沉默lncRNA MEG3对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能的改善作用及其机制 叶婷1，余维巍2，张存泰2
1华中科技大学同济医学院附属同济医院临床营养科，武汉430030；2华中科技大学同济医学院附属同济医院老年医学科
摘要：目的取样方法
观察沉默lncRNA MEG3对慢性阻塞性肺疾病（COPD ）小鼠肺功能的改善作用，并探讨其机制是否
与调控白细胞介素1β（IL -1β）有关。方法
将32只野生型C57BL /6J 小鼠随机分成control 组、COPD 组、COPD+NC
组、COPD+siMEG3组，每组8只；除control 组小鼠外，均采用香烟烟雾烟熏的方法建立COPD 模型，COPD+NC 组、COPD+siMEG3组同时尾静脉注射siRNA -Lipofectamine 、NC -Lipofectamine 复合体2.5mg /kg ，control 组、COPD 组注射等量生理盐水，1次/周，共注射12次。ASPER 数据库及染质免疫共沉淀实验证实lncRNA MEG3与IL -1β启动子区域存在结合位点，二者存在靶控关系。比较各组小鼠肺组织病理改变、氧合指数及肺湿重/干重，肺组织及BALF 中的lncRNA MEG3及IL -1βmRNA 、蛋白表达。结果 control 组小鼠肺组织结构正常；COPD 组及COPD+NC 组小鼠光通量测试
肺泡结构紊乱，部分肺泡可见不规则扩大，肺泡、小气道及肺血管可见大量炎症细胞浸润；COPD+siMEG3组小鼠肺泡结构较COPD 组及COPD+NC 组完整，肺泡、小气道和肺血管少量炎症细胞浸润，支气管平滑肌层及管壁结构偶见异常。与control 组和COPD+siMEG3组比较，COPD 组、COPD+NC 组肺湿重/干重均升高，氧合指数均降低（P 均<0.05）。各组小鼠BALF 中均未检测到lncRNA MEG3表达。与control 组、COPD+siMEG3组比较，COPD 组及COPD+NC 组肺组织lncRNA MEG3表达均升高且肺组织、BALF 中IL -1βmRNA 、蛋白均升高（P 均<0.05）。结论沉 默lncRNA MEG3可通过降低IL -1β表达而减轻COPD 小鼠的肺损伤，从而发挥肺保护作用。
关键词：lncRNA MEG3；白细胞介素1β；氧合指数；慢性阻塞性肺疾病doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.35.009中图分类号：R563.4
文献标志码：A
文章编号：1002-266X （2022）35-0040-04
Improvement of silencing LNCRNA MEG3on lung function of COPD mice and its mechanism YE Ting 1，YU Weiwei ，ZHANG Cuntai 1Department of Clinical Nutrition ，Tongji Hospital ，Tongji M
edical College of Huazhong University of Science and
Technology ，Wuhan 430030，China
Abstract ：Objective To observe the improvement effect of silencing lncRNA MEG3on lung function in mice with
chronic obstructive pulmonary disease （COPD ），and to investigate whether its mechanism is related to the interleukin -1β
（IL -1β）.Methods
Thirty -two wild -type （WT ）C57BL /6J mice were randomly assigned into four groups ：control group ，
COPD group ，COPD+NC group ，and COPD+siMEG3group ，with eight mice in each group.All mice were exposed to ciga⁃rette smoke （CS ）except the mice in the control group.The COPD+NC group and COPD+siMEG3group were injected with siRNA lipofectamine or NC lipofectamine complex （2.5mg /kg via tail vein injection ，once a week ，12times in total ），and the control group and COPD group were injected with the same amount of saline at the same time.Here we cond570
firmed that there were binding sites between lncRNA MEG3and the promoter region of IL -1βthrough ASPER database and chromatin
内孔撑圆涨紧夹具immunoprecipitation experiment ，thus there was a regulatory relationship between lncRNA MEG3and IL -1β.We further compared the pathological changes ，oxygenation index ，lung wet weight /dry weight ，the mRNA and protein expression lev⁃els of lncRNA MEG3and IL -1βin the lung tissues and BALF of mice in each group.Results
节能减排设备We observed that the
structure of lung tissue in the control group was normal.In the COPD group and COPD+NC group ，the structure of pulmo⁃nary alveoli was disordered and enlarged partly and irregularly ，in addition ，a large number of inflammatory cells were infil⁃
基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（81500032）。
通信作者：余维巍（E -mail ： ）
开放科学（资源服务）
标识码（OSID ）
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trated in the alveoli，small airways and pulmonary vessels.Compared with the COPD group and COPD+NC group，the al⁃veolar structure of mice in the COPD+siMEG3group was more complete with a few inflammatory cells infiltration，and the bronchial smooth muscle layer and tube wall structure were occasionally abnormal.Compared with the control group and COPD+siMEG3group，the mice of COPD group and COPD+NC group showed higher ratio of lung wet weight/dry weight，and lower oxygenation index（all P<0.05）.The expression of lncRNA MEG3was not detected in BALF of mice in all group.Compared with the control group and COPD+siMEG3group，the expression of lncRNA MEG3in lung tissues of COPD group and COPD+NC group increased；additionally，the expression levels of IL-1βmRNA and protein increased in the lung tissues and BALF（all P<0.05）.Conclusion Silencing lncRNA MEG3can attenuate lung injury and play the protective role by mediating down-regulation of IL-1βexpression in COPD mice.
