一种多组分载药原位液晶及其制备方法和应用

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1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种多组分载药原位液晶及其制备方法和应用。

背景技术：

2.牙周炎是发生在牙周组织的慢性感染性疾病，临床主要表现为牙龈炎症和出血、以及进行性的牙周附着丧失与牙槽骨吸收，是成人牙齿丧失的最主要原因。此外，牙周疾病与动脉粥样硬化、老年性肺炎、类风湿性关节炎、阿尔兹海默病等全身系统性疾病关系密切。
3.目前对于牙周炎的包括药物、手术以及牙周基础。药物主要以四环素类抗生素为主，而能够实现控制炎症、抑制牙槽骨吸收、促进牙周组织再生修复的牙周炎药物是当前的研究难点。
4.蜂胶是蜜蜂科昆虫意大利蜂apis mellifera l工蜂采集的植物树脂与其上额腺、蜡腺等分泌物混合形成的具有黏性的固体胶状物。类黄酮类化合物为蜂胶的主要活性成分，其具有抗氧化、抗肿瘤、消炎止痛、促进伤口愈合及免疫调节等药理活性。蜂胶总黄酮（total flavonoids of propolis，tfp）作为多组分化合物，既有亲水性成分亦有亲脂性成分。因此，构建能够同时包载亲水性与亲脂性tfp载药体，并在牙周局部实现各成分有效、同步、缓慢释放是tfp在牙周炎中得以应用的关键。
5.目前用于牙周炎的不论是复方氯己定含漱液、碘甘油以及盐酸米诺环素软膏均无法同时实现抗菌、抗炎及牙周保护。此外，含漱液在牙周滞留时间较短，无法实现长效作用。
6.原位液晶是一类低黏度的液晶前体，其具有的独特水道和脂质膜，使其具有较强的载药适应性、较高的载药量以及良好的促渗性、生物黏附性和稳定性。当与过量水接触后吸水发生相转变形成凝胶状的溶致液晶。然而，目前溶致液晶主要集中于包载单一组分药物的研究，少见双组分包载，多组分液晶给药系统尚未见报道。

技术实现要素：

7.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种多组分载药原位液晶，该原位液晶能够同时包载亲水性与亲脂性蜂胶总黄酮，为蜂胶总黄酮药物提供了一种新制剂类型。
8.本发明是通过以下技术方案实现的：一种多组分载药原位液晶，所述多组分载药原位液晶由助溶剂、多组分药物、液晶材料以及水制成；所述液晶材料、助溶剂与水的质量比为63-81:7-9:10-30；所述多组分药物为蜂胶总黄酮；所述助溶剂为甲醇、乙醇、卡必醇、丙二醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种或几种；所述液晶材料为植烷三醇或维生素e醋酸酯中的一种或两种的混合。
9.作为本发明进一步优选，所述液晶材料、助溶剂与水的质量比为72-81：8-9：10-20，所述液晶材料为植烷三醇，助溶剂为卡必醇。
10.作为本发明进一步优选，所述液晶材料、助溶剂与水的质量比为81：9：10，所述液晶材料为植烷三醇和维生素e醋酸酯按质量比为77-79：2-4的混合物，所述助溶剂为卡必醇。
11.作为本发明进一步优选，所述液晶材料为植烷三醇和维生素e醋酸酯按质量比为79：2的混合物。
12.本发明还提供了上述的多组分载药原位液晶的制备方法，包括如下步骤：（1）将液晶材料水浴熔融，得到油相；（2）将多组分药物加入助溶剂，得到水相；（3）将油相与水相涡旋充分混匀，再水浴熔融，加入水，重复涡旋，恒温放置即得多组分载药原位液晶。
13.作为本发明进一步优选，步骤（1）中，所述水浴熔融的温度为40-65℃。
14.作为本发明进一步优选，步骤（3）中，所述涡旋的速度为2000-3000 rpm，时间为2-20min。
15.本发明还提供了上述的多组分载药原位液晶在制备牙周炎的药物中的应用。
