药学与临床研究
Pharmaceutical and Clinical Research
戴国梁，杨欣怡，陈闪闪，许美娟，居文政，邹建东**
南京中医药大学附属医院临床药理科，南京210029
摘要目的：研究大黄蛰虫丸(DZP)对结肠炎相关结直肠癌(CAC"的影响及其可能机制。
方法：以C57BL/6小鼠为研究对象，随机分为对照组、模型组，DZP低(2g・kgT)、高剂量组(4g- kg2*)。除对照组外，其余各组采用AOM/DSS诱导小鼠CAC模型，并于造模中各组给予相应的药
物灌胃干预。实验结束，比较各组小鼠死亡率，并以ELISA检测小鼠血清IL-1/3和IL-18水平；苏
大花石上莲木素-伊红(HE)染观察结肠组织损伤情况；免疫荧光染分析小鼠结肠Occludin和ZO-1的
表达；免疫组化染分析小鼠结肠ATG5&IL-10和IL-18的表达水平；蛋白印迹检测小鼠结肠中
LC3B I/"&SQSTM1及ATG5的蛋白表达水平%结果：经8周灌胃给药，对照组、模型组，DZP
低、高剂量组的死亡率分别为0%&40.00%&20.00%&6.67%%与模型组相比，DZP能显著降低血清
IL-1!和IL-18水平，提高小鼠肠道组织中Occludin和ZO-1的表达水平％同时，DZP能显著降
低模型小鼠结肠组织中IL-10&IL-18及SQSTM1的表达水平，提高模型小鼠肠道组织中的LC3B I/"和ATG5的蛋白表达水平％结论:DZP能显著降低CAC模型小鼠的炎症和死亡率；其作用机制可能与促进CAC模型小鼠肠道自噬改善肠道紧密连接相关。
关键词大黄蛰虫丸；结肠炎相关结直肠癌；小鼠；自噬
中图分类号R965.1文献标志码A文章编号1673-7806(2021)01-001-06
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，目前CRC的发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第4位和第2位。有研究显示，至2035年，所有国家的结肠癌和直肠癌的死亡人数预计将分别上升60.0%和71.5%叫当前对CRC 的研究大多集中在比传统疗法更简便、有效的新疗法上，新药开发及其临床实施可能对改善CRC患者的整体生存率和生活质量起到积极作用。慢性炎症与CRC的发
生发展密切相关，“炎症-异常隐窝-腺瘤-癌症"是结肠炎相关结直肠癌(colitis-associated cancer,CAC(发生的基本路径[2]，炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD(患者如得不到有效的，其30年内罹患CAC的风险要比正常人高20倍叫这提示炎症反应在CAC发生发展中具有重要作用，控制“炎-癌转化”对防治CAC意义重大。
从中药中筛选CAC的有效药物值得期待,
*基金项目—江苏省中医药领军人才(SLJ0208)；江苏省自然科学基金面上项目(BK20181504)；江苏省中医院院级课题(.20037)作者简介戴国梁，男，助理研究员E-mail:*******************通讯作者邹建东，男，研究员E-mail:*****************
收稿日期2020-11-11修回日期2021-01-20大黄蛰虫丸(Dahuang Zhechong Pill,DZP)是《金匮要略》经典名方，由熟大黄、黄苓、甘草、桃仁、杏仁、芍药、干地黄、干漆、虻虫、水蛭、蛴螬及蛰虫12味中药组成，是中医临床肿瘤的最常用方剂之一$研究表明,DZP配合化疗可以改善晚期胃癌症状，同时对胃肠道恶性肿瘤患者有益$
前期研究证实，大黄中的活性成分大黄素可以通过抑制血管内皮素受体2(VEGFR2(降低结肠癌HCT116细胞的增殖和迁移叫此外，研究发现，桃仁与杏仁的提取物均能抑制结肠癌细胞的增殖叫黄苓中的活性成分黄苓苷可通过抑制c-Myc、下调SP1转录因子等多种机制诱导结肠癌细胞凋亡叫因此,
