芦苇内生真菌Choiromyces aboriginum Mü1w1c6 的拮抗作用及其生物防治潜力
曹荣花1
刘晓光2
高克祥1∗
Mendgen K 3
康振生
4
(1.山东农业大学植物保护学院，泰安271018;2.江苏大学生命科学研究院，镇江212013;
3.康斯坦茨大学生物系，德国，康斯坦茨D⁃78457;
硬质合金密封环4.西北农林科技大学
陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌712100)
摘要:Choiromyces aboriginum Mü1w1c6是一株分离自芦苇的拮抗内生真菌。通过离体平板对峙培养检测和光学、电子显微镜观察，以及测定在活体植物上的拮抗活性，研究芦苇内生真菌Choiromy⁃ces aboriginum Mü1w1c6与病原菌及其寄主植物黄瓜之间的相互作用。对峙培养显示出较强的营养和空间竞争能力，对病原菌菌丝生长抑制率多高于60%，对立枯丝核菌Rhizoctonia solani 的抑制率达到100%。显微观察证明它与多种病原菌有缠绕等重寄生现象。在互作研究中,C.aboriginum Mü1w1c6可成功定殖于黄瓜苗的根部，预先接种能有效抑制瓜果腐霉Pythium aphanidermatum 在 黄瓜根部组织细胞内的扩展和定殖，对P.aphanidermatum 引起的黄瓜苗期猝倒病有良好的防效，接种一次内生菌防治效果为44.29%，接种两次生防效果高达88.49%。结果表明,C.aboriginum Mü1w1c6对多种植物病原真菌具有广谱的拮抗活性，对黄瓜苗期猝倒病具有较好的生防潜力。
关键词：内生真菌；芦苇内生真菌；重寄生；侵染过程；生物防治
Antagonism of Choiromyces aboriginum Mü1w1c6,an endophytic fungus
mesh设备isolated from common reed against phytopathogenic
fungi and its potential for biocontrol
Cao Ronghua 1 Liu Xiaoguang 2 Gao Kexiang 1∗ Mendgen K 3 Kang Zhensheng 4
(1.College of Plant Protection,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,Shandong Province,China;2.Institute of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,Jiangsu Province,China;3.Department of Biology,University of Constance,D⁃78457Constance,Germany;4.Shaanxi Key Laboratory of Molecular
Biology for Agriculture,Northwest A &F University,Yangling 712100,Shaanxi Province,China)
Abstract :Choiromyces aboriginum Mü1w1c6is an endophytic fungus isolated from reed with antifungal
activities.The interactions between C.aboriginum Mü1w1c6and the phytopathogenic fungi or host plant
cucumber have been investigated by dual culture experiment on PDA plates and observed by light and electron microscopy,as well as antagonistic activity assessed in plant tests.Dual culture experiment indi⁃
cated high competition of space and nutrition.Inhibition of mycelial growth is more than 60%,and bei
ng the most aggressive for Rhizoctonia solani ,exerting a total inhibition 100%.Microscopic observation showed C.aboriginum Mü1w1c6is able to parasitize many phytopathogenic fungi.Furthermore,C.ab⁃originum Mü1w1c6can successfully colonize in the root of cucumber seedlings.Pre⁃inoculation of C.ab⁃originum Mü1w1c6can significantly hinder the infection and colonization of the phytopathogenic Pythium
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30710103021、30571498)，陕西省农业分子生物学重点实验室开放基金项目(200701)作者简介：曹荣花，女,1979年生，硕士研究生，研究方向为植物病害生物防治,email: ∗通讯作者(Author for correspondence),email:；收稿日期:2008-01-22
第35卷 第2期2008年
4
月
植 物 保 护 学 报
ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA
真空自耗炉
Vol.35 No.2
Apr.
2008
aphanidermatum in the root of cucumber seedlings.At the same time,it is capable to protect cucumber seedlings from damping⁃off caused by P.aphanidermatum under greenhouse conditions,with biocontrol efficacy of44.29%for inoculating once and88.49%for twice.The strain C.aboriginum Mü1w1c6 shows a wide rang antifungal activity against a lot of phytopathogenic fungi,and it has potential for bio⁃control on Pythium damping⁃off of cucumber.
