罗汉果醇的制备及大鼠体内代谢研究_陈兵

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广西植物Guihaia Mar.2014,34(2):198-202          http://journal.gxzw.gxib.cn
 DOI:10.3969/j.issn.1000-3142.2014.02.014
陈兵,羊学荣,卢凤来,等.罗汉果醇的制备及大鼠体内代谢研究[J].广西植物,2014,34(2):198-202
Chen B,Yang XR,Lu FL,et al.Study on the preparation and metabolism of mogrol in rats[J].Guihaia,2014,34(2):198-202
罗汉果醇的制备及大鼠体内代谢研究
陈 兵1,2,羊学荣1,2,卢凤来1,徐 风3,李典鹏1*
(1.广西植物功能物质研究与利用重点实验室,广西植物研究所,广西桂林541006;
2.广西中医药大学,南宁530001;3.北京大学药学院,北京100191)
摘 要:为了制备得到高纯度的罗汉果醇以及阐明罗汉果醇的代谢特点,采用酸水解法从粗罗汉果皂苷V(含量50%)制备得到高纯度的罗汉果醇,用大鼠灌胃给药(100mg·kg-1)方法以及通过HPLC-ESI-IT-TOF-MSn研究罗汉果醇的代谢特点。结果表明:在粪便中能发现较多氧化产物,在血浆中也能检测到代谢产物。
引向器说明罗汉果醇灌胃给药后,能经过吸收和代谢进入血液从而发生作用。
阀门试压装置
关键词:罗汉果醇;制备;代谢研究;液质联用;氧化反应
中图分类号:R285  文献标识码:A  文章编号:1000-3142(2014)02-0198-05
Studyon the preparation and metabolism
of mogrol in rats
CHEN Bing1,2,YANG Xue-Rong1,2,LU Feng-Lai 1,XU Feng3,LI Dian-Peng1*(1.Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization,Guangxi Institute of Botany,G
uilin 541006,China;2.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;3.School of
Pharmaceutical Sciences,Peking University Health Science Center,Beijing 100191,China)Abstract:Mogrosides are main active ingredients in Siraitia grosvenorii,and the mogrol is the mogrosides’commonaglycon,but few research on metabolism of mogrosides.So in order to prepare and get much high purity mogrol,50%mogroside V by acid hydrolysis were prepared,and its in vivo metabolism in rats was studied by HPLC-ESI-IT-TOF-MSn after oral administration at the dose of 100mg·kg-1.we collected the blank and drug feces and plasma,the re-sults implied that mogrol could be absorbed in
to the blood of rats.A lot of oxidation metabolites of mogrol were de-tected in feces samples,and some were also detected in plasma samples.So,we will do the study continuously,andprovided the scientific basis for its application and development in future.
