IncRNA UNC5B-AS1靶向miR-300
贾静吴建金媛
【摘要】目的探究长链非编码RNA(IncRNA)不协调同源基因5B反义RNA1(UNC5B-TS1)对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响和分子机制。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肺癌组织、癌旁组织中UNC5B-AS1和miRROO的表达水平。将si-NC、si-TNC5B-AS1、miR-NC、miRF00、si-TNC5B-AS1+anti-miR-NC、si-TNC5B-AS1+antWmiRROO分别转染A549细胞。采用四甲基偶氮瞠蓝(MTT)、Transwef实验分别检测细胞活力、迁移侵袭细胞数。蛋白质印记(Western bCg检测细胞周期素Dl(CycTnD1)、p21、基质金属蛋白酶2(MMPF)和MMP-9蛋白的表达水平。双荧光素酶报告实验和检测RT-qPCR确定UNC5B-AS1对miR-300的靶向调控作用。结果与癌旁组织比较，肺癌组织中UNC5B-AS1表达升高，miR-300表达降低(P< 0.05)。与转染T-AC比较，转染/-ANC5B-AS1后A549细胞活力、迁移侵袭细胞数降低，CycTnDl、MMPT和MMPF表达降低,p21表达升高(P<0.05)。与转染miR-AC比较，转染miR-300后A549细胞活力、迁移侵袭细胞数降低,CycCnD1、MMP-2和MMPF表达降低,p21表达升高(P<0.05)。与共转染T-ANC5B-AS1和an-C-miR-AC比较，共转染si-ANC5B-AS1和anC-miRROO后A549细胞活力、迁移侵袭细胞数升高，CycCnDl、MMPF和MMP-9表达升高,p21表达降低(P<0.05)。miRRO O是UNC5B-AS1的靶基因，UNC5B-AS1靶向负性调控miRROO表达。结论肺癌中UNC5B-AS1呈高表达，抑制UNC5B-AS1通过靶向miRROO可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。
【关键词】UNC5B-AS1;miR-30；非小细胞肺癌；细胞增殖；迁移和侵袭
dvi*10.3969/j.issn.1009-6663.2021.07.022
作者单位:222000江苏连云港，连云港市第一人民医院高新院区急诊科
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[收稿日期：2020-11-16]
Effect of LncRNA UNC5B-AS1on the proliferation,migration and invasion of non-smaH cell lung cancer cells through targeting miR-300
JIA Jing$WU San,JIN Yuan
Emergency DepaUmeni,High-tech Development Zoo o Lianyungang First People e Hospital,Lianyungang,Jiangsu 222000,China
(Abstract)Objective To investigate the elect and molecular mechanism of long-chain noncoding RNA(ln-cRNA)uncoordinated gene5B antisense RNA1(UNC5B-AS1)on the proliferation,migration and invasion of nonsmall cell lung cancer cells.Methods Real-Tme fluorescent quantitative PCR(RT-qPCR)was used to detect the expression levels of UNC5B-AS1and miR-300in lung cancer tissues and adjacent tissues.si-NC,si-TNC5B-ASl, miR-C,miR-300,T-ANC5B-AS1+/U-miR-AC,T-TNC5B-AS1+/U-miRA00were transfected into A549 cells,respectively.Tetramethylazozolium blue(MTT)and T
ranswell experiments were used to detect cell viability and the number oZ invaded cells.Western blot was used to detect the expression levels oZ cyclin DI(CycTnDl), p21,matrin metalloproteinase2(MMP-2) and MMP-9proteins.Double luciferase reporting experiments and RT-qPCR were used t o confirm the targeted regumtion oZ UNC5B-AS1on miR-300.Results Compared with adjacent cancer tissues,the expression oZ UNC5B-AS1in lung cancer tissues was increased,and the expression oZ miR-300 was decreased(1<0.05).Compared with si-NC transfection,the viability oZ A549cells and the number oZ migration and invasion cells were decreased,the expression oZ CycTnDl,MMPV and MMP-9were decreased,and the expression oZ p21was increased Cter transfection oZ si-ANC5B-ASl(1<0.05).Compared with miR-AC transfection, the viability of A549cells and the number oZ migmting invaded cells were decreased,the expression oZ CycTnDl, MMPV,and MMP-9was decreased,and the expression oZ p21was increased Cter transfection oZ miR-300(1< 0.05).Compared with cc-Aansfection oZ si-ANC5B-ASl and anti-miR-NC,A549cell viability and migmtion-inva-sion cell numbers were increased,the expression oZ CycTnDl,MMPV,and MMPV was increased,and the expression oZ p21was decreased(1<0.05).miR-300was a target gene oZ UNC5B-AS1.UNC5B-AS1was negativem mg-ulated miR-300expression.Conclusion UNC5B-AS1is highly expressed in non-smaC cell lung cancer.Inhibiting UNC5B-AS1could inhibit the proliferation,migration and invasion oZ non-smaC cell lung cancer cells by targeting miR-300.