16.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过处方的筛选和优化，制备得到了能够同时包载亲水性与亲脂性蜂胶总黄酮的载药原位液晶，为蜂胶总黄酮药物提供了一种新制剂类型。药效学结果显示，本发明制备得到的蜂胶总黄酮载药原位液晶可以在牙周局部实现各成分有效、同步、缓慢释放，为牙周炎患者的提供了新的手段。
附图说明
17.图1为本发明的实施例中液晶在相转变后形成立方相与六角相液晶的偏光图；图2为本发明的实施例中液晶的流变学性质；图3为本发明实施例中液晶的小角x射线散射图谱；图4为本发明实施例中液晶白杨黄素的体外释放曲线；图5为本发明实施例中液晶作用牙周炎大鼠后其牙龈指数的变化；图6为本发明实施例中液晶作用牙周炎大鼠后其探诊深度的变化；图7为本发明实施例中液晶作用牙周炎大鼠后牙周组织炎症水平的变化；图8为本发明实施例中液晶作用牙周炎大鼠后牙槽骨micro-ct扫描图与矢状图；图9为本发明实施例中液晶作用牙周炎大鼠后牙槽骨的骨密度、相对骨体积、骨小梁数目、骨小梁数目；图10为本发明实施例中液晶作用牙周炎大鼠后牙周组织h&e、masson与trap染；图11为本发明实施例中液晶作用牙周炎大鼠后牙周组织相关蛋白表达水平。
具体实施方式
18.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方
式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
19.实施例1：原位立方液晶的制备（1）称取162 g 植烷三醇，60℃水浴熔融，得到油相；（2）将蜂胶总黄酮加入18 ul助溶剂卡必醇，得到水相；（3）将油相和水相涡旋充分混匀（3000 rpm，2 min），再水浴熔融，加入20ul的水，重复涡旋（3000 rpm，15 min），恒温加速箱放置48 h形成原位立方液晶a，载药量为5.10mg/g。
20.如图1的偏光图所示，将实施例1得到的原位液晶a加入过量水放置一段时间后，外观为透明凝胶状固体，黏度大，偏光显微镜下观察显示为暗视野，证明是制备得到原位液晶在过量水中发生相转变为立方液晶。
21.如图3所示的原位液晶小角x射线散射，由图谱可以看出，立方相液晶有3个bragg散射峰，计算得出各散射峰对应的矢量比分别为1：：2，结果证实实施1制备得到的原位液晶为螺旋型立方液晶。
22.本实施例进一步对助溶剂及处方用量进行了筛选优化，具体过程如下：1.1助溶剂的筛选优化：平行称取约100mg蜂胶总黄酮六份，至盛有1ml的溶剂（水、甲醇、乙醇、卡必醇、丙二醇、乙酸乙酯、丙酮）中，将其置于水浴恒温摇床（37℃，1000rpm）平衡24h，比较各组溶解度。蜂胶总黄酮在卡必醇中的溶解度最高（113.44 mg/ml），因此优选为卡必醇作为最佳助溶剂。
23.1.2用量比的筛选优化：称取处方量植烷三醇，60℃水浴熔融后，加入处方量的蜂胶总黄酮卡必醇溶液，将二者涡旋充分混匀（3000 rpm，2 min），再水浴熔融，最后加入处方量的水，重复涡旋（3000 rpm，15 min）。恒温加速箱放置48 h形成立方相液晶。以载药量，可注射性，相转化最少吸水量以及相转化时间为指标进行处方筛选。
24.对于植烷三醇、卡必醇、水以63：7：30比例混合后，得到澄清、具有很好的流动性可注射的液体，载药量为3.97 mg/g，相转化最少吸水量 (v
min
) 为70.0
ꢀ±ꢀ
7.07ul，相转化时间 (tg)为5.4
ꢀ±ꢀ
1.14s。
25.对于植烷三醇、卡必醇、水以72：8：20比例混合后，得到澄清、具有很好的流动性可注射的液体，载药量为4.53 mg/g，相转化最少吸水量 (vmin) 为90.0
ꢀ±ꢀ
6.32ul，相转化时间 (tg)为6.2
ꢀ±ꢀ
1.10s。
26.对于植烷三醇、卡必醇、水以81：9：10比例混合后，得到澄清、具有很好的流动性可注射的液体，载药量为5.10 mg/g，相转化最少吸水量 (vmin) 为98.0