Key words：lncRNA MEG3；interleukin-1β；oxygenation index；chronic obstructive pulmonary disease
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以肺部气流受限为主要特征的慢性、不可逆呼吸系统疾病，其临床发病率及病死率比较高，严重影响患者的生活质量［1］。既往研究显示，白细胞介素1β（IL-1β）与COPD 急性加重频率、中性粒细胞计数和C反应蛋白（CRP）水平均呈正相关关系［2］。IL-1β水平升高与COPD患者NLRP3炎症小体激活以及中性粒细胞的活性密切相关，提示IL-1β与COPD患者的炎症反应有关［3］。本课题组前期也发现，COPD患者支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-1β水平增高，IL-1β与其肺功能呈负相关关系、与急性加重频率呈正相关关系。然而，目前关于IL-1β与COPD发生的临床前期研究均以失败告终［4］。因此，有必要深入研究IL-1β在COPD发生中的分子调控机制，发展恰当的靶向手段。随着高通量测序技术日渐成熟，已有研究发现COPD患者的部分长链非编码RNA（lncRNA）出现差异表达［5］，其中lncRNA MEG3被报道参与了COPD的疾病进展过程［6］。2020年5月—2021年11月，本研究观察了沉默lncRNA MEG3对COPD小鼠肺组织、BALF中
IL-1β表达及肺功能的影响，探讨lncRNA MEG3是否通过IL-1β参与COPD小鼠的肺损伤。现报告如下。1材料与方法
1.1材料实验动物：SPF级野生型雄性C57BL/ 6J小鼠32只，10～12周龄，体质量（24±2）g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，许可证号：WYTJH（e）2019-0044。主要试剂：lncRNA MEG3 siRNA及阴性对照siRNA（NC siRNA）均购自上海吉玛基因股份有限公司，分别溶解于不含RNA的无菌水中，取适量于室温下孵育30min，形成siRNA-Li⁃pofectamine和NC-Lipofectamine复合
体（10g/L）；小鼠IL-1βPCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scien⁃tific公司，IL-1β抗体购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司，IL-1βELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；大前门香烟（焦油10mg、烟碱0.8mg、CO12mg）购自上海卷烟厂。
1.2COPD小鼠模型构建与分组处理将32只野生型C57BL/6J小鼠随机分成control组、COPD组、COPD+NC组、COPD+siMEG3组，每组8只。除con⁃trol组小鼠外，均采用香烟烟雾烟熏的方法建立COPD模型，方法如下：将小鼠置于自制烟熏有机玻璃舱（40cm×30cm×16cm）中，全身暴露在3支香烟的烟雾中，3次/天，每次间隔30min，共持续12周。COPD+NC组、COPD+siMEG3组同时尾静脉注射siRNA-Lipofectamine、NC-Lipofectamine复合体
2.5 mg/kg，control组、COPD组注射等量生理盐水，1次/周，共注射12次。
1.3标本获取各组小鼠最后一次烟熏后，经4%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定，经下腔静脉采血，静置后低温离心获得血清，-70℃保存，同时取动脉血0.2 mL用于血气分析。立即暴露气管和双肺，在气管上段作一横行切口，并夹闭左侧主支气管，用注射器经气管切口向右肺缓慢注入4mL磷酸盐缓冲液（PBS），并进行回收（回收率85%～95%），获得BALF，重复3次；将第1次的BALF离心后取上清，-70℃保存，取其沉淀与后两次BALF混匀并离心，弃上清，再将沉淀用1mL PBS洗涤3次，转移至1.5mL EP管中。取出左肺，将4%多聚甲醛溶液1mL经左主支气管注入左肺，并将其浸泡于4%多聚甲醛溶液24h。
1.4肺组织病理观察取各组左肺下叶组织，常规进行脱水、石蜡包埋、切片，HE染后显微镜下观察肺组织病理学改变。
