，游离药物并未引起细胞凋亡，而纳米药物apoe-nm@(btz/lbh589)和nm@(btz/lbh589)明显引起snb19和ln229细胞凋亡。
[0093]
11、建立原位tp53
mut
gbm模型
[0094]
将snb19或者ln229细胞接种于15cm细胞培养皿中，在37℃、5％ co2的条件下培养至对数增长期时，移除培养液，1
×
pbs清洗细胞2次，1
×
trpysin消化细胞3分钟，离心收集细胞，并将细胞以密度5
×
105个细胞/5μl分散于1
×
pbs缓冲液中，放置在冰上待用。将6-8周龄的雌性balb/c裸鼠用水合氯醛溶液(8mg/20g)麻醉后，用动物专用刀片划开头皮处皮肤，并用颅骨钻在小鼠大脑的左上部位打孔约3.5mm深度，然后用微量针式注射器将5
×
105个snb19或者ln229细胞注射到孔洞中，用融化的骨蜡封闭孔洞后，再用组织封闭胶粘合之前切开的皮肤，最后将小鼠放置于电热毯至苏醒后放回笼中饲养。所有动物实验均按照河南大学批准的协议进行处理，满足实验动物中心及动物护理和使用委员会的要求。
[0095]
12、纳米药物体内分布实验
[0096]
将纳米药物nm@(btz/lbh589/cy5)，apoe-nm@(btz/lbh589/cy5)或者游离cy5，分别通过尾静脉注射到已经荷瘤的balb/c裸鼠体内(cy5：0.1mg/kg)，在不同时间点(1 小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时)用lumina ivis iii近红外荧光成像系统(ex＝620nm；em＝710nm)监测这些纳米药物在小鼠体内分布情况。另外，为了更清晰地了解纳米药物在荷瘤balb/c裸鼠的各器官和脑的分布情况，在尾静脉注射各种纳米药物 4小时时，将小鼠按照颈椎脱臼法处死，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑，通过小动物成像仪的lumina ivis iii系统检测小鼠各器官和脑中cy5荧光分布情况。
[0097]
为了进一步观察纳米药物在脑和原位肿瘤的分布及渗透深度，同样地，在注射纳米药物4小时后，用颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，取出小鼠脑并放置于中性通用型组织固定液中避光保存48小时。取出小鼠脑放置于20％w/v的蔗糖溶液中至其完全沉到溶液底部(约12 小时)，然后再将小鼠脑放置于30％w/v的蔗糖溶液中约12小时。接着取出放在蔗糖溶液中的小鼠脑，将其放置于包埋槽中心位置，并向包埋槽中加入oct包埋剂，然后将包埋槽放入液氮中冷冻包埋剂以固定小鼠脑位置。将标本置于托物台，用恒温冷冻切片机切片(一般切片温度为零下22℃)，片厚15μm，贴于预冷的载玻片上，在-20℃冰箱中保存。切片经过4℃预冷的丙酮固定15分钟，0.3％ triton x-100洗涤3次后，用dapi染细胞核10分钟，移除并清洗对于dapi染料后，进行封片处理，并用pannoramic midi仪器扫描拍摄图像。
[0098]
再者，为了量化纳米药物在各器官的积累量，在注射纳米药物4小时时将小鼠按照颈椎脱臼法处死，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾，脑和脑中肿瘤，将它们称重后放入装有 0.6ml 1％triton x-100溶液的ep管中，并在管中加入两个直径约为0.3mm的圆形磁珠，用匀浆机(jxfstprp-48)将各组织匀浆4分钟(功率：70hz)，室温静置过夜，然后离心(14,000
×
g,30分钟)取上清液，接着用酶标仪检测样品中cy5(ex＝630nm，em＝670 nm)荧光强度，并根据标准曲线计算cy5含量，最终数值以每克组织注射百分比(％id/g) 为单位进行展示(每组3只小鼠)。
[0099]
图18结果显示：相比较于游离的cy5，纳米药物在小鼠脑部富集数量明显增加，并且由于apoe-nm@(btz/lbh589/cy5)具有穿越bbb和主动靶向snb19和ln229细胞的能力，其在小鼠肿瘤部位的富集数量最多。
[0100]
13、纳米药物的原位tp53
mut
gbm实验
[0101]
在荷瘤10天时，将小鼠随机分组进行评估。将apoe-nm@(btz/lbh589)、 nm@(btz/lbh589)、游离btz/lbh589、apoe-nm或1
×