Key words:mogrol;preparation;metabolism;HPLC-ESI-IT-TOF-MSn;oxidation
  罗汉果(Siraitia grosvenorii)为葫芦科植物的干燥果实。从1977年以来,罗汉果一直被《中华人民共国药典》收录,是卫生部、国家中医药管理局批准的首批药食两用中药。药理研究表明,罗汉果有止咳祛痰、泻下、保肝、增强免疫等作用(王勤等,1999)。罗汉果的主要有效成分为罗汉果皂苷类化合物,其苷元为葫芦烷型的四环三萜罗汉果醇(mogrol)(Kasai et al.,1989)。根据苷元连接糖基的数目及连接位置的不同现已鉴定出罗汉果一糖苷、二糖苷、三糖苷、四糖苷、五糖苷、六糖苷等20多种皂苷(Matsumoto et al.1990;斯建勇等,1996;李典鹏等,2000,2006,2007)。国内外关于罗汉果皂苷
*收稿日期:2013-11-13  修回日期:2014-03-12
基金项目:国家自然科学基金(81160392,81160518)
作者简介:陈兵(1989-),男,云南禄劝人,硕士研究生,药物化学专业,(E-mail)cbdxh135535@163.com。
*通讯作者:李典鹏,研究员,硕士研究生导师,从事天然药物化学成分研究,(E-mail)ldp@gxib.cn。
类成分的代谢研究十分少见,一篇对罗汉果皂苷III的人肠内细菌转化进行了研究(杨秀伟等,2007);另一篇对罗汉果总皂苷(皂苷V含量为72%)的消化和吸收进行了初步研究(Murata et al.,2010),但仍存在一些问题,如无法得知代谢产物是罗汉果皂苷V在大鼠体内代谢后得来还是总皂苷中本身就有的;除去72%苷V后剩下的28%部分是什么等问题没有明确的答案。另外一篇是对罗汉果皂苷降血糖机制的研究(Chen et al.,2011)。本文通过对50%罗汉果皂苷V进行分离纯化得到足量和高纯度的罗汉果醇,进而对其体内的代谢情况进行研究,应用HPLC-ESI-IT-TOF-MSn技术鉴定其可能的代谢产物,推测罗汉果醇的体内代谢途径和裂解规律,有助于揭示葫芦烷型四环三萜皂苷的代谢途径,而阐明药物的体内过程对创新药物的研究具有重要意义,有助于揭示药物的作用机理;同时国内外创新药物申请注册时也
要求提供关于该药物体内过程方面的研究资料;也为新药的研制和开发提供合理的科学依据,促进罗汉果产业的进一步发展。
1 材料与仪器
1.1材料
实验动物及饲料:SD雄性大鼠,210~220g,购于北京大学医学部实验动物科学部。普通大鼠饲料,购于北京大学医学部实验动物科学部。
原料与试剂:50%罗汉果皂苷V由桂林莱茵生物有限公司生产且由广西植物研究所卢凤来助理研究员检测合格。罗汉果醇对照品为实验室自制(纯度≥98%)。羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司。甲醇、乙腈(GR)购自天津市西华特种试剂厂。乙腈(HPLC级)购自Fisher公司,甲酸(HPLC级)购自Mreda Technologic。柱谱用硅胶(200~300目)、硅胶G薄层板由青岛海洋化工厂生产。正己烷、氯仿、甲醇、丙酮、浓硫酸(AR)均购自北京化工厂。
1.2仪器
绗缝加工
液质联用仪:HPLC-ESI-IT-TOF-MSn(岛津公司),液相系统由LC-20A二
元泵,SIL-20AC自动进样器,CTO-20A柱温箱,SPD-M20APDA检测器构成。采用LCMSsolution Software version 3.60工作站进行数据采集和分析。代谢笼(苏州冯氏实验动物设备有限公司),R-3000旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司),超低温冰箱(Thermo scientific公司),真空采血管(2mL)(河北鑫乐科技有限公司),十万分之一电子天平(BP211D型,Sartorius AG)。
2 方法
2.1谱条件
