网络出版时间：２０２０－１２－１５１７：２７ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２０１２１５．１１２０．０１６．ｈｔｍｌ
焦 磊，宫熳钰，张 莹
（哈尔滨医科大学药学院药理学教研室，黑龙江哈尔滨 １５００００）
收稿日期：２０２０－０８－２０，修回日期：２０２０－１０－２３
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１６７０２３８，８１９７０３２０）；黑
龙江省自然科学基金资助项目（ＮｏＹＱ２０２０Ｈ００９）
作者简介：焦 磊（１９９１－），女，博士，讲师，研究方向：心血管药理
学，
Ｅ ｍａｉｌ：ｊｉａｏｌｅｉ１１６＠１６３．ｃｏｍ张 莹（１９８０－），女，博士，教授，博
士生导师，研究方向：心脑血管药理学，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｊｅｎｎｙｉｎｇ２２３＠１２６．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０１．００８
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０１－００３８－０５中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２９．２４；Ｒ３２９．４１１；Ｒ３４２．２；Ｒ３９４．２；Ｒ５４２．２３
摘要：目的 探究ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌纤维化的调控作用。方法 采用结扎小鼠心脏冠状动脉左前降支的方式建立心肌缺血诱发的心肌纤维化模型；利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术构建心脏特异性过表达ｌ ｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的转基因小鼠；利用Ｍ
ａｓｓｏｎ染检测小鼠心脏组织心肌纤维化情况；利用血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）诱导原代培养的小鼠心肌成纤维细胞，建立离体心肌纤维化模型，并转染ｓｉＲＮＡ（ｓｉＺＦＡＳ１）用于敲减ｌ ｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１；利用ＭＴＴ法检测心肌成纤维细胞增殖情况；利用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ ＰＣＲ）实验检测ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１、转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）、Ⅰ型胶原（Ｃｏ
ｌ１ａ１）和Ⅲ型胶原（Ｃｏｌ３ａ１）的表达情况。利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验检测α 平滑肌肌动蛋白（ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ，α ＳＭΑ）的表达情况。结果 在心肌纤维化模型小鼠的心脏组织中，ｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的表达显著升高，ＡｎｇⅡ诱导的心肌成纤维细胞中敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１后，Ｃｏｌ３ａ１和ＴＧＦβ１的表达显著降低；心脏特异性过表达ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的转基因小鼠心脏组织中出现胶原沉积，并且α ＳＭＡ、Ｃｏｌ１ａ１和Ｃｏｌ３ａ１的表达显著升高。结论 ｌ
ｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１在心脏组织中的高表达会诱导心肌纤维化，敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１可以缓解心肌纤维化。关键词：长链非编码ＲＮＡ；ＺＦＡＳ１；心肌纤维化；ｓｉＲＮＡ；转基因动物
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
长链非编码ＲＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｌｎ ｃＲＮＡ）是一类转录本长度大于２００ｂｐ、不具有编码
成熟蛋白质能力的Ｒ
ＮＡ分子［１］
。
深水采样器近年来，大量研究显示［２－３］
，ｌｎｃＲＮＡ参与肿瘤、糖尿病、心血管疾病等
多种疾病的发生发展中。锌脂蛋白编码基因Ｚｎｆｘ１（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒ，ＮＦＸ１ ｔｙｐｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１）的反义链即锌脂蛋白反义链１（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｎｔｉｓｅｎｓｅ１，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１），是一种长链非编码ＲＮＡ。最初，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１被发现对乳腺癌、
结直肠癌等肿瘤具有调控作用［４－５］。我们前期研究发现，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心
血管系统具有调控作用。ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１是急性心
肌梗死的外周血潜在诊断标志物［６］。深入机制研