ꢀ±
8.37ul，相转化时间 (tg)为7.0
ꢀ±ꢀ
0.71s。
27.对于植烷三醇、卡必醇、水以56：14：30比例混合后，得到澄清、具有很好的流动性可注射的液体，载药量为7.94 mg/g，相转化最少吸水量 (vmin) 为118.0
ꢀ±ꢀ
11.40ul，相转化时间 (tg)为13.2
ꢀ±ꢀ
2.17s。
28.对于植烷三醇、卡必醇、水以64：16：20比例混合后，得到澄清、具有很好的流动性可注射的液体，载药量为9.08 mg/g，相转化最少吸水量 (vmin) 为168.0
ꢀ±ꢀ
10.95ul，相
转化时间 (tg)为20.4
ꢀ±ꢀ
1.14s。
29.综合考虑液晶的载药量，最小吸水量以及相转化时间，因此优选植烷三醇、卡必醇与水的质量比为72-81：8-9：10-20，更优选植烷三醇、卡必醇、水的质量比为81：9：10作为最佳处方，在注射入牙周袋后仅需要最少量的龈沟液即可转化为立方液晶，这使得更多的载药液晶能停留于牙周袋中。
30.实施例2：原位六角液晶的制备（1）称取158g植烷三醇、4g维生素e醋酸酯，60℃水浴熔融，得到油相；（2）将蜂胶总黄酮加入18ul助溶剂卡必醇，得到水相；（3）将油相和水相涡旋充分混匀（3000 rpm，2 min），再水浴熔融，加入20ul的水，重复涡旋（3000 rpm，15 min），恒温加速箱放置48 h形成原位六角相液晶，载药量为5.10 mg/g。
31.如图1的偏光图所示，当加入过量水后，实施例2制备得到的原位液晶b发生相转变，偏光显微镜下呈扇形花纹，证明相转变为六角相液晶。
32.进一步参见图3的小角x射线散射，由图谱可以看出，六角相液晶有3个bragg散射峰，计算得出各散射峰对应的矢量比分别为结果证实b为六角相液晶。
33.进一步参见图2，随着剪切速率的增加，tfp立方液晶a与六角液晶b的粘度均逐渐减少，表明两者均具有剪切变稀的特性，属于牛顿流体中的假塑性流体。在低频区时，两者的粘性模量（g
’’
）均大于弹性模量（g’），样品表现出黏性的性质。六角相显示出比立方相凝胶更低的粘性稠度及适宜的延展性，因此在使用时具有更好的铺展性，更适合于口腔内的牙周袋给药。
34.本实施例进一步对处方用量进行了筛选优化，具体如下：精密称取处方量的植烷三醇、维生素e醋酸酯，60
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0.5℃水浴熔融后，加入处方量（2mg/g）的蜂胶总黄酮卡必醇溶液，将二者涡旋充分混匀（3000 rpm，2 min），再水浴熔融。向混合溶液中加入处方量的超纯水，涡旋混匀（3000 rpm，15 min），密封。放置48 h后，1000 rpm，离心5 min，除去过量水，再放置恒温加速箱48 h形成六角相液晶。以可注射性及偏光显微镜下制剂的均一性为指标进行处方筛选。
35.对于植烷三醇、维生素e醋酸酯、卡必醇、水以79：2：9：10比例混合后，得到澄清、具有良好的流动性可注射的六角相液晶。
36.对于植烷三醇、维生素e醋酸酯、卡必醇、水以77：4：9：10比例混合后，得到澄清、具有很好的流动性可注射的六角相液晶。
37.对于植烷三醇、维生素e醋酸酯、卡必醇、水以75：6：9：10比例混合后，得到浑浊、流动性差、不可注射的六角相液晶。
38.对于植烷三醇、维生素e醋酸酯、卡必醇、水以73：8：9：10比例混合后，得到浑浊、流动性差、不可注射的六角相液晶。
39.对于植烷三醇、维生素e醋酸酯、卡必醇、水以71：10：9：10比例混合后，得到浑浊、流动性差、不可注射的六角相液晶。
40.综合考虑可注射性及均一性，因此优选植烷三醇、维生素e醋酸酯、卡必醇、水按质量比为77-79：2-4：9：10，更优选为植烷三醇、维生素e醋酸酯、卡必醇、水的质量比为79：2：
