收稿日期:2004-07-27 修回日期:2004-10-28
通讯联系人：董慧茹
第22卷第1期V ol.22 N o.1分析科学学报
JO U RN AL O F A N AL Y T ICA L SCIEN CE 2006年2月F eb.2006
文章编号:1006-6144(2006)01-0017-04
中紫杉醇和三尖杉宁碱
雒丽娜1，董慧茹*1，张建军2，徐采霞2，刘开录2，赵京城2
(1.北京化工大学理学院，北京100029;2.北京普瑞孚天然药物现代纯化和分离研究所，北京100088)
摘 要：以东北红豆杉树叶为原料，采用正相谱和反相谱法分离提纯了紫杉醇和三
壁炉门尖杉宁碱。反相谱中使用了一种新颖的高分子填料。东北红豆杉枝叶经过一次正相
谱分离后，再经两次反相谱分离，分离得到两种白针状固体。经1H NM R 和
13C NM R 测试表明，两种物质分别为紫杉醇和三尖杉宁碱，纯度达到98%以上，产率分
别为树叶干重的0.0022%和0.0018%，回收率大于70%。
关键词：紫杉醇；三尖杉宁碱；反相谱;7-表-紫杉醇
中图分类号:O657.7;O658;O624.33 文献标识码:A
1 前言
紫杉醇(T axo l)是红豆杉属植物中含有的一种二萜类化合物，最初由Wani 等[1]从短叶红豆杉(T axus brevifolia)中得到，它独特的抗癌作用机理引起了人们的广泛关注[
2]。
目前，获得紫杉醇比较可行的方法是从红豆杉中进行提取分离。由于红豆杉中紫杉醇的含量很低[3]，并且存在很多与紫杉醇结构和性质非常接近的紫杉烷伴生物，如三尖杉宁碱(Cephalom annine)和紫杉醇的同分异构体7-表-紫杉醇(7-ep-i tax ol)最难与紫杉醇分离，特别是三尖杉宁碱，其结构如图1所示，二者Fig.1 Structures of Taxol and C ephalomannine 的区别仅在于C -13位的侧链不同。这种结构上的细微差别使得紫杉醇和三尖杉宁碱的分离十分困难。从各种植物体中分离提取二者的方法虽有文献报道，但大都比较复杂。其中，正相谱是最常用的方法[4]，但分离度小，需经多次柱谱分离才能将两者分开，同时，硅胶对紫杉醇的吸附较严重；用高效制备液相谱[5]和高效逆流谱[6]进行分离则处理量太小，成本较高；用、臭氧[7]等氧化剂处理三尖杉宁碱侧链末端的双键，使之发生化学变化，达到与紫杉醇分离的目的，但这种方法所采用的氧化剂毒性较大(例如)，对实验设备要求较高，实验难操作。
第1期
雒丽娜等：正相谱和反相谱法分离提纯东北红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱第22卷刘开录等[8]开发了一种以多孔高分子填料为固定相的反相制备谱法，从红豆杉植物提取物中提取
紫杉醇和紫杉烷类衍生物。该方法利用高分子填料的选择性和无不可逆吸附特性使三尖杉宁碱与紫杉醇达到有效的分离，同时保持高的回收率，但对于7-表-紫杉醇的去除比较困难。本工作中，我们采用正相谱法来预先除去红豆杉植物浸提物中的油状物杂质、素和7-表-紫杉醇，再用以多孔高分子填料为固定相的反相谱法分离提取紫杉醇和三尖杉宁碱，达到了满意的结果。
2 实验方法
2.1 仪器、试剂与原料
LC -10AT 高效液相谱仪(岛津公司)，包括SPD -10A 紫外检测器,Rheodyne 7725定量进样阀及N2000谱工作站;AV600-高分辨核磁共振光谱仪(Bruker 公司)；玻璃层析柱(55.0@100cm,52.86@150cm ，自制)。
紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-紫杉醇标准品(刘开录教授提供)，经H PLC 检测含量大于99%；甲醇、二氯甲烷、丙酮、正己烷(分析纯)，乙腈(谱纯)，水(重蒸水)；硅胶(200~300目，青岛海洋化工厂),PRP -6高分子固定相(聚苯乙烯-二乙烯苯型多孔微球，交联度9%，粒径50~80L m，比表面积450~500m 2/g，孔径范围20~30nm，自制)。
2.2 高效液相谱(HPLC )分析
谱柱:Dikma Diamonsil C 18(250@4.6mm i.d.,5L m)；流动相：乙腈B 水=45B 55(V B V )；柱温:30e ；检测波长:227nm；进样量:20L L；流速:1.0m L/min 。
分别配制浓度为0.1mg /mL 的紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-紫杉醇甲醇溶液，并依次稀释成0.1~50L g/m L 的系列工作液，分别绘制标准曲线，用外标法进行定量。
2.3 NMR 分析
微晶钢
