技术⼲货MeRIP-qPCR⽅法及应⽤细谈
m6A等RNA修饰的主要研究⼿段是通过MeRIP⽅法对发⽣修饰的⽚段进⾏富集，其后进⾏⾼通量测序分析修饰位点。⽽⽆论是⼀篇仅展⽰修饰位点分布特点的谱学⽂章，还是深⼊研究修饰调控基因表达机制的⽂章，在⾼通量测序这⼀步之后，通常都需要对筛选出来的部分修饰位点进⾏低通量的MeRIP-qPCR验证。这个实验说来简单却必不可少，对于刚刚接触RNA修饰研究的⼩伙伴来说，可能会对MeRIP-qPCR的⽅法原理、结果含义、展⽰⽅法等有⼀些疑问，⽽看⽂章中⼜常常是⼏句话带过，⽆法解答⼼中的困惑，看过仍然对⾃⼰⼿⾥的数字⼀头雾⽔。这次我们就在这⾥详细谈⼀谈MeRIP-qPCR相关问题。 热镀锌合金
1.MeRIP-qPCR的⽬的是什么？
⾸先我们需要明确的是，MeRIP-qPCR的⽬的是验证某个⽬标基因上的某个修饰位点（以⼀⼩段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基）的修饰⽔平。
得到的结果往往是⼀个%（IP/Input）的数值，它体现的是该位点的修饰⽔平（可以⼤致理解为：这个转录本表达了很多条，其中百分之多少是这个位点有修饰的？）需要与普通qPCR验证基因表达⽔平（可以⼤致理解为：这个转录本表达了多少条？）的⽬的区分开。
导线测量法2.MeRIP-qPCR的实验⽅法？
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MeRIP-qPCR就是MeRIP实验后进⾏⼀个qPCR。
这⾥的MeRIP实验同MeRIP-seq测序中的其实相同：对RNA进⾏⽚段化。然后每个样品⼀分为⼆，⼀部分⽚段⽤针对该修饰的特异性抗体与RNA⽚段进⾏免疫共沉淀(IP)，留为IP样品，另⼀部分不进⾏IP直接留作Input样品。之后对两部分RNA⽚段分别进⾏逆转录和qPCR。如果是测序，就是在这⾥把紧接的qPCR改为接建库测序。 3.MeRIP-qPCR引物如何设计？
3.MeRIP-qPCR引物如何设计？
由于⽬的是定量位点的修饰⽔平，因此MeRIP-qPCR的引物不仅是针对⽬标基因，还要是针对其上的那个修饰位点（区域）。这个位点信息可以从：
（1）MeRIP-seq的测序结果中筛选得来
化石标本通常是⼀段位置坐标，⽐如云序⽣物提供的MeRIP-seq结果，某个甲基化峰位置如：chr1:111234-111567。有了这个位置信息，可以去UCSC genome browser⽹站:
（2）⽹站预测得到
如果没有测序，想先通过MeRIP-qPCR看看关注的某基因上是否可能存在修饰，就只能预测⼀下发⽣修饰概率⾼的区域位置。通常这些⽹站是基于研究公认的该种修饰motif序列等进⾏预测，需要将⽬标RNA的序列输⼊，可⽣成预测结果。
m6A RNA甲基化预测⽹站：
m5C RNA甲基化预测⽹站：
4.MeRIP-qPCR为什么没有内参基因？
（1）MeRIP-qPCR不需要内参来进⾏样本间的均⼀化矫正
从结果的形式%（IP/Input）我们也可以看到，这个实验侧重看修饰的⽚段（IP样品qPCR结果）占总⽚段（Input样品qPCR结果）的⽐例，实验⽬的只是要得到这两者的⽐值就体现修饰⽔平，因此MeRIP-qPCR不涉及到普通的相对定量qPCR需要的内参：
内参是衡量不同样品间表达量时⽤来均⼀化样品的，⽐如默认GAPDH在你的各个样本之间表达量应
当相同，qPCR结果样品A中⽬的基因表达量1，GAPDH表达量10；样品B中⽬的基因表达量1.5，GAPDH表达量15，那么不能说因为
1<1.5所以就说A样品⽬的基因表达量低，因为从GAPDH来看可能只是实验某环节中A样品的量整体少了⼀些⽽已。⽽是要看A中⽬的基因表达量是GAPDH的0.1倍，B也是0.1倍，两样品中⽬的基因表达量其实⽆差别。
换做MeRIP-qPCR中，如果针对⽬的基因⽬的位点qPCR，样品A的IP结果0.2，Input结果1；样品B的IP结果0.3，Input 结果1.5，我们的%（IP/Input）结果显⽰两个样品甲基化⽔平数值都是0.2，修饰⽔平⽆差异，到此就完成了⽬的。
软母排有⼈问那没有做内参，万⼀发⽣如上段提到的样品⽤量等环节有差异，会不会影响修饰⽔平的⽐较？显然，如果两个样品本来修饰⽔平相同，那么夸张地想，即使B样品⽤量由于⼿抖加了A的10倍，qPCR结果也会IP和Input信号都增长10倍，不影响这个⽐值即修饰⽔平。
（2）没有公认在不同样品中修饰⽔平都会稳定的基因可做参照
前⾯第1点主要从多个样品⽐较的⾓度解释了MeRIP-qPCR为何不需要内参基因。
⽽有时出现以下情况：1）没有分组对⽐，只想看下这⼀个（组）样品中该基因算不算有修饰，此时有个疑问：结果的%（IP/Input）达到多少可算作有修饰？——回答是⽬前没有⼀个定值。那么此时难
免会希望能有个已知有修饰的参考基因，我们的⽬的基因如果⽔平接近或者超过就算有修饰。2）想看看MeRIP实验体系有没有问题，做个已知有修饰的基因当阳性对照看看效果。然⽽RNA修饰是⼀个动态的可逆的酶促反应，在同个组织细胞中的⽔平可能都会随着环境千变万化，不同组织中更是差别很⼤，与普通qPCR检测基因表达时能到稳定表达的看家基因不同，MeRIP-qPCR没有⼀个稳定修饰的基因做参照，⽬前RNA修饰⽂章也都不要求有这种参照。
针对上述⽬的1），可以同时多做⼀个⾮特异性IgG抗体的免疫沉淀富集，对⽐样品本⾝的IP和IgG是否有显著差异，放在⽂章中作为该位点有⼀定程度的修饰的证据。
针对⽬的2），也可做IgG对照检测体系的特异性。除此之外，云序⽣物代理的GenSeq m6A MeRIP试剂盒中除了提供了IgG抗体，还提供了⼀对m6A的阳参和⼀对阴参引物，是根据⽂献报道的，靶向 HEK293 细胞中 m6A 修饰的某段RNA 区域（Positive Primers）和⽆ m6A 修饰的某段 RNA 区域（Negative Primers），供有条件且感兴趣的⽤户验证实验效率和抗体特异性。但如前⾯所说，m6A 修饰具有很强的细胞类型特异性，⽆法保证在任何细胞系或样品中，该引物都能作为很好的参照。因此，建议想对实验体系进⾏进⼀步⾃验证的⽤户，采⽤ HEK293 细胞的 RNA 进⾏验证实验。
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