DZP可能是结直肠癌的有效药物$在本研究中，拟使用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导的CAC模型小鼠，探究DZP对CAC的影响及其CAC的作用机制$
1材料
1.1仪器
MicroCL17R高速低温离心机(赛默飞世尔科技
1
大黄蛰虫丸对AOM/DSS诱导结肠炎相关结直肠癌小鼠的抑制作用
公司）；DMI3000B光学显微镜（莱卡公司）；Axio Observer Z1荧光显微镜（蔡司公司）；ELx800酶标仪、Mini Protean电泳仪、转印槽及电泳电源$Gel-Doc XR凝胶成像系统（均伯腾仪器有限公司）。
1.2药物与试剂
大黄蛰虫丸（规格：3g/丸，批号：17013622，北京同仁堂制药厂）；偶氮甲烷（AOM，批号:SLBV4
860，规格:25mg/瓶,Sigma公司）；双琥珀酰亚胺辛二酸酯（DSS，批号&160110，规格：500g/瓶，MP biomedicals公司）；小鼠IL-10ELISA检测试剂盒（批号:
ab197742）、小鼠IL-18ELISA检测试剂盒（批号: ab216165）、兔紧密连接相关蛋白Occludin单克隆抗体（批号:ab216327）、兔闭锁小带蛋白（zonula oc-cludens-1,ZO-1）单克隆抗体（批号：ab221547）、兔IL-1!单克隆抗体（批号：ab234437）、兔IL-18单克隆抗体（批号：ab71495）、兔自噬相关蛋白LC3B单克隆抗体（批号：ab192890）、兔 Sequestosome1（SQSTM1）单克隆抗体（批号:ab109012）、兔自噬相关蛋白5同源物（ATG5）单克隆抗体（批号: ab109490），均购自Abcam公司；兔甘油酸-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（批号：10494-1-AP）、辣根过氧化物（HRP）-山羊抗兔IGg（批号：SA00001-2）及FITC-山羊抗兔IGg（SA00003-2）均购自Proteintech公司；3,3^-二氨基联苯胺（DAB）显试剂盒（批号：P0203）、4\,6-二眯基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（批号:C1006）、苏木精-伊红（HE）染液（批号:C0105M）及超敏ECL化学发光试剂盒（批号：P0018M），均购自碧云天生物技术公司；其他试剂为分析纯；去离子水。
1.3动物
60只SPF级C57BL6雄性小鼠，12周,18~22g，购自北京华阜康生物科技公司。实验动物生产许可证号:SCXK（京）2019-0008，饲养于南京中医药大学实验动物中心，许可证号:SCXK（苏）2018-0049。2方法
2.1CAC模型小鼠的复制、分组与给药
60只SPF级C57BL/6雄性小鼠，适应性饲养后，随机分为4组：对照组、模型组、DZP低剂量组（2g・kg-1）、DZP高剂量组（4g-kg-1）"每组15只。除对照组外，其余各组小鼠，给予单次10mg-kg-1 AOM腹腔注射,1周后联合3个循环DSS喂饲（2% DSS饮水1周+正常饮水2周为一个循环），建立AOM/DSS诱导的CAC模型小鼠％对照组同步腹腔注射等体积生理盐水并正常饮水。第1个DSS喂饲循环结束后（开始造模2周后），开始灌胃给予相应药物，对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，周期为8周。在实验周期中，记录小鼠生存情况，并绘制各组小鼠的生存曲线，实验周期结束后，取小鼠血液和结肠组织进行相应检测。
2.2ELISA
使用ELISA试剂盒检测小鼠血液中IL-1!及IL-18的水平。参阅此两种试剂盒说明书，对标准品进行梯度稀释以绘制标准曲线。将不同组的小鼠血清分别加入包被了抗IL-1!或IL-18抗体的96孔板中，同时加入的还有不同浓度的对应试剂盒的标准品。反应30min后加入显底物，之后加入反应终止液。清洗后，将96孔板置于酶标仪中,450nm 波长处检测吸光度值，根据IL-1!及IL-18的标准曲线，计算各小鼠血清中IL-1!及IL-18的水平。