样品用CDCl 3溶解，分别测定1H NMR 和13C NM R 谱图。
tsmm2.4 紫杉醇、三尖杉宁碱的提取方法
2.4.1 甲醇萃取 称取7.5kg 东北红豆杉树叶粉末，按照固/液比为1B 5(m /V )的比例，用100%甲醇于室温下浸提24h，滤渣再按照固/液比为1B 2(m/V )的比例，用100%甲醇于室温下浸提两次，每次24h 。浸提液减压浓缩，二氯甲烷B 水(1B 1)两相萃取，将二氯甲烷相蒸干，得紫杉醇粗提物。
2.4.2 正相谱(NPLC)-反相谱(RPLC)分离 将粗提物上正相硅胶柱(55.0@100cm，填充硅胶层65cm)，用丙酮-正己烷二元溶剂(丙酮体积百分含量为0%、25%、30%、40%、50%、60%)梯度洗脱,H PLC 分析各流份，合并含有目标化合物的流份，浓缩。浓缩液上高分子树脂反相谱柱(U 2.86@150cm,PRP -6高分子树脂层116cm，塔板数260N /m )。用丙酮-水二元溶剂(丙酮体积百分含量
为20%、42%、46%、50%、54%)梯度洗脱,H PLC 分析各流份，分别合并含有紫杉醇、三尖杉宁碱的流份，浓缩、冷Fig.2 C hromatogram of standards M obile phase:CH 3CN -H 2O solu tion (45B 55,V /V );Flow rate:1.0mL/min ;Colum n tem pera -ture:30e ;Detection w avelength:227nm.1:Cephalomannine;2:7-ep-i taxol;3:T axol 冻结晶得到紫杉醇和三尖杉宁碱粗品。将所得粗品溶解进行二
次反相谱纯化，按上述条件洗脱，收集目标流份。
2.4.3 结晶 分别浓缩含量大于98%的紫杉醇和三尖杉宁碱
流份，冷冻得到二者的晶体，将得到的晶体分别用甲醇-水溶解,
再冷冻至析出白针状结晶，滤出，真空干燥，得到0.17g 紫杉
醇和0.12g 三尖杉宁碱。将产品分别进行H PLC 分析和核磁
共振确认。
3 结果与讨论
3.1 标准品的高效液相谱(HPLC )图
经实验，优化了H PLC 分析条件，较好的分离了紫杉醇、三
尖杉宁碱和7-表-紫杉醇，其谱图如图2所示。三者的回归方
程、回归系数及检出限如表1所示。使用标准曲线外标法对柱
第1期分析科学学报第22卷
谱中所得的流份进行定量，并检测所得晶体纯度。
牙模3.2柱谱分离结果
3.2.1正相谱(N PLC)分离结果经过浸提和萃取后得到的紫杉醇粗提物为棕黑油状物，其中紫杉醇含量为0.3%，直接用此粗提物进行反相谱分离会造成柱再生困难，且不易除去7-表-紫杉醇。因此，我们首先用正相硅胶谱柱进行分离，除去了粗提物中大量的非极性化合物和素，紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-紫杉醇的相对含量得到了增加，三种物质达到了初步分离(见图3)，紫杉醇富集到4%，同时除去了大部分7-表-紫杉醇。
Table1Data of linearity and detection limit
Regr essio n equat ion r Detect ion limit(L g/mL) T axo l Y=9.022@107X-0.009@1070.99890.1
Cephalo mannine Y=3.98@107X-0.012@1070.99850.17
7-ep-i tax ol Y=6.10@107X-0.030@1070.99870.1
3.2.2反相谱(RPLC)分离结果将正相谱分离所得的含有紫杉醇和三尖杉宁碱的流份分别进行反相谱分离。经一次反相谱分离后，紫杉醇和三尖杉宁碱得到了很好分离(图4)，二者的分离度达到了0.99，洗脱曲线基本对称。分别合并一次反相谱所得含紫杉醇、三尖杉宁碱的流份(图4中阴影部分)，结晶后得到两者的粗晶体，再将粗晶体进行二次反相谱分离。组分交叉部分(即非阴影部分)合并后返回到一次反相谱分离，重复上述步骤。合并二次反相谱所得流份中目标组分含量大于98%的流份，重结晶后得到两者的白针状晶体。
Fig.3Elution curves of the3compounds in NPLC Fig.4Elution curves of the3compounds in RPLC
1:7-ep-i taxol;2:Cephaloman nine;3:Taxol
3.3产品纯度分析和结构鉴定
3.3.1纯度分析经三次柱谱分离提纯后所得的紫杉醇和三尖杉宁碱，采用外标法进行定量，测得两者的纯度分别为98.5%和98.3%，其H PLC谱图如图5和图6所示。