谱柱为Inertsil ODS-3(4.6×250mm,5μm,SHIMADZU,Japan),Phenomenex C18保护柱(4.6mm×2.0mm,USA),流动相为A(0.1%甲酸水)和B(乙腈),进样量10μL,流速1mL·min-1,柱温35℃。采用梯度洗脱:0~30min,5%~50%B;30~75min,50%~100%B;75~90min,100%~100%B。
2.2质谱条件
谱柱后分流0.2mL·min-1流出液进入质谱。离子源为ESI源,负离子模式检测;碰撞气:极高纯度氩气(Ar);雾化气:高纯度氮气(N2);接口电压:-3.5kV;雾化气流速:1.5L·min-1;加热块和曲形脱溶剂管(CDL)温度:250℃,质量扫描范围:MS1,m/z200~2000;MS2-MS3,m/z50~2000。2.3罗汉果醇的制备
水解:称取40.05g粗罗汉果皂苷V(含量50%),加入5%硫酸甲醇溶液1 600mL水解10h,水解完毕后加入2mol·L-1的氢氧化钠溶液中和,共用500mL氢氧化钠溶液,用旋转蒸发仪旋干甲醇。萃取:将水溶液倒入分液漏斗中,加入氯仿(1∶1)萃取3次,每次500mL,合并氯仿液用旋转蒸发仪浓缩至干。拌样:用甲醇溶出氯仿萃取物至蒸发皿,水浴烘至浸膏,浸膏重17.2g,再用硅胶拌样(200~300目),样品拌至细沙状,等待上样。装柱:向玻璃柱(3cm×60cm)加入500g硅胶,用吸耳球将硅胶敲实,并使硅胶面水平,倒入样品,敲平,再加入一定量的硅胶,保持水平,用棉花覆盖,最后放入玻璃珠压住棉花。洗脱:用7∶1~2∶1(正己烷∶丙酮)梯度洗脱,收集流份。制备纯化:将流份与对照品比较,合并并旋干含有罗汉果醇的流份,进制备液相纯化即得单体罗汉果醇。
2.4罗汉果醇体内代谢实验
将12只SD雄性大鼠分别放入代谢笼中饲养,其中1~6号鼠为空白组,7~12号鼠为给药组。
饲养两天后清洗代谢笼并开始收集空白样品,共收集两天的空白尿液及粪便,收集空白完成当天开始灌
2期           陈兵等:罗汉果醇的制备及大鼠体内代谢研究
胃给药,给药剂量为100mg·kg
1(由于罗汉果醇不溶于水,故制成混悬液,称取321mg罗汉果醇,加入16mg羧甲基纤维素钠,
加水至32mL并摇匀制成10mg
·mL-
1的混悬液),每天给药1次,共给药3d
,第3天灌胃给药1h后取血。2.4.1空白、给药尿液的处理 分别将收集两天的尿液进行过滤,旋至浸膏,取10g浸膏转移至离心管中,加10倍量甲醇,超声提取30min,5 
000r·min-
1离心30min,取上清液,旋干,加甲醇转移至离心管中,再离心,再取上清液旋干,用4mL谱纯
甲醇溶解,过0.45μm微孔滤膜至液相小瓶中即得空白及给药尿液的供试品。
2.4.2空白、
给药粪便的处理 分别将收集2d的粪便在50℃烘箱中烘干,用研钵研细,取15g研磨好的粪便加10倍量甲醇超声提取30min,超声后静置,倒出上清液,依次进行3次,最后合并上清液
并旋干,再加10倍量甲醇5 
000r·min-1离心30min,取上清液,旋干,用10mL谱纯甲醇溶解,过0.45μm微孔滤膜至液相小瓶中即得空白及给药粪
便的供试品。
2.4.3大鼠心脏取血及处理 第3次灌胃给药1h
后取血,取血前腹腔注射水合氯醛(350mg·kg-
1)麻醉,真空采血管(内置肝素钠)取血2mL,取完后上下缓慢摇匀避免其凝血。将得到的血液5 
000r·min-
1离心30min,取4mL血清加入40mL甲醇沉淀蛋白,5 
000r·min-
1离心30min,取上清液旋干,加5mL谱甲醇复溶,过0.45μm微孔滤膜至液相小瓶中即得空白及给药粪便的供试品。
3 结果与分析
3.1罗汉果醇制备结果
经高效液相检测(203nm)罗汉果醇单体百分含量为98.98%(面积归一化法,图1),重量为1.16g,收率为2.43%。3.2罗汉果醇体内代谢实验结果
罗汉果醇的负离子一级质谱图中,主要检测到
罗汉果醇的准分子离子[M+HCOO]-
(m/z 
521),二级质谱图中可见裂解产生的特征碎片离子(m/z457、429、407、385、377等)
。这些碎片离子为罗汉果醇代谢产物的结构分析提供了重要信息,图2为罗汉果醇的结构式。
代谢产物通常与原形成分具有极其相似的母核