2.3HE染
各组小鼠结肠固定于10%福尔马林，垂直切取一段放于一次性包埋框。以不同浓度乙醇进行脱水。之后将各组小鼠结肠浸泡于二甲苯中20min。融化的石蜡浸泡结肠40min后，更换石蜡，再次浸泡40min。将小鼠结肠包埋成蜡块，小鼠结肠的横截面朝下。使用切片机将含有小鼠结肠的蜡块切成5!m的蜡片，获得小鼠结肠切片。将小鼠结肠切片放入二甲苯中溶解石蜡，再使用从高到低浓度的乙醇进行浸泡，最后将小鼠结肠切片置于去离子水中。
使用苏木素染液对小鼠结肠切片进行染，使用盐酸-乙醇溶液分化后，常水冲洗20min返蓝。在使用伊红染液染后，对小鼠结肠切片进行快速脱水并封片。封片后，使用普通光学显微镜对小鼠结肠组织进行拍照，对其进行组织学评分，评分标准为由轻到重以0~5分评判（5分=显著性增加,3分=中度增加，1分=轻度增加,0分=正常）。根据以下参数进行评判：隐窝萎缩（隐窝个数，隐窝底部与黏膜肌距离）；隐窝多形核白细胞浸润量、单核细胞浸润量；隐窝基底部及黏膜基层淋巴细胞。
2.4免疫组织化学染纳米烟嘴
永磁同步电机转子同HE染中的步骤，获得复水的小鼠结肠组织切片。之后使用3%的H2O2溶液孵育小鼠结肠组织以阻断内源性过氧化物酶%PBS缓冲液清洗小鼠结肠组织后，使用柠檬酸盐缓冲液在95"的水浴锅中孵育小鼠结肠组织20min，以修复小鼠结肠组织中的抗原。正常山羊血清孵育小鼠结肠组织20min，将ATG5、IL-10和IL-18抗体稀释100倍,4"孵育小鼠结肠组织过夜。用稀释后的HRP-山羊抗兔IGg （1：200）在室温孵育小鼠结肠组织2h%PBS清洗后,
2
DAB显液孵育组织以显°PBS再次清洗后，使
用苏木素复染细胞核！将小鼠结肠脱水、透明后封片，置于光学显微镜下观察并拍照。
2.5免疫组织荧光染
同HE染中的步骤，获得复水的小鼠结肠组织切片。之后使用柠檬酸盐缓冲液在95!的水浴锅中孵育小鼠结肠组织20min，以修复小鼠结肠组织中的抗原。正常山羊血清孵育小鼠结肠组织20min，将Occludin和ZO-1抗体稀释100倍,4!孵育小鼠结肠组织过夜。用稀释后的FITC-山羊抗兔IGg （1：200）在室温下孵育小鼠结肠组织2h°PBS清洗后,DAPI染液孵育小鼠结肠切片5min,PBS再次清洗后，甘油封片，置于荧光显微镜下观察并拍照。
2.6蛋白印迹
取小鼠结肠组织，按照其每100mg加入1mL 裂解液的比例，置于EP管中。用均质仪打碎组织, 4°C裂解30min,12000c・min-1离心10min后取上清液，检测小鼠结肠组织的蛋白浓度。制备蛋白印迹实验样品和SDS-PAGE凝胶，各孔加样量为50!=。电泳分离蛋白后，进行转膜操作。使用稀释后的LC3B（1"1000%、SQSTM1（1"1000%及ATG5（1：1000%抗体孵育PVDF膜过夜。清洗后，使用稀释后
的HRP-山羊抗兔IGg（1"10000%孵育PVDF膜2h o再次清洗后，使用凝胶成像系统对蛋白印迹进行显影，存储图片！
2.7统计分析
免疫组织化学染和免疫组织荧光染的图片应用Image pro plus（美国,Media Cybernetics%软件进行计算平均光密度，并导出计量数据！蛋白印迹图片使用Image Lab（美国,Bio-Rad%软件进行相对定量分析，并导出计量数据。所有数据以均数土标准差（！±"%表示，数据结果采用Graph Pad Prism7软件进行方差分析和作图。多组间的比较采用单因素方差分析。#<0.05为具有统计学意义。
3结果
3.1DZP降低CAC模型小鼠的死亡率和血清中炎症因子的水平