Key words:endophytic fungi;Choiromyces aboriginum;mycoparasitism;infection process;biocontrol
苗期猝倒病是大田和保护地作物上普遍发生的一种病害。据Al⁃Sa’di等[1]的报道，在阿曼苏丹国，黄瓜苗期猝倒病在保护地的发病率达77%，死亡率达75%。因此，寻求高效、安全、持久的防治猝倒病的方法是当务之急。
真菌生防因子防治植物病原菌主要通过营养和空间的竞争、抗生、重寄生以及诱导植物抗病性和生长促进等作用机制[2]。自Weindling等[3]报道了木霉菌Trichoderma spp.的重寄生现象以来，已陆续发现
了许多种植物病原真菌的重寄生菌，其中木霉Trichoderma spp.是目前世界上研究和应用最为广泛的生防真菌，能够定殖于植物根部，诱导系统抗病性并促进植物生长[4]，用于防治多种真菌引起的土传病害及线虫病，并且取得较好的防治效果[4-5]。
Choiromyces aboriginum Mü1w1c6是一株新型内生真菌，对于保护芦苇真菌落结构的生物多样性和维持波登湖区环境的生态平衡具有重要意义[6-7]，但尚未见有关其防治植物病害的报道。为调查其生防潜力及作用机制，作者对该内生菌与植物病原菌Pythium aphanidermatum及其寄主黄瓜苗的相互作用进行研究，测定了C.aboriginum Mü1w1c6对黄瓜苗期猝倒病的生物防治活性。
1材料与方法
1.1材料
生防菌:Choiromyces aboriginum Mü1w1c6，是分离自德国康斯坦茨湖沿岸健康芦苇的内生真菌落中的优势种[6-7]。
病原菌：灰葡萄孢Botrytis cinerea、辣椒菌Colletotrichum capsici、禾谷镰刀菌Fusarium graminea⁃rum、尖孢镰刀菌合欢专化型Fusarium oxysporwm f. sp.pernciosium、尖孢镰刀菌萎蔫专化型Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum、禾顶囊壳Gaeumanno⁃myces itici、围小
丛壳Glomerella cingu⁃lata、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、齐整小核菌Sclerotium rolfsii，由山东农业大学植物病理系资源微生物实验室提供。以上真菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)25℃培养,4℃冰箱中保存。
供试植物：黄瓜种子为神农春二号(Cucumis sa⁃tivus L.cv.Shennongchun No.2)，天津神农种业有限公司生产。
营养土：大田土过筛后，与基质按体积比1∶1混匀、121℃高压湿热间断灭菌3h备用。基质以草炭、蛭石和珍珠岩按一定比例配成，购自山东农业大学艺景园林有限公司。
1.2离体拮抗试验
1.2.1对峙培养：内生真菌C.aboriginum Mü1w1c6和11种植物病原真菌的拮抗试验采用对峙培养法[8]。内生真菌和植物病原真菌分别在PDA平板上培养4~6天，用内径4mm的打孔器在新鲜菌落边缘打孔，沿培养皿(直径60mm)直径接种同质等量内生菌和病原菌的菌饼各一块，两点距中心均为1.5cm。以两点都接种病原菌为对照I，一点接种病原菌、另一点空白为对照II，每处理3个重复。25℃黑暗培养，每24h测量一次病原菌指向内生菌的菌落半径R b，对照I的菌落相向半径R0，对照II的相向半径R0′。
1.2.2拮抗作用的显微观察:25℃对峙培养3~5天后，挑取两菌落交界处的菌丝，制片并在光学显微镜下观察(400×)、照相(Olympus Optical Co.,Ltd., Tokyo,Japan)。扫描和透射电镜样品的制备方法参见文献[8-9]。分别在扫描电镜(JSM⁃6360LV, JEOL Ltd.)10kV和透射电镜(Zeiss,Oberkochen, Germany)60kV下观察拍照。
1.3C.aboriginum Mü1w1c6和瓜果腐霉与黄瓜幼根的互作
黄瓜种子先用自来水冲洗30min，去皮，转入超净工作台70%酒精浸泡30s，用0.1%HgCl2浸泡10 ~12min，无菌水冲洗4~5次，转到无菌滤纸上28℃保湿培养。待黄瓜幼根长至1~2cm长时，接种C.aboriginum Mü1w1c6或瓜果腐霉，接种方法和超薄切片的制备具体参见文献[9]。内生真菌C.abo⁃