1.5动脉血氧合相关指标检测取各组小鼠动脉血0.2mL进行血气分析，检测氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）和pH，并计算氧合指数。
1.6肺湿重/干重测定取各组小鼠左肺上叶组织，称其湿重后置于80℃烘箱中烘烤24h，称其干重，计算肺湿重/干重。
1.7lncRNA MEG3与IL-1β的靶控关系分析
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JASPER数据库预测lncRNA MEG3与IL-1β之间存在结合位点（OSID码图1A、B）。进行染质免疫共沉淀实验：收集1×108个气道上皮细胞，使用3%的甲醛交联细胞10min，加入1.5mmol/L Glycine终止交联反应；依次裂解细胞膜和细胞核，使用超声将细胞核中的DNA片段剪切到250bp左右；将超声后的DNA片段离心后取上清，加入钙调蛋白2抗体5μg 孵育过夜；以对应种属的IgG作为阴性对照，提取DNA进行荧光定量PCR检测，证实lncRNA MEG3与IL-1β启动子区域存在结合位点，提示二者存在靶控关系（OSID码图1C）。
1.8肺组织及BALF中lncRNA MEG3、IL-1βmRNA检测采用实时荧光定量PCR法。取各组肺组织及BALF，TRIzol法提取总RNA，测定浓度后按照试剂盒说明书逆转录为cDNA，采用SYBR-Green ⅠReal-time PCR Kit进行PCR反应。lncRNA MEG3引物序列：上游引物5'-ACCTCGTGTGGGGAAA⁃GATCA-3'，下游引物5'-CCATCGCCAAACCACTG⁃GA-3'；IL-1β引物序列：上游引物5'-CCGCAGCCTA⁃CATCATTC-3'，下游引物5'-CGCCATAAGCCCTCC⁃TA-3'；内参GAPDH引物序列：上游引物5'-AGGTC⁃GGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物5'-TG⁃TAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
1.9肺组织及BALF中IL-1β蛋白检测取各组肺组织及BALF，参照IL-1βELISA试剂盒说明书检测肺组织及BALF中的IL-1β蛋白表达，严格按照试剂盒说明书操作。
1.10统计学方法采用GraphPad Prism9.0统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验，呈正态分布以
-x±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组小鼠肺组织病理情况比较control组小鼠肺组织完整，未见明显的炎症细胞浸润，无明显肺泡水肿及结构破坏，支气管平滑肌层及管壁结构完整无明显异常；COPD组及COPD+NC组小鼠肺泡结构紊乱，部分肺泡可见不规则扩大，肺泡、小气道及肺血管可见大量炎症细胞浸润；COPD+ siMEG3组小鼠肺泡结构较COPD组及COPD+NC 组完整，肺泡、小气道和肺血管少量炎症细胞浸润，支气管平滑肌层及管壁结构偶见异常。见OSID码图2。
2.2各组小鼠氧合指数和肺湿重/干重比较见表1。
2.3各组小鼠肺组织、BALF中lnc RNA MEG3及IL-1βmRNA、蛋白比较见表2。
3讨论
炎症一直以来都是COPD发病机制的研究重点，吸烟是COPD慢性持续炎症反应的主要诱因，但部分COPD患者戒烟后肺部炎症反应却持续进展，进一步探索炎症反应的相关机制十分必要。既往研究证实，IL-1β明确参与了COPD的发生发展［7］。IL-
1β信号传导与香烟烟雾和感染引起的慢性炎症、气道重塑和肺气肿有关，并且与几乎所有已知的COPD相关介质和疾病过程相互作用或影响［8］。研究显示，IL-1β是COPD发病过程中肺上皮—间质单位（EMTU）中上皮—成纤维细胞通讯紊乱的主要驱动因素［9］。COPD小鼠肺上皮细胞及巨噬细胞中IL-
1β高表达，导致强烈的炎症反应，并伴有肺气肿和气道重塑［10］；IL-1β与IL-1R1结合形成IL-1R1复合物，通过经典Toll白细胞介素受体（TIR）/骨髓分化初级反应基因88（MyD88）途径激活信号传导，该通路特异性地导致转录因子的核转位，例如p38丝裂原相关蛋白激酶、c-Jun N-末端激酶、激活蛋白1表1各组小鼠氧合指数和肺湿重/干重比较（
-x±s）
组别
control组
COPD组
COPD+NC组
COPD+siMEG3组
n
8
8
8
8
氧合指数
387.52±52.16