9：10。
41.实施例3：体外释放行为考察蜂胶总黄酮中含有多种黄酮类化合物，其中白杨黄素含量最高，且其具有良好的抗炎作用，因此，以白杨黄素在体外的释放量考察蜂胶总黄酮的体外释放行为。采用动态透析袋法体外释放实验，精密称定处方液晶0.5 g，置于6 cm长的预处理后的透析袋中（截留分子量为14000 da），两端夹紧，放入盛有50 ml生理盐水的离心管中，置（37.0
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0.5）℃的恒温摇床中，调节转速为60 rpm，于0.5，1，2，4，6，12，24，48，72，96，120 h定时取样，每次取样1 ml同时补充等体积的新鲜释放介质，经0.45
ꢀµ
m滤膜过滤并用hplc测定白杨黄素的含量及累计释放度。结果如下：不同时间点tfp的释放曲线如图4。体外释放曲线表明，在120 h内白杨黄素在立方液晶与六角液晶均能够缓慢释放。在前30 min内，白杨黄素累积释放度低于40%，表明白杨黄素在立方液晶与六角液晶处方中均无突释现象；在72 h小时内，六角液晶中白杨黄素的释放速率均高于立方液晶。在120 h内后tfp累积释放度缓慢上升，最终白杨黄素在立方液晶与六角液晶中累积释放量分别达到90.23
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1.88%，90.90
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1.38%，说明在120 h内，装载tfp的立方液晶与六角液晶缓释性能相当，因此，后续同时选择立方相液晶与六角相液晶进行药效学研究。
42.实施例4：蜂胶总黄酮立方液晶a与六角液晶b牙周炎的药效学结果4.1牙周炎模型大鼠的构建及实验分组健康spf级雄性大鼠适应性喂养两周后，采用仰卧位，采用丝线结扎法进行慢性牙周炎造模。将造模成功的大鼠随机分组：正常组（normal）、模型组（model）、盐酸米诺环素组（mho）、空白制剂组（matrix）、立方液晶a低剂量组（tfp-cl）、立方液晶a高剂量组（tfp-ch）、六角液晶b低剂量组（tfp-hl）、六角液晶b高剂量组（tfp-hh）。mho、blank、clcd-l、hlcd-l组每周给药一次，clcd-h、hlcd-h组每周给药两次，共计给药四周。给药时，将装载tfp立方液晶a及六角液晶b的牙周专用注射器中缓缓插入牙周袋最深处，缓慢注射给药，约20
ꢀµ
l。空白六角液晶制剂用于blank组用进行给药。
43.取材于给药四周后，麻醉大鼠；采集腹部主动脉的血样，在室温下静置30 min后，以3000 rpm的离心速度得到血清后冻存于-80℃冰箱待用；处死大鼠后，取左侧上颌颌骨牙齿标本，生理盐水冲洗后浸泡于4%多聚甲醛，4℃固定48小时；取第一磨牙附近的组织，冲洗，储存于-80℃。
44.大鼠活体炎症指标检查4.3.1牙龈指数和探诊深度的测定牙龈指数（gi）：利用牙周探针进行评价牙龈指数。将牙周探针轻触牙龈边缘后，根据不同的牙龈表现将其病变程度划分为4级：0代表健康牙龈；1代表牙龈有轻微水肿，轻度炎症，探诊不出血；2代表牙龈水肿明显，探针触之易出血；3代表牙龈有自发出血或溃疡的倾斜。实验结果如下图5。
45.探诊深度（pd）：采用两点法，利用unc-15牙周探针进行测定。将探针深入牙周袋进行测定，分别测
量舌侧和颊侧的牙周袋深度，并取平均值作为每一样本的pd值，于第一次与最后一次给药后各测量一次。实验结果如下图6。
46.结果表明，正常大鼠牙龈无水肿，探诊不出血，且牙龈呈健康的粉白；模型组与制剂组大鼠牙龈有明显红肿现象并伴有自发出血现象，牙龈呈深红，探针轻触后，牙龈立即大量出血；在给药四周后，与正常组比，模型组与制剂组的gi与pd值均有明显差异（p＜0.001），表明实验性大鼠慢性牙周炎模型被成果构建，同时空白制剂对于实验性大鼠慢性牙周炎无明显效果。