801植 物 保 护 学 报35卷
riginum Mü1w1c6和瓜果腐霉与黄瓜幼根的侵染互作方式，参考Susilo等[10]的方法，分别通过光学和电子显微镜进行观察。
1.4C.aboriginum Mü1w1c6对黄瓜猝倒病的温室生防试验
将新鲜的C.aboriginum Mü1w1c6和瓜果腐霉的菌饼接种于已灭菌的麦麸培养基,25℃黑暗培养，待菌丝长满后使用。种子催芽后选取长势一致的幼苗，每盆(12cm×10cm)5株，将上述培养好的C.aborigin
um Mü1w1c6、瓜果腐霉按每盆每次4~5g 接种到根部。
本试验共三个处理:(1)仅播种时接种一次内生菌(T1);(2)播种时接种一次内生菌,7天再接种等量的内生菌(T2);(3)以不接种内生菌为对照(CK)。每处理20株,3次重复。播种第14天挑战接种瓜果腐霉,24h后调查发病情况，每24h调查一次。该生防试验独立进行2次，结果相似，本研究结果取其中一次试验的数据。防治效果(%)=[(对照发病率-处理发病率)/对照发病率]×100。
2结果与分析
2.1C.aboriginum Mü1w1c6对病原菌菌丝生长的抑制
C.aboriginum Mü1w1c6有较强的营养和空间竞争能力，接种后2~4天与供试病原菌菌丝接触，互作方式有以下三种类型:(1)C.aboriginum Mü1w1c6与立枯丝核菌接触后，覆盖或侵入病原菌的菌落，抑制病原菌生长，使接触的病原菌菌丝萎缩,C.aborig⁃inum Mü1w1c6布满整个培养皿;(2)C.aboriginum Mü1w1c6与禾谷镰刀菌接触后，两菌落先出现短暂的停滞生长，稍后内生菌恢复生长，覆盖病原菌菌落，占领全部或部分的营养空间;(3)C.aboriginum Mü1w1c6与禾顶囊壳接触后，两菌落均停止生长。
对峙培养过程中均未产生明显的抑菌带，说明可能未产生抗生素。
对照I同种病原菌菌落营养和空间的竞争力相同，菌落大小一致，与对照II相比抑制率为66.67%。
C.aboriginum Mü1w1c6对供试病原菌菌丝生长有不同程度的抑制作用，对照II长满皿时的抑制率见表1。与对照I相比除辣椒菌、围小丛壳、禾谷丝核菌、瓜果腐霉和齐整小核菌外其余均高于66.67%，其中对立枯丝核菌的抑制率达到100%。
立枯丝核菌、齐整小核菌和禾谷镰刀菌在对峙培养后期菌丝体出现明显的老化萎缩现象，立枯丝核菌的菌丝颜变浅；齐整小核菌和禾谷镰刀菌与C.aboriginum Mü1w1c6菌落接触后被覆盖的部分也有明显的颜变化，齐整小核菌菌落由白变为黄，禾谷镰刀菌由粉红变为鲜黄，而单独接种病原真菌的对照I和对照II则未观察到此类现象。
表1Choiromyces aboriginum Mü1w1c6对植物病原真菌菌丝生长的抑制率Table1Inhibition of mycelial growth of phytopathogenic fungi by Choiromyces aboriginum Mü1w1c6
病原真菌 Phytopathogenic fungus
菌落相向
半径
Colony
radius of
pathogen(cm)
菌丝生长
抑制率∗
Inhibition
of mycelial
growth(%)
病原真菌 流氓猫
Phytopathogenic
fungus
菌落相向
半径
Colony
radius of
pathogen(cm)
菌丝生长
抑制率∗
Inhibition
of mycelial
growth(%)
Botrytis cinerea0.50±0.1788.89±3.85Pythium aphanidermatum2.67±0.1540.74±3.39
Colletotrichum capsici0.68±0.0861.48±2.57Rhizoctonia cerealis1.73±0.6155.56±3.85 Fusarium graminearum1.23±0.0672.59±1.28R.solani0.00±0.00100.00±0.00
注:∗为3次重复的平均值；对照II长满培养皿时计算抑制率。抑制率(%)=[(R0′-R b)/R0′]×100。Note:∗Mean of three replicates;inhibition percentage was calculated when pathogenic colony reach the margin of the dish in control II.Inhibition percentage(%)= [(R0′-R b)/R0′]×100.