究我们发现，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１是肌浆网钙ＡＴＰ酶２ａ
（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＣａ２＋ＡＴＰａｓｅ２ａ，ＳＥＲＣＡ２ａ）
的内源性抑制剂，诱发心肌细胞内钙超载，从而引起
心肌梗死后心脏收缩舒张功能障碍［７］。此外，我们
还揭示心肌梗死后心肌细胞中ｌ
ｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的高表达会引发心肌细胞线粒体凋亡途径激活，从而诱
发心肌细胞凋亡［８］。铍青铜热处理
心肌纤维化（ｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＣＦ）常常伴随病理性心肌肥厚、心肌梗死及心力衰竭等多种心血管疾
病发生。心肌纤维化一旦发生难于逆转［９－１０］。目
前，临床上针对心肌纤维化的特异性手段相对缺乏，是该领域的瓶颈问题。因此，探索心肌纤维化发生发展的关键机制，发现心肌纤维化的新靶点，并针对分子水平的新靶点提出有效的防治措施，具有重要的意义。本研究通过构建在体和离体心肌纤维化模型以及过表达ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１转基因小鼠，探究ｌ
ｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对小鼠心肌纤维化的调控作用。１ 材料与方法
１．１ 药品与试剂 阿佛丁（Ａｖｅｒｔｉｎ）购买自Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ公司，货号为Ｔ４８４０２；ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的ｓｉＲ ＮＡ（ｓｉＺＦＡＳ１）：ｓｅｎｓｅ５′ ＧＣＧＵＧＡＡＣＵＣＣＵＧＡＧ ＧＣＧＡｄＴｄＴ ３′和ａｎｔｉｓｅｎｓｅ５′ ＵＣＧＣＣＵＣＡＧＧＡＧＵＵ ＣＡＣＧＣｄＴｄＴ ３′购买自广州市锐博生物科技有限公司；血管紧张素Ⅱ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ，ＡｎｇⅡ）购买自Ｓｉｇｍａ公司，货号ａ９５２５。ＭＴＴ试剂购买自Ｓｉｇｍａ公司货号为Ｍ２１２８ １００ＭＧ，引物购买自生工生物工程（上海）股份有限公司，引物序列如下表所示。ＴＲ Ｉｚｏｌ试剂购买自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，货号为１５５９６０２６；
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３·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）：３８～４２
逆转录试剂盒ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＫｉｔ购买自ＴＯＹＯＢＯ公司，货号为ｆｓｑ １０１；ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购买自ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司，货号为４３６４３４４。α 平滑肌肌动蛋白（ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ，α ＳＭΑ）抗体购买自Ａｂｃａｍ公司，货号为ａｂ７８１７。
Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（５′ ３′）ＬＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（５′ ３′）
ＺＦＡＳ１ＡＧＣＧＴＴＴＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴ
Ｃｏ１ａ１ＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＴＣＡＡＧ
Ｃｏ３ａ１ＴＴＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＣＡＡＡＧＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧ
ＴＧＦβ１ＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡＴＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡ
β ａｃｔｉｎＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡ
１．２ 仪器 低温高速离心机（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；超纯水系统（美国Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司）；酶标仪（瑞士Ｔｅ ｃａｎ公司）；ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００分光光度计（美国Ｔｈｅｒ ｍｏＦｏｒｍａ公司）；逆转录仪（美国ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ公司）；实时荧光定量ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ公司）；小动物呼吸机（ＵＧＯＢＡＳＩＬＥ）；Ｏｄｙｓｓｅｙ红外荧光扫描系统（ＬＩ ＣＯＲ）。
１．３ 动物 健康清洁级Ｃ５７ＢＬ／６雄性小鼠，８周龄，体质量（２５－２８）ｇ，购买自辽