pbs分别通过尾静脉注射(药物剂量2mg/kg)入小鼠体内，每2天1次，持续5次。在期间监测小鼠体重的变化，长期监测小鼠的存活时间至建立原位gbm模型的第90天。结果如图19所示。结果显示：在snb19和ln229模型中，在期间，apoe-nm@(btz/lbh589)组小鼠体重基本维持稳定，其它组小鼠体重持续下降；在snb19模型中，与pbs、apoe-nm和游离 btz/lbh589组小鼠的总生存期短于32天不同，nm@(btz/lbh589)和apoe-nm@(btz/lbh589)分别将小鼠总生存期延长至48天和70天。同样地，在ln229 模型中，nm@(btz/lbh589)和apoe-nm@(btz/lbh589)组的小鼠的总生存时间分别延长至51天和90天以上。
[0102]
14、原位tp53
mut
gbm后的组织学分析
[0103]
在动物水平结束时(完成5次给药)，将小鼠脑组织或器官放入在中性通用型组织固定液中，2天后，将组织取出放在专用卡槽中流水冲洗过夜(对于脑组织，可以切除嗅球和小脑)，然后进行脱水处理，即将组织依次放置于70％乙醇1小时，80％乙醇1小时，85％乙醇1小时，90％乙醇1小时，95％乙醇1小时，100％乙醇1小时，50％乙醇和 50％二甲苯混合溶液1小时，100％二甲苯(i)1小时，100％二甲苯(ii)1小时。接着将组织放入融化的石蜡(65℃)中进行3小时的浸蜡处理，最后将组织放入包埋槽并用包埋机向槽中滴加融化的石蜡至完全没过组织，随后放在冷台上冷却至少2小时。接下来将组织从包埋槽中取出并进行切片，片厚4μm，在40℃水浴展片30秒左右(完全展开但不烂片)，用粘附性载玻片捞片，再将片子放在60℃烘箱中进行2小时的烤片处理。在进行任何一种组织学染前，均需对石蜡切片进行脱蜡处理，具体步骤为依次放置于二甲苯(i) 5分钟，二甲苯(ii)5分钟，二甲苯(iii)5分钟，100％乙醇(i)5分钟，100％乙醇(ii) 5分钟，90％乙醇5分钟，80％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟，蒸馏水(i)5分钟，蒸馏水(ii)5分钟，蒸馏水(iii)5分钟，蒸馏水中可以长时间放置。
[0104]
14.1、苏木精&伊红(h&e)染
[0105]
首先将组织切片放入苏木素(hemagtoxylin，染细胞核，紫)溶液中染6分钟，然后流水冲洗片子10分钟使其由紫变为蓝(如果苏木素染过深的话，需要酒精盐酸或商用苏木素分化试剂进行分化，分化时间一般1～2秒，如果分化程度太大，可以进行复染)。接着将片子放入伊红(eosin，染细胞浆，橙红)溶液中染3分钟，水洗2次后，直接进入脱水封片步骤(因为伊红会掩盖掉细胞质中苏木精的颜，所以不需要过分盐酸分)。将片子依次放置于80％乙醇5秒，90％乙醇5秒，95％乙醇5秒，100％乙醇(i) 5秒，100％乙醇(ii)5秒(在90％乙醇中放置时间可以长一些，避免伊红浓度过高)。最后将片子放置于二甲苯中(可以在二甲苯中长久放置)，随后用体积比为1：1的中性树胶：二甲苯封片，并赶走气泡，待片子于通风橱中风干后即可采用40仪器进行扫描拍摄并使用qupath软件分析数据。结果如图20所示，在snb19和ln229原位荷瘤模型中，相较于其它组，apoe-nm@(btz/lbh589)组明显抑制肿瘤增长，肿瘤尺寸最小；各组小鼠的正常脑组织和器官均为发现病变和副作用，说明纳米药物具有良好的生物相容性。
[0106]
14.2、tunel用于细胞凋亡检测
[0107]
向组织切片的样品上滴加20μg/ml(10mm tris-hcl ph7.4-7.8稀释)不含dnase的
蛋白酶k，20-37℃作用25分钟，然后移除多余蛋白酶k，用1
×
pbs洗涤3次，每次5分钟。在样品上滴加50μltunel检测液，并放入装水的避光湿盒中以保持湿润从而尽量减少tunel检测液的蒸发，37℃避光孵育60分钟，然后移除多余tunel检测液，用1
×
pbs洗涤3次，每次2分钟。用dapi(10μg/ml)染细胞核10分钟,用1
×
pbst洗片子2分钟，共3次。用抗荧光淬灭封片剂封片后，使用激光共聚焦显微镜进行荧光信号采集及图片拍摄。结果如图21所示。结果显示：在snb19和ln229原位荷瘤模型中，相较于其它组，apoe-nm@(btz/lbh589)组tunel阳性信号明显增多，引起肿瘤细胞凋亡。
[0108]
14.3、免疫组化
[0109]
用免疫组化笔绕着切片上的样本画尽量小的圈(目的是隔离样本又节约抗体等试剂)，圈内留一角，方便吸干，将片子置于湿盒中，将3％h2o2滴在切片组织上20分钟后，用于去除内源性过氧化物酶，用1
×
pbst洗去多余的h2o2，每次2分钟，共3次。将切片浸泡在0.01m柠檬酸盐缓冲液中，再放入微波炉中加热直至沸腾，继续保持亚沸腾温度(95℃-98℃)10分钟，进行抗原热修复，最后在实验台上冷却切片30分钟。片子浸泡于1
