蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB） WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：
1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；
2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；
3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；
4. 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；
5. 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
方法的选择
◆ 自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取 ；
◆ 购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取 。
Example 1：
实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：
1. 提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；
2. 配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；
3. 裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，140
00g，4℃离心10min，取上清。
4. 蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。
5. 样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。
6. 分装并存于-80℃，避免反复冻融。
B 第二部分：
相关试剂的配制：
1. 10%的SDS（戴口罩称取）：
称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在50℃水浴溶化后，仍可使用。
2. 1.5M Tris/HCL（pH8.8）
Trisbase 18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，室温下保存。
3. 0.5M Tris/HCL（pH6.8）
Trisbase 6.06g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至6.8，最后定容至100ml，室温下保存。
4. 30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亚甲丙烯酰胺
加双蒸水150ml，37℃加热溶解后，定容至250ml，查证该溶液pH应不大于7.0，4液化气燃烧器℃棕瓶保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
降温母粒
Be careful!!!：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
0.5mM Trisbase(pH6.8) | 2.5ml |
甘油 | 2.0ml |
10％SDS | 4.0ml |
0.4%留言板制作溴酚蓝（mw669.97） | 1ml |
二巯基乙醇（mw78.14泄洪道） | 0.5ml |
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注：配好后分装-20℃保存。
6. 电泳缓冲液
| 10倍储存液 | 1倍应用液 |
Trisbase | 30g | 3g |
甘氨酸 | 144g | 14.4g |
SDS | 10g | 1g化纤抽丝 |
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加水至1000ml，PH值用HCl调8.3。已经配制了1000ml的储存液。电泳缓冲液用应老师的电泳槽应用液300ml。用10倍的储存液30ml加入水270ml。
7. 转移缓冲液（临用临配，铁盒子里搅拌混匀并4℃预冷）：
Tris base | 甘氨酸 | H2O（ml） | 甲醇（ml） | 终体积（ml） |
0.606g | 2.88g | 160 | 40 | 200 |
2.424g | 11.52g | 640 | 160 | 800 |
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2板胶转移缓冲液的用量约为200ml。