宁长生生物技术有限公司（ＮＯ．ＳＣＸＫ（辽）２０２０ ０００１）。ＬｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１转基因小鼠，通过ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠染体中条件性敲入小鼠ＺＦＡＳ１基因，将稳定遗传的ＺＦＡＳ１敲入小鼠与工具小鼠（αＭＨＣ Ｃｒｅ）杂交，最终获得心脏特异性过表达ｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的转基因小鼠。实验动物的使用均符合哈尔滨医科大学动物伦理委员会规定。
１．４ 方法
１．４．１ 建立小鼠心肌梗死（ＭＩ）模型 Ｃ５７ＢＬ／６小鼠腹腔注射麻醉剂２％阿佛丁溶液（０ ０１ｍＬ·ｇ－１）后，固定，气管插管呼吸机，连接心电图装置，待呼吸稳定后，打开胸腔，撕开心包膜，以７／０带针缝合线结扎冠状动脉左前降支，待心尖变白，心电图（ＥＣＧ）显示ＳＴ段明显太高，表明心肌梗死模型建立成功。假手术组（Ｓｈａｍ）不结扎，其他操作与实验组相同。关闭胸腔，缝合伤口，继续饲养４周后，用于后续实验。
１．４．２ Ｍａｓｓｏｎ染 取心肌梗死模型小鼠心脏梗死边缘区组织块，Ｓｈａｍ组小鼠、ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１转基因小鼠和野生型小鼠左心室心脏组织块，置于４％多聚甲醛溶液中进行固定，石蜡包埋、切片，依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ２０ｍｉｎ→二甲苯Ⅱ２０ｍｉｎ→无水乙醇Ⅰ５ｍｉｎ→无水乙醇Ⅱ５ｍｉｎ→７５％乙醇５ｍｉｎ梯度脱水→水洗，苏木精液染核５－１０ｍｉｎ。
用Ｍａｓｓｏｎ丽春红酸性复红液５－１０ｍｉｎ，２％冰醋酸水溶液浸洗，１％磷钼酸水溶液分化３－５ｍｉｎ，光绿液染５ｍｉｎ，０ ２％冰醋酸水溶液浸洗，９５％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
１．４．３ 原代成纤维细胞培养 取１－３ｄ内新生Ｃ５７ＢＬ／６乳鼠，７５％的乙醇中消毒，采用断头法处死乳鼠后，取出心脏，剪碎心脏组织，加入胰蛋白酶消化心脏组织，用含有１０％胎牛血清的高糖培养基终止消化，待所有组织块消化完毕后，１５００ｒ·ｍｉｎ－１条件下离心５ｍｉｎ，弃去上清，用含血清的培养液重悬细胞，细胞悬液均匀铺到六孔板中，３７℃孵箱中培养１ ５ｈ后，成纤维细胞贴壁，弃掉悬液，加入适量的含血清培养液，培养成纤维细胞。
１．４．４ 细胞加药与转染 原代培养的心肌成纤维细胞贴壁后，细胞密度达７０％－９０％时进行加药和转染实验。实验分为对照组、加药ＡｎｇⅡ组（终浓度为１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）、加药ＡｎｇⅡ后转染ｓｉＺＦＡＳ１（终浓度为１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）组，加药ＡｎｇⅡ后转染阴性对照ｓｉＮＣ（终浓度为１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１）组，加药和转染４８－７２ｈ后进行后续实验。
１．４．５ ＭＴＴ 将加药ＡｎｇⅡ组和对照组心肌成纤维细胞中加入ＭＴＴ溶液（０ ５ｍｇ·Ｌ－１，２０μＬ），在３７℃孵箱中孵育４ｈ后，弃去液体，每孔加入２００μＬＤＭＳＯ，将９６孔板平放在水平摇床上１０ｍｉｎ，用酶标仪检测在４９０ｎｍ的吸光度值。
１．４．６ 实时荧光定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ，ｑＲＴ ＰＣＲ） 取心脏组织样本或心肌成纤维细胞，以ＴＲＩｚｏｌ法提取ＲＮＡ，利用ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００分光光度计测定ＲＮＡ浓度，按照ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＫｉｔ试剂盒的方法将ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ。配置ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法ＰＣＲ反应体系，包括ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（１０μＬ），ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１μＬ），ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１μＬ），ｃＤＮＡ（１μＬ），Ｎｕｃｌｅａｓｅ ＦｒｅｅＷａｔｅｒ（１μＬ）。ＰＣＲ反应程序为９５℃进行１０ｍｉｎ，９５℃变性１５ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，循环进行４０次。采用ΔΔＣｔ法分析Ｃｔ值，以２－ΔΔＣｔ表示目的基因的表达量。１．４．７ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 取心肌组织适量，加入２００μＬ蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂），待心脏组织裂解充分后，１２０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃离心１５ｍｉｎ，取上清液，利用ＢＣＡ法测定蛋白浓度。采用ＳＤＳ 聚丙烯酸胺凝胶电泳分离蛋白分子，基层胶：７０Ｖ，恒压３０ｍｉｎ，待Ｍａｒｋｅｒ各条带均分开后调电压。分离胶：１１０Ｖ，待目的条带迁移到合适位置时停止电泳进行湿法转膜，冰浴３００ｍＡ恒流转膜５０ｍｉｎ。将转膜完成的ＮＣ膜置于５％脱脂牛奶中，水平摇床室温封
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
闭２ｈ。将封闭好的ＮＣ膜于ＰＢＳ中清洗放入稀释好的一抗中４℃摇床过夜。次日将完成一抗孵育的ＮＣ膜用ＰＢＳＴ清洗３次。于室温避光孵育荧光二抗５０ｍｉｎ，孵育结束后ＮＣ膜用ＰＢＳＴ避光清洗３次。利用Ｏｄｅｓｓｅｙ红外成像扫描仪在红外荧光扫描系统下扫描观察ＮＣ膜，通过配套软件分析蛋白条带光密度值。
