肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分离培养及鉴定的试验方案 【试验原理】
在用循环灌注法去除肝胶原组织后,根据HSC内含富含脂滴,密度较轻,它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度离心方法(连续性和非连续性两种)使HSC存在于 一高度提纯的区带中而得以分离。
【试验动物】
雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心,合格证号：）,体重400～500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。
【试剂与仪器】
主要试剂
Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均为美国Sigma公司产品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为植物伟哥Gibco公司产品,鼠抗人Desmin抗体SP试剂盒为福州迈新生物一般工业固废焚烧炉
工程公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备
蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、多功能动物手术台等。
【试验方法】
1、肝星状细胞的分离制备
1）肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12～16h,自由饮水。
2）用1％钠40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。
3）胸腹部皮肤消毒,移入超净工作台中。沿腹部正中线剪开腹腔,分离下腔静脉及门静脉,在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,结扎固定。
4）接通恒流蠕动泵,灌注预热37℃的D-Hank’s肝脏灌流液,剪开下腔静脉,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏逐渐饱满,由紫红逐渐变成淡黄白。
5）游离肝脏,保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。将游离之肝脏置于平皿中,灌注预热37℃的含酶Hank’s液I(含0.05％的胶原酶、0.1),并将灌注系统进液端放入平皿中,使流出的酶液可进行循环灌流,可见肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡。
6）倒除灌流液,撕去肝脏外膜,撕碎或剪碎肝组织,加入预热37℃的含酶Hank’S液Ⅱ(含0.05EMSKD％的胶原酶、0.02％链霉蛋白酶、0.01％DNA酶I),再次消化20min。
7）经200目滤网过滤,用磨锤轻轻研磨,并用4℃的Hank’S液冲冼。
8）将烧杯内细胞悬液分装入2只50 ml的刻度离心管,550r/min 离心8min；吸除上清入2只50 ml的刻度离心管,1750 r/min 离心8min。去上清,用4℃的Hank’S液冲冼重悬,2管合1定容至10 ml。
9）加入20 ml的18％ Nycodenz,将细胞悬液分装入6只10 ml带盖的刻度离心管中,每管液面覆盖2～3 ml的Hank’S液,3200 r纸制品加工/min 离心15 min。吸取中间细胞悬液层入50 ml刻度离心管,加入无血清DMEM培养液至50 ml,550 r/min 离心8 min,取沉淀。
10）加入预热37℃的含血清的DMEM完全培养基至10ml。
2、 肝星状细胞的鉴定
1)光镜下观察新分离的肝星状细胞含有丰富的脂滴,细胞透光度增加。
2)维生素A 自发荧光鉴定：荧光显微镜下观察,在328 Bin波长的紫外光激发下,新分离的肝星状细胞能发出蓝绿的自发荧光,但在数秒内迅速减退。
3）新鲜肝星状细胞产量测定倒置相差显微镜下,使用血细胞计数板计数肝星状细胞产量。
4）肝星状细胞活力的鉴定常规台盼蓝拒染法
5)免疫组织化学(简称免疫组化)法鉴定Desmin阳性的细胞：用鼠抗人Desmin抗体,SP法做免疫细胞化学染。
3、肝星状细胞纯度的鉴定：
倒置显微镜下于细胞片上随机数200个细胞,计数Desmin染胞浆黄的细胞,并计算纯度。肝星状细胞纯度(％)=Desmin阳性的细胞／细胞总数×100％。
4、肝星状细胞的培养
1探针天线）原代培养
用含20％(体积分数)胎牛血清的DMEM完全培养基稀释细胞悬液,留取少量的细胞进行细胞纯度及活力鉴定。以1×105～1 ×106 ml 的密度接种到50ml塑料培养瓶中,在37℃、体积分数为5％co：、95％潮湿空气的C02恒温培养箱里培养。培养瓶内细胞24 h后首次换新鲜DMEM培养液,以后每3 d换液1次,培养液改为含10％胎牛血清的DMEM完全培养基。
2）传代培养
原代培养星状细胞长满单层后,吸去培养基,0．25％胰蛋白酶于37℃消化10～15 min。等细胞附着松动,显微镜下观察细胞质边缘卷起,间隔加大,便终止消化。吸去胰蛋白酶,用Hanks液清洗1次。加入3 ml DMEM,反复吹打培养瓶壁制成单个细胞悬液,收集细胞悬液,1 500 r·min 离心10 min,离心2次后加入含10％胎牛血清的DMEM27.5g bt重悬,以2 X 105个/ml 浓度。
注意事项
（1）灌注速度要恒定在10ml/min，防止血栓的形成，影响以后的消化。
（2）灌注液的PH要准确控制在PH 7.35，减轻对HSC的损伤。
（3）实验过程中温度最好都在4℃为宜，特别是离心的过程要在低温下进行。
（4）整个过程需要熟练，否则分离过程延长，细胞活力差。整个过程以不超过3小时。
（5）整个操作过程最好都在无菌的条件下进行，减少污染，提高得率。