2.2对峙培养的显微观察结果
观察结果显示,C.aboriginum Mü1w1c6(Ca)菌丝能够缠绕立枯丝核菌(Rs)的菌丝(图1-A)和瓜果腐霉(Pa)的菌丝(图1-B、C)。由于C.abo⁃
901
2期曹荣花等：芦苇内生真菌Choiromyces aboriginum Mü1w1c6的拮抗作用及其生物防治潜力
图1Choiromyces aboriginum Mü1w1c6对病原真菌重寄生作用的显微照片
Fig.1Micrographs of mycoparasitism between Choiromyces aboriginum Mü1w1c6and pathogenic fungi
注:A 和B:C.aboriginum Mü1w1c6与病原菌互作的光学显微照片。C 和D:C.aboriginum Mü1w1c6与病原菌互作的透射电镜照片。E 和F:C.aboriginum Mü1w1c6与病原菌互作的扫描电镜照片。Note:A and B:Light micrographs of interactions between C.aboriginum Mü1w1c6and pathogens.C and D:Transmission electron micrographs of interactions between C.aboriginum Mü1w1c6and pathogens.E and F:Scanning electron micrographs of interactions between C.aboriginum Mü1w1c6and pathogens.
riginum Mü1w1c6(Ca)菌丝紧贴瓜果腐霉(Pa)的菌丝最终导致畸形(图1-D )。C.aboriginum Mü1w1c6(Ca)菌丝还紧贴灰葡萄孢(Bc)的菌丝生长(图1-E)，并贴紧压着齐整小核菌(Sr)的菌丝生长(图1-F)。总之，芦苇内生菌C.aboriginum
Mü1w1c6的菌丝可紧贴或缠绕着病原真菌菌丝生
长，且缠绕现象极为普遍，说明具有明显的重寄生作用。
2.3C.aboriginum Mü1w1c6抑制瓜果腐霉对黄瓜的侵染
内生菌C.aboriginum Mü1w1c6对瓜果腐霉侵染黄瓜根部抑制作用的光学显微照片见图2。单独接种C.aboriginum Mü1w1c648h (图2-A)或瓜果腐霉6~8h (图2-C、D)，二者均有不同程度的侵染；预先48h 接种内生菌C.aboriginum Mü1w1c6，再挑战接种瓜果腐霉,6h 后侵染部位仅局限于根部的表皮细胞(图2-B)；未接种内生菌时，瓜果腐霉侵染6h，即可顺利侵入皮层内部细胞(图2-C)，侵染8h，部分瓜果腐霉菌丝侵入到维管束(图2-D)。表明预先接种C.aboriginum Mü1w1c6能有效抑制瓜果腐霉在黄瓜根部组织细胞内的扩展和定殖。2.4C.aboriginum Mü1w1c6在黄瓜根部侵染和定殖的电镜观察结果
C.aboriginum Mü1w1c6菌丝从相邻表皮细胞间侵入(图3-A)或直接侵入(图3-B)黄瓜根部。在根表形成很多双叉状分支，继而分支迅速增多，在根表形成网状结构(图3-C)。透射电镜观察到,C.aboriginum Mü1w1c6菌丝多在表皮细胞内定殖(图3-D)，并且也能够定殖于黄瓜根的外部皮层细胞。病原菌瓜果腐霉菌丝侵染定殖部位主要在寄主植物细胞内，同时也可在细胞间隙扩展。菌丝最常见的侵染方式是直接穿透寄主表皮或皮层细胞(图3-E)。