１．４．８ 统计学处理 实验数据应用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ７ ０软件进行统计分析。数值以珋ｘ±ｓ表示。两组间比较采用ｔ 检验（ｔ ｔｅｓｔ）。多组间比较采用单因素方差分析（ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅ，ＡＮＯＶＡ）。
２ 结果
２．１ ＬｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１在心肌纤维化模型小鼠心脏组织中的表达情况 小鼠心肌梗死模型建立４周后，取材心脏组织进行Ｍａｓｓｏｎ染，结果显示，ＭＩ组小鼠心脏组织中胶原沉积显著高于假手术组（Ｓｈａｍ），表明在体心肌纤维化模型建立成功。取心脏组织进行ｑＲＴ ＰＣＲ，结
果显示，心肌纤维化模型小鼠心脏组织中ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的表达显著升高（Ｆｉｇ１Ｂ，Ｐ＜０ ０５）。这表明ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌
纤维化具有潜在调控作用。
Ｆｉｇ１ ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｉｎｃａｒｄｉａｃ
ｔｉｓｓｕｅｓｏｆｍｉｃｅｗｉｔｈｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ
（Ａ）ＭｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｓｅｃｔｉｏｎｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＭａｓｓｏｎｔｒｉｃｈｒｏｍｅｓｔａｉ ｎｉｎｇ．Ｓｃａｌｅｂａｒｓ：１００μｍ．（Ｂ）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｉｎｔｈｅｃａｒ ｄｉａｃｔｉｓｓｕｅｓｏｆＭＩｍｉｃｅａｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｂｙｑＲＴ ＰＣＲ． Ｐ＜０ ０５ｖｓＳｈａｍ，ｎ＝３．
２．２ 转染敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的ｓｉＲＮＡ对心肌纤维化的影响 为进一步探究ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌纤维化的调控作用，我们构建了离体水平心肌纤维化模型。ＡｎｇⅡ诱导的心肌成纤维细胞中，细胞增殖显著增加（Ｆｉｇ２Ａ，Ｐ＜０ ０１）；ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的表达显著升高（Ｆｉｇ２Ｂ，Ｐ＜０ ０５）。为进一步探究ｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌纤维化的影响，我们构建了敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＺＦＡＳ１）。ＡｎｇⅡ诱导的心肌成纤维细胞中转染了ｓｉＺＦＡＳ１后，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的表达明显降低。转化生长因子β１（ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ １，ＴＧＦβ１）和Ⅲ型胶原（ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩＩＩａｌｐｈａ１ｃｈａｉｎ，Ｃｏｌ３ａ１）是表征心肌纤维
化的标志性蛋白。ＡｎｇⅡ诱导的心肌成纤维细胞中ＴＧＦβ１和Ｃｏｌ３ａ１的表达显著升高，敲减ｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１后，可以显著降低两者的表达（Ｆｉｇ２Ｂ，Ｐ＜０ ０５）。以上结果表明，敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１可以抑制ＡｎｇⅡ
诱导的心肌纤维化。
维化情况 为进一步探讨ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌纤维化的影响，我们构建了心脏特异性过表达ｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的转基因小鼠。如Ｆｉｇ３Ａ的Ｍａｓｓｏｎ染结果所示，成年ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１转基因小鼠（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ，ＴＧ）心脏组织中胶原沉积比野生型小鼠（ｗｉｌｄｔｙｐｅｍｉｃｅ，ＷＴ）明显增加。此外，ＴＧ组心脏组织中α ＳＭＡ的表达显著高于ＷＴ组（Ｆｉｇ３Ｂ，Ｐ＜０ ０１）。并且与ＷＴ组相比，ＴＧ组Ⅰ型胶原（Ｃｏｌ１ａ１）和Ｃｏｌ３ａ１的表达显著升高（Ｆｉｇ３Ｃ，Ｐ＜０ ０５）。这表明ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１过表达转基因小鼠出现了心肌纤维化。
３ 讨论
ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１作为长链非编码ＲＮＡ家族中的一员，在细胞核和细胞质中均有表达，并且其在人和小鼠中具有约７０％的保守性［７］。ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对多种肿瘤的发生、发展具有调控作用。Ｘｉｅ等［１１］研究证实，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１通过靶向ｍｉＲ ４８４促进结直肠癌细胞增殖和侵袭。有研究表明，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１在胃癌组织中高表达，这种高表达是诱发胃癌细胞增殖和迁移的重要原因［１２］。在胶质瘤中，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１可以通过激活内皮间质转化（ＥＭＴ）和Ｎｏｔｃｈ信号通路促进胶质瘤发展，降低晚期胶质瘤患者生存率［１３］。此外，Ｌｉ等［１４］研究发现，ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１通过靶向抑制ｍｉＲ １５０，从而调控ＺＥＢ１、ＭＭＰ１４和ＭＭＰ１６的表达，进而抑制肝癌转移。随着研究深入，我们课题组发现ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１不但对肿瘤具有调控作用，对心血管系统也发挥重要作用。我们研究发现ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１具有成为心肌梗死外周血诊断标志物的潜力，对心肌细胞中ＳＥＲＣＡ２ａ蛋白具有抑制作用，从而诱发心肌细胞内钙超载，引起心肌梗死后心脏功能障碍和心肌细胞凋亡［６－８］。ｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１在心肌细胞中的作用已经相对明确，但是其对心肌成纤维细胞以及心肌纤维化的调控作用尚不明确。
本研究中，我们首先构建在体心肌纤维化模型，利用Ｍａｓｓｏｎ染确定心肌纤维化模型构建成功，进一步检测发现心肌纤维化组织中ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的表达显著升高。提示ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌纤维化具有潜在调控作用。离体水平进一步研究发现敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１
后，由ＡｎｇⅡ诱导的心肌成纤维细胞中纤维化相关因子ＴＧＦβ１和Ⅲ型胶原表达显著降低，这表明敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌纤维化具有保护作用。有趣的是，在心肌细胞特异性过表达ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１的转基因小鼠的心脏组织中出现胶原沉积，并且纤维化相关蛋白α ＳＭＡ和Ⅰ
型胶原以
Ｆｉｇ３ ＴｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ
（Ａ）Ｍａｓｓｏｎｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｔｈｅｃａｒｄｉａｃｔｉｓｓｕｅｓｆｒｏｍｔｈｅｃａｒｄｉａｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｋｎｏｃｋ ｉｎｍｉｃｅ（ＴＧ）（×２００）．（Ｂ）Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙ ｓｉｓｏｆɑ ＳＭＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴＧ． Ｐ＜０ ０１ｖｓＷＴ，ｎ＝１２．（Ｃ）Ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＣｏｌ１ａ１ａｎｄＣｏｌ３ａ１ｉｎＴＧｍｉｃｅ． Ｐ＜０ ０５ｖｓＷＴ，ｎ＝３ｆｏｒＣｏｌ１ａ１，ｎ＝９ｆｏｒＣｏｌ３ａ１．
滚刷及Ⅲ型胶原的表达显著升高。前期研究已经阐明ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１在心肌细胞中的高表达会引发心肌细胞凋亡。有研究显示，心肌细胞凋亡与心肌纤维化密切相关，心肌细胞凋亡会刺激心肌成纤维细胞增殖从而导致心肌纤维化［１５］。这可能是ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１转基因小鼠心脏组织产生纤维化的原因。但是具体机制仍有待进一步研究。
综上，本研究发现ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１对心肌纤维化具有调控作用，敲减ｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１具有抗心肌
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
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ｄｒｉａ ｍｅｄｉａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｃａｕｓｉｎｇｃｙｔｏｓｏｌｉｃＣａ２＋ｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｍｙ ｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｍｉｃｅｍｏｄｅｌ．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ，２０１９，１０：９４２．［９］ ＨｅＳ，ＷｕＪ，ＬｉＳＨ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｃｏｒｒｅｃｔｓｍｙｏｃａｒｄｉａｌｓｃａｒｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎｂｌｏｃｋａｇｅａｎｄｒｅｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｓｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｔｏｐｒｅｖｅｎｔｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０２０，２５８：