47.给药第二周后，模型组相比，阳组与载tfp立方与六角液晶组的大鼠牙龈指数与探诊深度均有明显好转，牙龈颜逐渐变浅，探针轻触后，出血减少（p＜0.01）；在给药四周后，阳组疗效最明显，多数大鼠牙龈出现健康的粉白，探诊亦不出血。给药四周后，与模型组相比，载tfp立方与六角液晶组的大鼠牙龈颜变浅，自发出血现象消失，探诊出血亦减少（p＜0.01），且立方液晶组和六角液晶组间无显著性差异。
48.法检测大鼠牙周组织中炎症因子水平每组随机抽取三份牙龈组织，称重，加入适量ph为7.4的pbs，利用玻璃匀浆器将牙周组织充分匀浆。离心（3000 rpm，20 min）仔细收集上清。利用试剂盒说明书依次进行检测。具体结果如下图7。
49.如图8可见，模型组中的il-1β与nf-κb的表达水平均高于正常组，表明经丝线结扎造模后，大鼠牙周组织中炎症因子分泌显著增多。与模型组相比，给药后，阳组与tfp立方相与六角相液晶组的il-1β与nf-κb的水平明显降低，说明盐酸米诺环素与tfp均可以通过降低大鼠牙周组织的炎症因子水平，发挥牙周组织保护作用。
50.评估牙槽骨丢失量将制作好的组织标本放入4%多聚甲醛溶液中固定24-48小时；取出标本用pbs缓冲液冲洗三次，上机扫描分析。采用德国bruker公司sky scan 1176小动物micro-ct扫描影响系统进行扫描，同时使用vivid软件，分析牙槽骨各项参数，包括骨密度（bmd），相对骨体积（bv/tv），骨小梁间隙（tb
·
sp），骨小梁数目（tb
·
n）。
51.如图9可见，micro-ct结果表明，丝线结扎八周后，模型组cej-abc距离明显增加，表明造模成功。阳组的愈合情况好于tfp液晶组，且tfp立方与六角液晶能够提高实验性牙周炎大鼠牙齿的骨密度，相对骨体积分数以及骨小梁数目；同时，降低牙周炎大鼠的骨小梁间隙；此外，药效学研究表明，空白制剂对于实验结果无影响。
52.牙槽骨组织病理学考察he染：将样本在58-60℃下烘烤1 h，于二甲苯ⅰ和ⅱ液依次分别浸泡15 min，随后样本于无水乙醇、95% 乙醇、80%乙醇依次浸泡3 min，冲洗；苏木素染液浸染样本3 min，冲洗；盐酸乙醇分化3 s，pbs返蓝1 min；伊红染液浸染样本3 min，冲洗；80%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇依次浸泡约10 s；二甲苯ⅰ和ⅱ液依次各浸泡10 s；中性树胶封闭标本，通风，干燥，光学显微镜下观察、测量，拍照。
53.masson 染：将石蜡切片脱蜡并依次使用自来水与蒸馏水冲洗，使用regaud苏木精染液染核5-10 min，蒸馏水冲洗；masson丽春红酸性复红液复染，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸水溶液分化3-5 min，最后用苯胺蓝染5 min，封片。
54.抗酒石酸酸性磷酸酶（trap）染：取各组切片，二甲苯脱蜡水化，梯度酒精水化，
水洗5 min。用酒石酸盐缓冲液孵育标本20 min，弃去酒石酸盐缓冲液，用trap染液孵育15 min。水洗3 min，甲基绿复染5 min。水洗10 min，常规封片。正置荧光显微镜下观察，用dp70型ccd采集图像。
55.如图10可见，各组染结果表明，tfp立方与六角液晶能够减缓炎症，抑制胶原分解同时抑制破骨细胞的生成。m组h&e、masson、trap结果显示牙龈炎症明显增加，同时牙龈组织内破骨细胞大量生成，表明丝线结扎会造成牙周炎症明显加重。lc组对于牙周炎大鼠的炎症水平无明显影响。
56.h&e染结果表明大鼠牙龈组织炎症减轻，破骨细胞数量显著降低；此外，高剂量组大鼠牙龈组织炎症水平明显下降，胶原降解减少。结果表明，tfp立方与六角液晶能够通过降低炎症水平，抑制破骨细胞的生成以及抑制胶原降解从而发挥牙周保护作用。