通乳器
(Key words)UNC5B-AS1；miRV0；non-smaC cell lung cancer；cell proliferation；migration and invasion
肺癌已经成为中国癌症死亡的主要原因！其中,80%以上肺癌病例为非小细胞肺癌，与小细胞肺癌比较，非小细胞肺癌细胞的生长和分裂速度更快，对邻近组织的侵袭和远端转移更早［1］。此外，超过50%非小细胞肺癌患者在确诊时已处于肿瘤晚期，其5年生存率低于15%［2"3］。然而，非小细胞肺癌发病机制并不完全清楚。因此，探究非小细胞肺癌发生、转移的分子机制，寻可靠诊断和靶点是当前亟待解决的重大问题。近年转录组和非编码RNA表达谱研究表明，长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lnRNA)以多种方式调控原癌基因或抑癌基因表达，参与包括非小细胞肺癌在内的多种癌症的肿瘤生长、侵袭、转移和耐药过程⑷。不协调同源基因5B反义RNA1(uncoordinated gene5B antisense RNA1，/NC5B-AS1)在结肠癌和甲状腺癌细胞和临床样本中表达上调，下调其表达可抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭［5-6］!生物信息学分析显示,miR-300是UNC5B-AS1的潜在靶基因,miR-300已被证实在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因作用［7］o
然而,UNC5B-AS1在非小细胞肺癌中的表达、生物学功能以及UNC5B-AS1能否靶向miR-300参与肺癌进展仍有待证明。本研究以miR-300为切入点，探讨UNC5B-AS1在非小细胞肺癌中的生物学功能和其分子机制，以期为非小细胞肺癌分子提供新的靶点。
资料与方法
—、实验材料
A549细胞购于中国典型培养物保藏中心；杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecca's modified EayleO medium,DMEM)培养液、胎牛血清、Lipofectamina 2000购于美国Invitogen公司；逆转录试剂盒、SYBR Premia Ex Taq购于大连TAKARA生物技术有限公司；UNC5B-AS1小干扰RNA(T-TNC5B-AS1)、无序
列阴性对照(S/NC)%miR-300模拟物(mil-300mioics)%mimics阴性对照(miR-NC)%miR-30抑制物(anti-miR-300)、抑制物阴性对照(anti-miR-NC)%PCR引物、UNC5B-TS1野生型(WT-UNC5B-AS1)或突变型(MUT-NNC5B-TS1)荧光素酶报告基因载体由上海吉玛制药公司提供;Transweli小室购于美国coming公司；四甲基偶氮卩坐蓝(methyl thia-zolyS tetrazolium,MTT)试剂、放射免疫沉淀测定(Radioimmunoprecipitation assay,RIBA)缓冲液、聚偏二氟乙烯膜购于上海碧云天生物公司；兔源细胞周期素D1(CyclinD1)%p21%基质金属蛋白酶2(matGx metaioproteinasa2,MMP-2)%MMP-9%磷酸甘油醛脱氢酶"glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAP-DH)抗体、山羊抗兔TG为美国Abeam公司。
二、组织来源
本研究选取2015年1月至2017年6月于我院进行手术的30例非小细胞肺癌患者(病理类型为鳞癌12例，
腺癌10例，腺鳞癌8例；病理分期为T1期15例、T2期9例、T3期6例，N0期13例，N1期10例,N2期7例，均为M0期)，其中男性22例，女性8例，年龄38岁至72岁之间。所有患者术前未接受放疗、化疗和其他抗肿瘤，术中收集肿瘤组织和癌旁组织。本研究得到了医院医学伦理委员会的批准，所有患者在术前签署知情同意书。
三、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测A549细胞中UNC5B-TS1和miR-300的表达
采用TGzol试剂从癌组织、癌旁组织中分离总RNA。利用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，引物序列如下：UNC5B-TS1上游5'-GATCCTGC-CTCAGGGAAA3，下游5'-GCTCAAGAGGTTGG-GACT-3，；GAPDH上游5'-GGTCGGAGTCAACG-GATTTGN'，下游5'-TTGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3'；miR-300上游5'-TATACAAGGGCAGACTC-TCTCTN'；U6上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACAN'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'用SYBR Premia Ex Taq在ABI PRISM7500荧光定量PCR仪上进行实时PCR分析。采用2-AA Ct法计算UNC5B-AS1和miR-300的相对表达水平。
四、细胞培养
细胞复苏后，采用含10%胎牛血清的DMEM的培养基于37V%CO2体积分数5%的细胞培养箱中培养A549细胞，按照1:2比例每两天换液一次，当细胞融合至80%时进行传代，去对数期细胞用于实验。
五、细胞转染和实验分组
将对数期A549细胞按2x105cells/接种于6孔板，当细胞融合度达到60%时进行瞬时转染。利用Lipofectamina2000将si-NC、si-NNC5B-TS1、miR-NC%miR-300mioics%si-UNC5B-TS1+anti-miR-NC% W-UNC5B-TS1+anG-miR-300分别转染A549细胞，依次命名为si-NC组、W-UNC5B-TS1组、miR-NC 组、miR-300组、W-UNC5B-TS1+anG-miR-NC组、W-UNC5B-TS1+anG-miR-300组。转染48h时，收集细胞检测转染效果合格后进行后续实验。