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居家地毯ｂｙａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．ＢｉｏｍｅｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈ ｅｒ，２０１７，８７：５５５－６０．
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ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｏｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ
ＪＩＡＯＬｅｉ，ＧＯＮＧＭａｎ ｙｕ，ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ
（ＤｅｐｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｏｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｌｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｌｅｆｔａｎｔｅｒｉｏｒｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇｃｏｒｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｏｆｈｅａｒｔ；ｔｈｅｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｃａｒｄｉａｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍａｓｓｏｎｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｆｉｂｒｏｓｉｓｏｆｈｅａｒｔｔｉｓｓｕｅｓ；ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ（ＡｎｇⅡ）ｗａｓａｄｄｅｄｔｏｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｉｎｖｉｔｒｏｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｍｏｄｅｌ，ａｎｄｓｉＲＮＡｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｏｋｎｏｃｋｄｏｗｎｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１；ＭＴＴｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａ ｔｉｖｅＰＣＲ（ｑＲＴ ＰＣＲ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ１（ＴＧＦβ１），ｔｙｐｅＩｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｃｏｌ１ａ１）ａｎｄｔｙｐｅⅢｃｏｌ ｌａｇｅｎ（Ｃｏｌ３ａ１）．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔɑ ＳＭＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎｃａｒｄｉａｃｔｉｓｓｕｅｓｏｆｍｙｏ ｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｍｏｄｅｌｍｉｃｅ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎｏｆｌｎ ｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｏｌ３ａ１ａｎｄＴＧＦβ１ｉｎＡｎｇⅡｔｒｅａｔｅｄｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏ ｂｌａｓｔｓ．ＣｏｌｌａｇｅｎｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｐｐｅａｒｅｄｉｎｃａｒｄｉａｃｔｉｓｓｕｅｓｏｆｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆα ＳＭＡ，Ｃｏｌ１ａ１ａｎｄＣｏｌ３ａ１ｍａｒｋｅｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＴｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｉｎｈｅａｒｔｔｉｓｓｕｅｓｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ，ａｎｄｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎｌｎｃＲＮＡ ＺＦＡＳ１ｃｏｕｌｄａｌｌｅｖｉａｔｅｍｙｏｃａｒ ｄｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｏｎｇｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ；ＺＦＡＳ１；ｍｙｏｃａｒｄｉ ａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ；ｓｉＲＮＡ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｎｉｍａｌｓ
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊａｎ；３７（１）