57.大鼠牙龈组织中相关蛋白的表达取20 μg的蛋白样本加入4μl sds振荡混匀，100℃变性5 min。sds-page凝胶电泳，小心剥胶，选用pvdf膜进行转膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入一抗，4℃孵育过夜，再加入二抗孵育2 h。ecl发光液中的a液和b液按照1∶1比例配置，暗室内压片、曝光、显影、定影，凝胶成像仪采图。
58.如图11可见，western blot结果显示，实验性牙周炎大鼠经盐酸米诺环素后，牙周组织中tlr4、myd88蛋白水平表达降低，结合前期micro-ct结果，表明盐酸米诺环素具有良好的牙周保护作用；牙周炎大鼠经载tfp立方与六角液晶局部给药四周后，tlr4、myd88蛋白水平表达降低，alp蛋白表达水平升高；此外，tfp立方相与六角相液晶组大鼠牙周组织中相关蛋白表达水平无显著性差异。western blot表明，tfp可通过抑制tlr4/myd88的表达，减轻炎症蛋白的表达，增加成骨蛋白的表达，且降低胶原酶，减少胶原分解，从而达到牙周保护的作用。

技术特征：

1.一种多组分载药原位液晶，其特征在于，所述多组分载药原位液晶由助溶剂、多组分药物、液晶材料以及水制成；所述液晶材料、助溶剂与水的质量比为63-81:7-9:10-30；所述多组分药物为蜂胶总黄酮；所述助溶剂为甲醇、乙醇、卡必醇、丙二醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种或几种；所述液晶材料为植烷三醇或维生素e醋酸酯中的一种或两种的混合。2.根据权利要求1所述的多组分载药原位液晶，其特征在于：所述液晶材料、助溶剂与水的质量比为72-81：8-9：10-20，所述液晶材料为植烷三醇，助溶剂为卡必醇。3.根据权利要求1所述的多组分载药原位液晶，其特征在于：所述液晶材料、助溶剂与水的质量比为81：9：10，所述液晶材料为植烷三醇和维生素e醋酸酯按质量比为77-79：2-4的混合物，所述助溶剂为卡必醇。4.根据权利要求3所述的多组分载药原位液晶，其特征在于：所述液晶材料为植烷三醇和维生素e醋酸酯按质量比为79：2的混合物。5.根据权利要求1-4任一项所述的多组分载药原位液晶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将液晶材料水浴熔融，得到油相；（2）将多组分药物加入助溶剂，得到水相；（3）将油相与水相涡旋充分混匀，再水浴熔融，加入水，重复涡旋，恒温放置即得多组分载药原位液晶。6.根据权利要求5所述的多组分载药原位液晶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述水浴熔融的温度为40-65℃。7.根据权利要求5所述的多组分载药原位液晶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述涡旋的速度为2000-3000 rpm，时间为2-20min。8.根据权利要求1-4任一项所述的多组分载药原位液晶在制备牙周炎的药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种多组分载药原位液晶及其制备方法和应用，由助溶剂、多组分药物、液晶材料以及水制成；所述液晶材料、助溶剂与水的质量比为63-81:7-9:10-30。本发明通过处方的筛选和优化，制备得到了能够同时包载亲水性与亲脂性蜂胶总黄酮的载药原位液晶，为蜂胶总黄酮药物提供了一种新制剂类型。药效学结果显示，本发明制备得到的蜂胶总黄酮载药原位液晶可以在牙周局部实现各成分有效、同步、缓慢释放，为牙周炎患者的提供了新的手段。为牙周炎患者的提供了新的手段。为牙周炎患者的提供了新的手段。