六、MTT法检测A549细胞增殖活力
将各组A549细胞按照5x105cells/孔,100 &L孔接种到96孔板，每组设置3个复孔，培养24% 48%72h后按照20&L孔加入质量浓度为5g/L的MTT溶液,37V继续孵育4h，按照150&L孔加入DMSO试剂，振荡10mO使其充分溶解结晶，酶标仪于490nm处检测各孔的吸光度值。
七、Transweli实验检测A549细胞迁移和侵袭能力
侵袭实验：转染48h，收集各组A549细胞，消化后用无血清DMEM培养液制备单细胞悬液。取100&L细胞悬液加入到包被基质胶的Transweli上室；取500&L含10%胎牛血清的DMEM培养液作为化学引诱剂加入24孔板下室。在37V%5%CO2的培养箱中培养24h，用棉签擦去Transwel i上室未迁移细胞，磷
酸盐缓冲液冲洗后，用甲醇、结晶紫溶液分别对下室膜进行固定和染。随机选取3个视野，进行细胞计数，其均值即为侵袭细胞数。采用未包被基质胶的Transweli小室进行迁移实验，其他步骤同侵袭实验。
、Westeen b ot检测A549细CyconD1、P21、MMP-2和MMP-9
采用RIPA缓冲液提取各组A549细胞总蛋白, BCA法测定其浓度。取30&y蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将分离的细胞蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%的脱脂牛奶溶液封闭膜后，加入稀释的一抗溶液(MMP-2和MMP-9为1：500,CyclinD1和P21为1：1000, GAPDH为1:2000)'孵膜1h，洗膜后,
加入稀释的二抗溶液(1:2000)室温条件孵育膜1 h。洗膜后，加入化学发光试剂显影。采用目的蛋白与内参蛋白GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表
达水平。
、统计学分析
采用SPSS 21. 0
分析，实验数据
以均数± （J±s ） ，组
采用独立样
t 检验 分析，多组间比较采用单因素方差分
析，进一步组间两两比较采用SNK-检验。P <
0. 05 为
。结 果
一、 IncRNA UNC5B-NS1 和 miRFOO 在肺癌组
织中的
组织中UNC5B-AS1的表达水平较癌旁组
著升高，miRFOO 的表达较
组 著降低
（P<0. 05）（见表 1 ）o
二、 抑制 1n cRNA UNC5B-NS 1 表达对 A549 细
的
与si-NC 组比较，s /UNC5B-AS1组A549细胞 UNC5B-AS1的
著降低，提示A549细 中
UNC5B-AS1的 受 制。与si-NC 组比较，T-UNC5B-AS1组A549细胞活力、CyclinDl 蛋白表达
显著降低,p21 著 高（P<0.05）（见
2、 1 ）o
表1 IncRNA UNC5B-AS1和miR-300在肺癌组织中
的表达(J ±s ，n =30)
注：与癌旁组织比较，$ P<0. 05
分组
UNC5B-AS1miR-300组 1.02 ±0.06
1.00 ±0.05组 3.52 ±0.32 $0.36 ±0.03$
i 42.05860.118
P
<0.001
<0.001
si-NC si-UNC5B-AS1
表2 抑制IncRNA UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖的影响（j ±s ,n =9 ）
分组UNC5B-NS1 -
0D (490 nm )
CyclinDl 蛋白p21蛋白
24 h 48 h 72 h
T-TC 1.00 ±0.080.51 ±0.050.82 ±0.08
1.44 ±0. 110.75 ±0.070.19 ±0.02T-TNC5BAS1
0.58 ±0.05$
0.42 ±0.04$
0.53 ±0.05$
0.62 ±0.06$0.32 ±0.03$0.56 ±0.05$i 13.356
4.2179.22219.633
16.939
20.612
P
0.001
0.0010.001
0.0010.0010.001
注：与T-TC 组比较，$ P<0. 05
表3 抑制lccRNA UNC5B-AS1表达对A549细胞迁移侵袭的影响（J±pn =9）
分组移细数（个）侵袭细数（个）MMP-2MMP-9
T-TC 129.32 ±11.48
108.27 ±10.42
0.65 ±0.060.83 ±0.08T-TNC5BAS1
65.22 ±6.47$50.69 ±5.13$0.24 ±0.03$0.37 ±0.03$i 14.593
14.873
18.336
16.152P
0.001
0.001
0.001
0.001
注：与T-TC 组比较，$ P<0. 05
表4 miR-300过表达对A549细胞增殖、迁移侵袭的影响（J±pn =9 ）
分组miR-30024 h 0D (490nm )48 h 72 h 移细 数（ 个）侵袭细胞 数（ 个）CyclinDl 蛋白
p21 蛋白MMP-2蛋白MMP-9 蛋白miR-NC
麦克风咪头
1.00 ±
0.53 ±0.85 ±
1.49 ±
静压测试124.59 ±105.87 ±
0.77 ±
0.17 ±0.66 ±
0.81 ±
0.060.050.070. 1212.33
10.220.070.020.060.08miRROO 2.91 ±
0.49 ±
0.61 ±
0.76 ±
71.24 ±59.68 ±0.38 ±0.51 ±
0.29 ±
0.43 ±
0.29$0.030.06$0.07$7.41$ 5.64$
0.03$
0.05$0.03$0.04$
i 19.349 2.058
7.80915.764
11.12611.87115.363
18.94116.547
12.746
P
0.001
0.056
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.0010.001
注：与miR-TC 组比较，$ P<0.