224.48±11.25*
215.38±10.19*
323.42±24.28#
肺湿重/干重
4.56±0.65
7.12±0.83*
7.25±0.89*
6.23±0.75#
注：与control组比较，*P<0.05；与COPD组、COPD+NC组比较，#P<0.05。
表2各组小鼠肺组织、BALF中lnc RNA MEG3及IL-1βmRNA、蛋白表达比较（
-x±s）
组别control组COPD组COPD+NC组COPD+siMEG3组n
8
8
8
8
肺组织lncRNA MEG3
0.16±0.03
1.35±0.16*
1.26±0.14*
0.25±0.05#
肺组织IL-1βmRNA
0.36±0.06
1.57±0.21*
1.21±0.15*
0.67±0.07#
BALF IL-1βmRNA
0.17±0.03
0.71±0.08*
0.79±0.08*
0.61±0.05#
肺组织IL-1β蛋白
3.88±0.55
11.45±2.21*
11.23±2.19*
稀疏化
6.57±0.71#
BALF IL-1β蛋白
2.76±0.35
7.24±1.21*
7.56±1.60*
4.19±0.70#
注：与control组比较，*P<0.05；与COPD组、COPD+NC组比较，#P<0.05。42
和NF-κB，可促进多种炎症细胞因子和生长因子的表达［11］。然而，IL-1β拮抗剂在临床上却未成功转化为COPD的方案，究其原因如下：①未使用IL-
1β特异性拮抗剂；②IL-1β拮抗剂的使用时机不清楚；③无法判断IL-1β拮抗剂在肺组织中是否达到合适的血药浓度；④COPD中存在不同的表型，尚缺乏针对不同表型的研究方案［12］。上述因素可能制约了IL-1β拮抗剂的临床应用，同时目前亦缺乏对IL-1β相关信号通路的了解，可能无法从单一途径来阻断IL-1β的致炎作用，需要对IL-1β的上游信号通路进行进一步研究［4］。本研究进一步证实，吸烟所致COPD小鼠的肺组织及BALF中存在IL-1βmRNA及蛋白表达升高，可能参与了COPD小鼠的炎症反应。
为了探索了IL-1β的上游信号通路，本研究通过RPIseq数据库预测了lncRNA MEG3与IL-1β启动子的潜在作用位点；通过染质免疫共沉淀实验验证lncRNA MEG3与IL-1β启动子上存在结合位点，提示lncRNA MEG3可能通过影响IL-1β启动子来调节IL-1β的表达。本研究结果显示，敲减lncRNA MEG3可
以改善COPD小鼠的肺组织病理及肺功能，并且对IL-1β表达具有调控作用。既往研究显示，lncRNA MEG3在COPD患者肺组织中表达上调，与第一秒用力呼气量占所有呼气量的比例呈负相关关系，敲减lncRNA MEG3可减轻香烟烟雾诱导的肺上皮细胞凋亡、炎症反应及细胞毒性［13］。与本研究结果一致。lncRNA MEG3还可能通过调节p53、NF-кB 的表达介导人支气管上皮细胞凋亡和自噬等，我们进一步探索了lncRNA MEG3对下游炎症因子IL-1β的调控效应，证实了lncRNA MEG3在COPD发生发展中具有重要作用。研究显示，在COPD患者的肺组织和经香烟烟雾提取物（CSE）处理的16HBE细胞中lncRNA MEG3表达上调。本研究结果显示，与control组比较，COPD组肺湿重/干重升高，氧合指数降低，肺组织lncRNA MEG3表达升高且肺组织、BALF中IL-1βmRNA、蛋白均升高，提示COPD小鼠存在明显肺损伤及lncRNA MEG3、IL-1β表达升高；与COPD组比较，COPD+siMEG3组肺湿重/干重降低，氧合指数升高，肺组织lncRNA MEG3表达降低且肺组织、BALF中IL-1βmRNA、蛋白均降低，提示沉默lncRNA MEG3可通过降低IL-1β表达而减轻COPD小鼠的肺损伤。
综上所述，COPD小鼠肺组织及BALF中lncRNA MEG3及IL-1β表达均升高，lncRNA MEG3可能通过结合IL-1β启动子区上调IL-1β表达，从而促进气道炎性损伤，加速COPD的病理进程；沉默lncRNA MEG3可通过降低IL-1β表达而减轻COPD 小鼠的肺损伤，从而发挥肺保护作用。但是本研究在小鼠BALF中未检测到lncRNA MEG3表达，提示lncRNA MEG3可能是通过组织水平调节IL-1β表达，lncRNA MEG3是否能够调控IL-1β相关炎症通路，以及具体的调控机制仍需进一步研究。
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