与对照组相比，模型组生存率显著降低,15只小鼠存活9只（#<0.01）。给药后DZP显著降低了模型小鼠的死亡率，其中DZP低剂量组存活12只、高剂量组小鼠存活14只（#<0.05%，见图1A°CAC模型小鼠血清IL-1/3和IL-1S水平显著升高（#<0.01%，经DZPS周后，显著降低了CAC模型小鼠血清IL-1/3和IL-1S水平（#$0.01）。见图1B-C。
control
model
占DZP2g-kg']
千DZP4g•kg-1
12345678
Weeks after treatment
折角塞门
图！DZP对CAC模型小鼠的死亡率和
血清炎症因子水平的影响（！±"）
（A）各组小鼠的生存曲线；（"）小鼠血清中IL-&0水平；（C）小鼠血清中IL—&8水平与对照组比较，##!<0.01；与模型组比较,**!<0.01 3.2DZP改善CAC模型小鼠的肠道炎症和病理组织学
小鼠结肠组织免疫组织化学染结果显示，与对照组相比，模型组小鼠结肠中IL-1/3和IL-1S水平显著增加（#<0.01%，经DZPS周后，显著降低了CAC模型小鼠结肠组织中IL-1/3和IL-1S的表达水平（#<0.01%，见图2A-D O HE染结果显示, CAC模型小鼠结肠炎细胞浸润严重,DZP后可显著减
轻CAC模型小鼠结肠内的炎症。对结肠HE 染进行组织学评分结果显示,DZP可改善CAC模型小鼠结肠的病理组织学（#<0.01）。见图2E-F。3.3DZP改善CAC模型小鼠结肠紧密连接
免疫组织荧光染结果显示，与对照组相比, CAC模型小鼠结肠中紧密连接相关蛋白Occludi.及ZO-1的表达显著降低（#<0.01%，经DZPS 周后，显著增加了CAC模型小鼠结肠中Occludi.及ZO-1蛋白的表达（#<0.05,#<0.01%!见图3A-D。
3.4DZP促进CAC模型小鼠结肠自噬
小鼠结肠组织免疫组织化学染结果显示，与对照组相比,CAC模型小鼠结肠中ATG5水平显著降低（#<0.01%，经DZPS周后，显著增加了CAC模型小鼠结肠组织中ATG5的表达水平（#< 0.01%，见图4A-B。蛋白印迹结果显示，与对照组相比，模型组小鼠结肠中SQSTM1蛋白表达水平显著增加（#<0.01%,LC3B I/n及ATG5的蛋白表达水平显著降低。经DZPS周后，显著降低CAC模型小鼠结肠组织中SQSTM1的蛋白表达水平（#< 0.01%，并显著上调CAC模型小鼠结肠组织中LC3B I/n及ATG5的蛋白表达水平。见图4C-F。
3
大黄蛰虫丸对AOM/DSS 诱导结肠炎相关结直肠癌小鼠的抑制作用
control model
E
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5
5
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DZP 2g-kg-!model ##
6
▲ ▲
2-0-3
3
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2
DZP 4g • kg"
control
洗瓶
DZP 2g • kg -1DZP 4g • kg -1
control DZP 4g • kg -1
图2 DZP 对CAC 模型小鼠结肠炎症及病理组织学的影响(！±",#&8)
(A )小鼠结肠IL-10免疫组织化学染代表性图片；(B )小鼠结肠IL-18免疫组织化学染代表性图片；
(C )小鼠结肠IL-10免疫组织化学染平均光密度分析；(D )小鼠结肠IL-18免疫组织化学染平均光密度分析； (E )小鼠结肠HE 染代表性图片；(F )小鼠结肠HE 染病理组织学评分 与对照组比较,##!<0.01 ；与模型组比较
DZP 2g • kg"model
-
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V ▲
严7、八. ・
1 Q *^*1^"**"**'"-^!^**
^4讨论
药理实验表明，结合A0M 及DSS 可诱导CAC 的两步式肿瘤模型，是研究CAC 发病机理的经典模