×
pbst2-3分钟，擦干，用3％bsa封闭30分钟，用pbst洗3次，每次2分钟。在样品上(组化圈内)加入anti-ki67，anti-cleavedcaspase-3等一抗(1％bsa中稀释，稀释比例参照抗体说明书)，用量能覆盖样本即可，湿盒中4℃过夜(湿盒中一定要加水)，然后移除一抗，用1
×
pbst洗片子2分钟，共3次。在样品上滴加生物素标记山羊抗兔igg，37℃孵育30分钟，用1
×
pbst洗片子2分钟，共3次。在样品上滴加sabc，37℃孵育30分钟，用1
×
pbst洗片子2分钟，共3次。采用dab作为显剂，滴加在样品上5-10分钟(不要超过10分钟,否则有非特异性染)，流水冲洗10分钟，终止染，镜检，若效果不好，可以继续染。最后，用苏木素溶液染细胞核2-3分钟，流水冲洗5-10分钟，样本的脱水和封片步骤与h&e染后续步骤一致。采用40仪器进行扫描拍摄并使用qupath软件分析数据。结果如图22所示。结果显示：在snb19和ln229原位荷瘤模型中，相较于其它组，apoe-nm@(btz/lbh589)组的肿瘤组织中ki67阳性信号明显减少，cc3阳性信号明显增多，并且cc3阳性信号主要分布于肿瘤组织而非正常脑组织，说明apoe-nm@(btz/lbh589)能够抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，而不影响正常脑组织细胞。
[0110]
14.4、免疫印迹法检测纳米药物对原位tp53
mut
gbm肿瘤中凋亡相关蛋白调控
[0111]
在结束5次后，将小鼠颈椎脱臼致死后取出小鼠脑中肿瘤组织，放入含1mmpmsf的高效ripa裂解液中，并在管中加入两个直径约为0.3mm的圆形磁珠，用匀浆机(jxfstprp-48)将各组织匀浆4分钟(功率：70hz)，放置在冰上裂解30分钟后，离心(15,000rpm，10分钟)取上清液，用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度后，将蛋白质溶液(10μg/样品)与1
×
sds-page上样缓冲液混合并在95℃下变性10分钟。然后将蛋白样品添加于7.5％sds-聚丙烯酰胺凝胶孔道中，恒压80v电泳至蛋白marker完全分开，再将样品转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上(300ma，1小时)。5％牛奶封闭pvdf膜1小时后，根据蛋白marker分子量及位置将pvdf膜进行裁剪，并分别与一抗anti-biprabbitpab(1:1000稀释)，anti-caspase-12rabbit(1:1000稀释)，anti-caspase-3rabbit(1:1000稀释)，anti-cleavedcaspase-3rabbit(1:1000稀释)，anti-calpain1rabbitpab(1:1000稀释)和anti-β-actinrabbitpab(1:1000稀释)在4℃孵育过夜。收集一抗，用1
×
tbst清洗膜3次，每次10分钟，然后将pvdf膜与二抗在室温下孵育1小时。收集二抗，用1
×
tbst清洗膜3次后，添加ecl超敏化学发光显影液，并用amershamimager680rgb仪器进行发光成像。结果如图23所
示。结果显示，相较于其它组，apoe-nm@(btz/lbh589) 组的肿瘤组织中bip/capn1/ccasp12/ccasp3蛋白表达量明显增加。
[0112]
15、纳米药物对小鼠血常规和血生化的影响
[0113]
首先，将健康的balb/c小鼠(6-8周龄)随机分为两组(每组4只小鼠)。通过尾静脉分别向小鼠体内注射不同药物剂量的apoe-nm@(btz/lbh589)(1mg/kg，2mg/kg，4mg/kg) 或者1
×
pbs。在第2、7和14天时分别从小鼠眼角取血约200μl。收集的全血一部分进行常规血液分析，包括红细胞(rbc)、血红蛋白(hgb)、红细胞比容(hct)、平均红血球容积(mcv)、红细胞平均血红蛋白量(mch)、红细胞平均血红蛋白量浓度(mchc)、白细胞(wbc)和血小板(plt)等指标检测。另一部分血液被离心(800
×
g，10分钟) 处理后，收集血清，并对丙氨酸氨基转移酶(alt)、碱性磷酸酶的水平(alp)、血清白蛋白(alb)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、尿素(urea)、肌酐(crea)和尿酸(ua) 等指标进行检测。结果如图24所示。结果表明：在注射不同药物剂量的 apoe-nm@btz/lbh589后，在第2，7和14天，小鼠血常规和血生化各项参数的数值与对照组相似，不存在显著性差异，说明apoe-nm@btz/lbh589具有良好的生物相容性，没有副作用。