图1 罗汉果醇纯度检查液相谱图(203nm)
Fig.1 Purity test of mogrol by 
HPLC(203nm
)图2 罗汉果醇C30H52O4(
分子量476.3866)的结构式Fig.2 Chemical structure of mogrol C30H52O4
(formula weig
ht of 476.3866)结构。通过对比分析给药后生物样品及空白生物样品的一级质谱谱图,可发现给药后生物样品中存在的代谢产物。进一步比较代谢产物与原形成分的谱保留时间及多级质谱裂解规律,并参考已知的体内代谢过程,可初步推测代谢产物的结构。
与空白生物样品相比,灌胃给药罗汉果醇后,在给药后生物样品中除检测到原形成分外,还可检测到多个代谢产物。具有代表性的一些代谢产物的特征提取离子流图见图3、图4和图5。
从图3:B中的提取离子流图可知,含药粪便和空白粪便相比,含有10多个罗汉果醇的三羟基化代谢产物,它们是一组同分异构体。罗汉果醇结构中已有4个羟基,再上3个羟基,总共有7个羟基,在一级质谱中均可见准分子离子峰m/z569.36([M+HCOOH-H]-
),在二级质谱中可见碎片离子m/z523.36,中性丢失46Da(HCOOH)
。这些代谢产物的具体结构仅靠液质尚无法鉴定,
但对于进一步0
02广 西 植 物                 34卷
图3 三羟基化罗汉果醇的提取离子流图(
m/z569.3695,[M+HCOOH-H]-
) A:空白粪便;
B:给药粪便。Fig.3 MIC(m/z569.3695)of dihydroxylation of mog
rolA:Blank feces;B:Drug 
feces
.图4 二羟基化罗汉果醇的提取离子流图(
m/z553.3741,[M+HCOOH-H]-
) A:空白粪便;
B:给药粪便。Fig.4 MIC(m/z553.3741)of dihydroxylation of mog
rolA:Blank feces;B:Drug 
feces
足球袜
.图5 二羟基化罗汉果醇的提取离子流图(m/z553.3741玻璃钢蓄水池
,[M+HCOOH-H]-
 A:空白血液;B:给药血液。
Fig.5 MIC(m/z553.3741)of dihydroxylation of mog
rolA:Blank serum;B:Drug 
serum.的化学分离具有指导意义。
从图4:B和图5:B中的提取离子流图可知,含药样品和空白样品相比,也含有多个罗汉果醇的二羟基化代谢产物,它们也是一组同分异构体。在一级质谱中均可见准分子离子峰m/z 
553.3741([M+HCOOH-H]
),在二级质谱中可见碎片离子m/z507.37,中性丢失46Da(HCOOH)
。在含药血液中也检测到了和含药粪便中同样的代谢产物,说明罗汉果醇灌胃给药后能经过吸收和代谢进入血液从而发生作用。
4 结论与讨论
本研究采用HPLC-ESI-
IT-TOF-MSn
法检测了罗汉果醇在大鼠粪便、血浆、尿液中的可能的代谢产物,
罗汉果醇在大鼠体内的代谢途径并不复杂,主要发生羟基化、异构化反应,但其同分异构体很多,由
于缺少充分的碎片信息以及合理的裂解规律,目前鉴定代谢产物的具体结构较为困难。为了确定上述代谢产物的准确结构,我们正在从粪便中分离纯化这些代谢产物,
并将采用波谱学技术对它们进行结1
022期           陈兵等:罗汉果醇的制备及大鼠体内代谢研究
构鉴定。
本研究首次采用液质联用技术对高纯度的罗汉果醇(≥98%)在大鼠体内的代谢进行了研究,首次从含药粪便、血浆中检测到了高度氧化的罗汉果醇代谢产物。而在化学成分和药理活性方面,罗汉果已被研究的相对比较深入,但其皂苷类成分在体内的吸收和代谢方面的研究相对较少,故本文对罗汉果中主要皂苷类成分的苷元进行代谢方面的研究,推测其吸收代谢途径,为进一步阐明罗汉果醇在体内的代谢途径以及罗汉果皂苷类成分在体内的显效形式奠定基础。
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2广 西 植 物                 34卷

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