型o 肿瘤的进展不仅取决于其内在因素，而且受到 多方面的全身过程的影响，尤其是全身性的炎症o
液冷散热器
在某些类型的肿瘤中，发生恶性变化之前就存在炎
症，致癌性变化又会诱发炎症微环境，从而促进肿
瘤的发展o 炎症促进肿瘤的作用已被证实，包括促 进恶性肿瘤细胞的增殖和存活，促进血管生成和转 移⑺。本实验结果表明，DZP 可显著降低CAC 模型小
鼠的死亡率及血清中IL-10和IL-18的水平°
肠道慢性炎症导致其上皮细胞因子和趋化因
子诱导的增加，被认为是导致CAC 及CRC 重要因 素罔，随之而来的变化是肠道上皮细胞增殖、存活和 迁移的改变［9］°有研究表明，发炎的结肠黏膜在没有 发生任何组织学改变之前，其分子信号经历了与癌
症相似的变化［1°］。此外，临床研究显示，大肠腺瘤的
患病率与患者血液中较高的IL-6和TNF-"
浓度有
关，系统性炎症可能与大肠肿瘤的早期发展有关［11］°
因此，抑制肠道炎症可能是延缓或CAC 及
CRC 的有效策略°本实验表明，DZP 可有效抑制
CAC 模型小鼠的肠道炎症，这可能是其减轻CAC 模型小鼠全身炎症并降低小鼠死亡率的原因之一。
研究表明，肠道炎症的增加导致肠道屏障的破
坏，也是导致全身性炎症的直接原因°正如实验观
察到的、CAC 模型小鼠结肠中的紧密连接相关蛋白 Occludin 及Z0-1的表达显著降低，这可能促进了 小鼠肠道炎症和CAC 的发生°在CRC 中，自噬被认
为具有促进肿瘤和抑制肿瘤的双重作用［12］，但潜在 机制仍不清楚°慢性炎症会干扰自噬机制的正常运
作，在上皮细胞中，自噬缺陷可以通过增强氧化应
激和基因组不稳定性，以及激活转录因子来促进肿 瘤的发生［13］°一项临床研究发现,CRC 患者肠道组织
4
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图3 DZP 对CAC 模型小鼠结肠组织Occludin 及ZO-1表达的影响(x±",n =8)
(A "小鼠结肠Occlu+m 免疫荧光染代表性图片；(B )小鼠结肠ZO-1免疫荧光染代表性图片；(C )小鼠结肠Occlu+m 免疫荧光染光密度分析；(D )小鼠结肠ZO-1免疫荧光染光密度分析 与对照组比较‘^P VO.OI ；与模型组比较,**!<0.01
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DZP 4g • kg -1
control model OHI
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14kDa 16kDa 62kDa 32kDa 37kDa
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图4
DZP 对CAC 模型小鼠结肠自噬的影响(！±")
(A )小鼠结肠ATG5免疫组织化学染代表性图片；(.)小鼠结肠ATG5免疫组织化学染平均光密度分析；(C )小鼠结肠LC3B %
SQSTM1及ATG5蛋白印迹代表性图片；(D )小鼠结肠LC3B 蛋白表达相对定量分析；(E )小鼠结肠SQSTM1蛋白表达相对定量分析；
(F )小鼠结肠ATG5蛋白表达相对定量分析 与对照组比较，5#!<0.01 ；与模型组比较,**!<0.01
中ATG5下调网，此结果与本实验结果一致。同时， SQSTM1在CAC 模型小鼠结肠中的表达增加，而 LC3B 的表达减少o 经DZP 5周后，模型小鼠结
肠LC3B I /n 及ATG5的表达增加，而SQSTM1的
表达降低。上述实验结果表明,DZP 增强了 CAC 模 型小鼠结肠的自噬水平,DZP CAC 作用与其促
进结肠自噬有关。
综上所述，本研究结果表明,DZP 显著降低了 CAC 模型小鼠的炎症和死亡率，这与DZP 增加小鼠
结肠自噬水平、促进结肠紧密连接蛋白表达密切相
关，但无法明确其具体作用机制，有待进一步研究。
5