2.5在温室条件下C.aboriginum Mü1w1c6防治黄瓜猝倒病的效果
接种病原菌第2天，黄瓜幼苗开始发病并出现猝倒症状，接种6天病情不再发展，发病株全部死亡。T1和T2发病率分别为39.68%和16.67%，而未接种内生菌，只接种病原菌的对照发病率高达89.63%。T1的防治效果为44.29%,T2为88.49%,T2的防治效果明显高于T1(图4)。经LSD 检验,T1、T2与对照在P =0.01水平差异极显著。0
11植 物 保 护 学 报35卷
图2Choiromyces aboriginum Mü1w1c6与病原菌在黄瓜根部的互作
Fig.2Light micrographs of interactions between Choiromyces aboriginum Mü1w1c6or pathogens in cucumber
root
图3Choiromyces aboriginum Mü1w1c6和瓜果腐霉在黄瓜根表或内部侵染的电子显微镜照片
Fig.3Electron micrographs of cucumber root infected by Choiromyces aboriginum Mü1w1c6and Pythium aphanidermatum in vivo 注:A、B和C：扫描电镜照片。D和E：透射电镜照片。Note:A,B and C:Scanning electron micrographs.D and E:Transmission
electron micrographs.
3讨论
长期以来，植物病害的防治主要靠化学药剂，由于病菌抗药性的产生，其防效大幅度下降，并且严重污染农产品和环境，危及人畜健康，因此筛选和利用有益微生物防治植物病害是解决问题的有效途径。国内外有关有益真菌的研究主要有木霉Trichoder⁃ma spp.、毛壳菌Chaetomium spp.、寡雄腐霉Pythi⁃um oligandrum、无致病力的镰刀菌Fusarium oxyspo⁃rum Fo47、蜡蚧轮枝孢Verticillium lecanii、双核丝核菌Rhizoctonia(BNR)、假丝酵母Candida oleophila和季蒙毕赤酵母Pichillae guilliermondii等[11]。
111
2期曹荣花等：芦苇内生真菌Choiromyces aboriginum Mü1w1c6的拮抗作用及其生物防治潜力
图4Choiromyces aboriginum Mü1w1c6
对黄瓜猝倒病的生物防治
Fig.4Biocontrol of Pythium damping⁃off of cucumber
by Choiromyces aboriginum Mü1w1c6
移动电池 注:T1：接种一次内生菌;T2：接种两次内生菌;CK：不接种内生菌。Note:T1:Inoculation once with endophytic fungus;T2: inoculation twice with endophytic fungus;CK:inoculation without endophytic fungus.