Fig.5HPLC chromatogram of Taxol Fig.6HPLC chromatogram of C ephalomannine obile phase:CH3C N-H2O solution(45B55,V/V);Flow rate:1.0mL/m in;C olumn temperatu re:30e;Detection wavelength:227nm
3.3.2结构鉴定将实验所得紫杉醇和三尖杉宁碱的核磁共振氢谱、碳谱化学位移值D与文献[9]的D 值进行比较发现，两者1H NMR和13C NMR的D值与文献值一致，因此可以认定利用上述方法从东北红豆
第1期雒丽娜等：正相谱和反相谱法分离提纯东北红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱第22卷
杉树叶中提取出的两种化合物分别为紫杉醇和三尖杉宁碱。
止痒沐浴露3.4回收率及产率
7.5kg东北红豆杉树叶粉末经固相萃取H PLC法[10]测定后，确定紫杉醇含量为0.003%，三尖杉宁碱含量为0.0025%，经提取后所得紫杉醇和三尖杉宁碱的回收率和产率如表2所示。
Table2The yields and recoveries
Output(g)Y ield(%)Recov ery(%)
T ax o l0.170.002270.8
Cephalomannine0.140.001874.7
4结论
本文采用了正相谱分离和反相谱分离结合的方法从一种东北红豆杉中有效的分离纯化了紫杉醇和三尖杉宁碱，所得晶体纯度大于98%以上，回收率70%以上。这种方法为从含微量紫杉醇植物体中回
收紫杉烷类物质开辟了一条可靠途径。
参考文献:
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soluble hy dr azines or hydrazides[P].U S:5364947,1994.
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[9]Gw endo lyn N C,Bruce D H,Susan B.J.Nat.Pr od.[J],1992,55(4):414.
[10]雒丽娜，董慧茹，赵京城.分析试验室[J],2005,24(7):80.
Isolation and Purification of Taxol and Cephalomannine from Taxus Cuspidata by Normal Phase and
Reversed Phase Chromatography
LU O L-i na1,DONG Hu-i ru*1,ZHANG Jian-jun2,XU Ca-i x ia2,LIU Ka-i lu2,
ZH AO Jing-cheng2
(1.B eij ing Univer sity of Chemical T echnology Faculty of Science,B eij ing100029;
tmch2.B eij ing P ur inatur al Phar maceutical I nstitute,Beij ing100088)
Abstract:T axol and cephalom annine w ere iso lated and purified from Tax us cuspidata by no rmal phase and reversed phase chrom atog raphy,respectively.In the reversed phase chromatog raphy,a no vel hig h molecular resin w as applied.After being eluted thro ug h o ne no rmal phase co lum n and tw o reversed phase columns,tw o w hite acicular cr ystals w er e obtained and pro ved to be tax
ol and cephalo mannine, respectively by1H NM R and13C NMR.T he purity o f cry stals w ere>98%,and the y ields(dry base)o f tax ol and cephalom annine w ere0.0022%and0.0018%,respectively w ith the recov eries of>70%. Keywords:Tax ol;Cephalomannine;Reversed Phase Chrom atog raphy;7-ep-i tax ol
