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操作标准---质量 | 制定人 | | 制定日期 | |
文件编号 | 人体束缚 | 审核人 | | 审核日期 | |
文件页数 | 共7透明口罩页 | 批准人 | | 批准日期 | |
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1. 目的：
建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。
2. 范围：
适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。
3. 人脸识别医疗责任：
化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。
4. 定义：
无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。
5.内容：
5. 1无菌操作设备：
无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。
5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌
衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局
部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外
光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。
5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及
可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完
毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小
时。
5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程
中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯 旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板： 在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间
的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后
将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加
总数不得超过10个。
无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100
级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／
升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况
定期置换过滤器。
5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、
75％酒精棉及拖鞋等。
5.2仪器、用具：
5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、 三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒
、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。
5.2.2用具的包扎：
5.2.2.1移液管
在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。 5.2.2.2试管
在管口塞上纱布棉塞。
5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩
将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。
5.2.2.4注射器
洗涤干净的注射器及注射针头装配好后，放入垫有纱布的带盖容器内（饭
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盒）一层层放好，上面盖上纱布，然后盖上容器的盖子，用牛皮纸包好。
5.2.2.5滤器
将检验合格后微孔滤膜先有水中浸泡湿润，取出后固定在细菌过滤器的滤板上，滤板下、滤膜上均用耐高温垫圈垫好，上好滤器。在灭菌前滤器的螺勿
拧太紧，滤器上口用8层纱布及牛皮纸包扎，装妥后放入容器内，再将盛滤器的容器盖好盖子，用牛皮纸包扎。
5.2.3用具的灭菌：
将包扎好的用具，在121±0.5℃蒸汽灭菌柜中灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易致染菌，应置温箱或或加温烘干。
5.3培养基、试剂：
5.3.1一般采用商品干燥培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。
使用前，按要求分装灭菌好的细菌培养基须经30-35℃培养pc104总线48小时，真菌培养基须经20-25℃培养72小时，证明无菌生长后方可使用。
制备的需气菌、厌气菌培养基应半个月内用完，在供试品接种前，培养基指示剂氧化层的颜不得超过培养基深度约1/5，否则须经水浴煮沸加热，只限加热一次。
5.3.2革兰氏碘液：
先用3-5ml蒸馏水溶解2.0g碘化钾，再加入1.0g碘片，搅拌溶解后，加蒸馏水稀释至300ml，摇匀。置密闭棕瓶中备用。
5.3.3结晶紫染液：
将结紫1.0g溶解于20ml95%乙醇中后，与80ml1%草酸铵溶液相混合，静置48小时使用。此液稳定，置密闭的棕瓶中可储存数月。
5.3.4沙黄染液：
将0.2g沙黄溶解于10ml95%乙醇中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。
5.3.5生理盐水：
称取9g氯化钠，加水1000ml溶解，分装后于121±0.5℃湿热灭菌30分钟。供作稀释剂用。
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5.3.6 75%乙醇
量取无水乙醇75ml,加水稀释至100ml，摇匀，即得。
5.3.7 0.1%新洁尔灭：
量取5%新洁尔灭20ml，加水稀释至约1000ml，摇匀，即得。
5.4培养基灵敏度检查：
5.4.1新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符
合灵敏度检查要求。
(1)取藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B） 28001］的营养琼脂斜面和白念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含琼脂的需气、厌气培养基新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。然后以10倍系列稀释后，制成1ml中含10-100个菌并计数。
路障灯
(2)取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气、厌气培养基新鲜培养物，白念珠菌
的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，取接种至霉菌培养基内，20-25℃用0.9%
无菌氯化钠溶液作10倍稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。
将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为12ml的需气、厌气菌培养基3管，白念珠菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，接种至每管装量为9ml
的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。
结果判定：以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵
敏度检查符合要求。
5.4.2配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周，临用前细菌和霉菌
培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长
后方可使用。
5.4.3需气菌、厌气菌培养基在试管中装量高度不得少于7Cm，其指示剂氧化层
不得超过培养基深度的1／5，否则须经水浴煮沸10分钟，但只限加热一次。
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无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的1／2。
5.5对照用菌液的制备：
5.5.1试验用菌种、菌种的复苏、菌种的接种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。
5.5.2金黄葡萄球菌菌液用接种环取金黄葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至营养肉汤培养基内，在30-35℃培养16-18氧气袋小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:106
5.5.3生孢梭菌菌液用接种环取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:106。