05
三、抑制lncRNA UNC5B-TS1表达对A549细胞迁移侵袭的影响
包覆胶水与W-NC组比较，W-NNC5B-TS1组A549细胞迁移和侵袭细胞数、MMPO和MMPO蛋白表达显著降低（P<0.05）（见表3、2）。
si-NC si-UNC5B-AS1
四、miR-300过表达对A549细胞增殖、迁移侵袭的
与miR-NC组比较，miR-300组A549细胞miR-300的表达水平显著升高，提示已成功A549细胞miR-300表达。与miR-NC组比较，miR-300组A549细胞在48、72h细胞活力、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低，p21著升高（P<0.05）（见表4、图3）o
图3增殖、迁移侵袭相关蛋白表达
五、lncRNA UNC5B-TS1靶向调控miR-300的表达"LncBaso Predicted a.2）
采用生物信息分析工具LncBaso Predicted a.2在线分析显示，UNC5B-TS1与miR-300之间存在部分连续互补的核，酸序列（见4）o双荧光素
告实验显示，上调miR-300表达可降低WT-NNC5B-AS1荧光素告载体的荧光素酶活性（P<0.05），而对MUT-NNC5B-AS1活性无显著影响（见表5）。与pcDNA组比较，pcDNA-NNC5B-TS1组A549细胞miR-300的表达水平显著降低；与si-NC 组比较，/二NC5BAS1组A549细胞miR-300的表达水平显著升高（P<0.05）（见表6）o
WT-UNC5B-AS15'caaaguguUCUCUCCUUGUAUu3'
miR-3003*cucucAGACGGGMCAUAu5'
MUT-UNC5B-AS15'caaaguguGACCUAUCGUCCGu3*
铝膜气球
图4lncRNA UNC5B-AS1的序列中含有与miR-300
互补的核昔酸序列
表5双荧光素酶报告实验（X±s,n=9）
分组WT-NNC5B-TS1MUT-NNC5B-TS1 miR-NC 1.01±0.08 1.05±0.06 miR-3000.63+0.06* 1.02±0.07
t11.4000I976
P0I0010I344注：与miR-NC组比较，*P<0.05
表6lncRNA UNC5B-AS1调控miR-300的表达（x±s,n=9）分组miR-300
pcDNA 1.00±0.06
pcDNA-NNC5B-TS10.57±0.05$
si-TC 1.01±0.08
W-NNC5B-TS1 2.81±0.27#
F418.465
P0I001
注：与pcDNA组比较，*P<0.05；与si A C组比较，#P<0.05
六、抑制miR-300表达逆转了抑制lncRNA UNC5B-TS1表达对A549细胞增殖、迁移侵袭的作用
与W-NC组比较，W-NNC5B-TS1组A549细胞miRAOO的表达水平显著升高，细胞活力、迁移和侵袭
细胞数、CyclOD1、MMP-2和MMPA蛋白表达显著降低,p21著升高；与W-NNC5B-TS1+ anti-miR-TC组比较，si-NNC5B-AS1+anti-miR-300组A549细moR-300的水平著低，细活力、迁移和侵袭细胞数、CyclOD1、MMP-2和MMPA 著升高，p21著低（P< 0.05）（见7、5）o
讨论
近年来，非小细胞肺癌发病率和高趋势，已为威康的公共卫生问题⑻。lncRNA是多种生物学过程的关控因子，
证