[0114]
16、纳米药物对小鼠肝脏和肾脏的影响
[0115]
为了检测纳米药物是否引起炎症，我们对注射纳米药物后，小鼠的肝脏和肾脏中的 il-1β、il-6和tnf-αmrna表达情况进行检测。选取健康的balb/c白鼠(6-8周龄)随机分为2组，每组3只。将纳米药物apoe-nm@(btz/lbh589)通过尾静脉注射入小鼠体内 (2mg/kg)。2天后，将小鼠颈椎脱臼致死并取出肾脏和肝脏，将它们放入装有rna提取液的ep管中，并在管中加入两个直径约为0.3mm的圆形磁珠，用匀浆机(jxfstprp-48) 将各组织匀浆4分钟(功率：70hz)，并根据总rna提取试剂盒标准步骤提取组织中总 rna。用thermo scientific
tm
nanodrop仪器检测rna浓度后，将rna根据rt reagentkit(perfect real time)的实验说明进行反转录形成cdna，然后根据sybr premix ex taq ii 试剂盒的标准步骤并使用实时荧光定量pcr仪(lightcycler480 ii)进行qrt-pcr实验。实验数据采用2-δδct
公式进行进一步计算。结果如图25所示。结果表明：向小鼠注射 apoe-nm@btz/lbh589，2天后，通过qrt-pcr表征发现，小鼠肝脏和肾脏中，炎症因子(il-1β、il-6和tnf-α)的mrna表达水平与对照组不存在显著性差异，说明 apoe-nm@btz/lbh589对小鼠肝脏和肾脏不产生副作用，不诱发炎症反应，具有良好的生物相容性。
[0116]
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

技术特征：

1.一种合成致死纳米药物组合载体，其特征在于，该组合载体包括多肽、含有多羟基的酰胺类化合物、含有联吡啶基团的酰胺类化合物、含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物、组蛋白去乙酰化酶抑制药物和含有二硫键的化合物；所述含有多羟基的酰胺类化合物与含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物通过反应生成硼酯键，所述含有联吡啶基团的酰胺类化合物与组蛋白去乙酰化酶抑制药物通过锌离子进行螯合。2.根据权利要求1所述的一种合成致死纳米药物组合载体，其特征在于，所述含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物为硼替佐米。3.根据权利要求1所述的一种合成致死纳米药物组合载体，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制药物为帕比司他。4.根据权利要求1所述的一种合成致死纳米药物组合载体，其特征在于，所述多肽为巯基修饰的多肽。5.根据权利要求1所述的一种合成致死纳米药物组合载体，其特征在于，所述含有多羟基的酰胺类化合物选自n-丙烯酰基葡萄糖胺。6.根据权利要求1所述的一种合成致死纳米药物组合载体，其特征在于，所述含有联吡啶基团的酰胺类化合物选自n-（2-丙烯酰胺乙基）-[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺、n-（3-丙烯酰胺丙基）-[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺和n-（4-丙烯酰胺丁基）-[2,2
’‑
联吡啶]-5-甲酰胺。7.根据权利要求1所述的一种合成致死纳米药物组合载体，其特征在于，所述组合载体为球形结构。8.权利要求1~7任一项所述的合成致死纳米药物组合载体在制备gbm靶向药物上的应用。

技术总结

本发明属于纳米药物制备技术领域，公开了一种纳米药物组合载体，该组合载体包括多肽、含有多羟基的酰胺类化合物、含有联吡啶基团的酰胺类化合物、含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物、组蛋白去乙酰化酶抑制药物和含有二硫键的化合物；所述含有多羟基的酰胺类化合物与含有硼羟基的蛋白酶体糜蛋白酶样活性抑制药物通过反应生成硼酯键，所述含有联吡啶基团的酰胺类化合物与组蛋白去乙酰化酶抑制药物通过锌离子进行螯合。本发明组合载体具备还原、酸和螯合竞争的响应释放药物的能力，可以同时装载两种药物，两种药物释放能力高且时空可控，发挥协同增效作用。发挥协同增效作用。发挥协同增效作用。