平板对峙培养检测结果表明,C.aboriginum Mü1w1c6能拮抗多种植物病原真菌，其中主要观察到重寄生作用和竞争作用。C.aboriginum Mü1w1c6有较强的营养和空间的竞争能力，同时它能够与多种植物病原真菌，包括卵菌瓜果腐霉的菌丝贴生、缠绕、最终侵入菌丝内部，使之畸形或部分降解，这说明可能存在几丁质酶、纤维素酶和β⁃1,3-葡聚糖酶等细胞壁降解酶参与重寄生过程，这些酶的产生在其重寄生中的作用机制有待进一步研究。
黄瓜苗期猝倒病发展迅速，在子叶尚未凋萎前幼苗即猝倒，民间俗称“掐脖子”病，苗床开始仅见个别幼苗发病，几天后蔓延发展，最后成片倒伏，危害非常严重。本研究发现分离自健康芦苇植株的内生真菌C.aboriginum Mü1w1c6对黄瓜猝倒病有较好的防治效果，且处理两次的防治效果明显高于处理一次的防治效果。C.aboriginum Mü1w1c6在植物体内定殖后，占据了有利的生态位点，从而阻止病原菌的入侵，使瓜果腐霉局限在皮层细胞中扩展。这说明两次接种C.aboriginum Mü1w1c6能增强其阻止病原菌侵染的能力，从而对黄瓜猝倒病的防病效果大幅提高。据报道，内生菌在植物体内定殖后不仅能够分泌抗菌物质，抑制病菌生长，还能诱导植物体内防御基因的表达，降低发病率[12]。C.aborigi⁃num Mü1w1c6阻止瓜果腐霉侵染和有效防治黄瓜苗期猝倒病的机制有待深入研究。
生防菌田间应用往往由于各种环境因素的影响防病效果不稳定。芦苇内生真菌C.aboriginum Mü1w1c6显示出良好的环境稳定性，侵染定殖能力强,48h即可在植物体内侵染定殖，迅速占领植物根际的营养和空间。在温室防治黄瓜猝倒病的过程中，防治效果高达88.49%，接种病原菌6天后发病情况基本稳定，显示出C.aboriginum Mü1w1c6具有较好的生防潜力和应用前景。
参考文献(References)
[1]Al⁃Sa’di A M,Drenth A,Deadman M L,et al.Molecular characterization and pathogenicity of Pythium species associated with damping⁃off in greenhouse cucumber(Cucumis sativus)in Oman.Plant Pathology,2007,56(1):140-149
[2]Vazquez⁃Garciduenas S,Leal⁃Morales C A,Herrera⁃Estrella
A.Analysis of theβ⁃1,3⁃glucanolytic system of the biocontrol agent Trichoderma harzianum.Applied of Environmental Micro⁃biology,1998,64(4):1442-1446
[3]Weindling R.Trichoderma lignorum a parasite of other soil fun⁃gi.Phytopathology,1932,22:837-845
[4]Harman G E,Howell C R,Viterbo A,et al.Trichoderma spe⁃cies⁃opportunistic avirulent plant symbionts.Nature Reviews Microbiology,2004,2(1):43-56
[5]Wells H D,Bell D K,Jaworski C A.Efficacy of Trichoderma
harzianum as a biocontrol for Sclerotium rolfsii.Phytopathology, 1972,62(4):442-447
[6]Wirsel S G R,Leibinger W,Ernst M,et al.Genetic diversity of fungi closely associated with common reed.New Phytologist, 2001,149(3):589-598
[7]Neubert K,Mendgen K,Brinkmann H,et al.Only a few fun⁃gal species dominate highly diverse mycofloras associated with the common reed.Applied and Environmental Microbiology, 2006,72(2):1118-1128
[8]Gao K X,Liu X G,Liu Y H,et al.Potential of Trichoderma
harzianum and T.atroviride to control Botryosphaeria berengeri⁃ana f.sp.piricola,the cause of apple ring rot.Journal of Phy⁃topathology,2002,150(4/5):271-276
[9]Gao K,Mendgen K.Seed⁃transmitted beneficial endophytic
Stagonospora sp.can penetrate the walls of the root epidermis, but does not proliferate in the cortex,of Phragmites australis. Canadian Journal of Botany,2006,84(6):981-988 [10]Poromarto S H,Nelson B D,Freeman T P.Association of binu⁃
cleate Rhizoctonia with soybeen and mechanism of biocontrol of Rhizoctonia solani.Phytopathology,1998,88(10):1056-1067 [11]高克祥.内生真菌Chaetomium spirale,Stagonospora sp.与
病原菌、寄主植物相互作用的机制.北京：中国学术期刊(光盘版)电子杂志社，中国优秀博硕士学位论文全文数据库,2006,5(2)任务查询
[12]邱思鑫，何红，阮宏椿，等.内生芽孢杆菌TB2防治辣椒疫
病效果及机理初探.植物病理学报,2004,34(2):173-179
211植 物 保 护 学 报35卷
