·论著·
ｈａｓ－ｍ
吴德刚 骆慧 范立刚 王颖毅 韩斌 尤永平 刘宁
【摘要】 目的 构建靶向ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ基因的慢病毒表达载体。方法 根据ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ序列设计互补的单链寡核苷酸引物序列进行退火延伸后连入经双酶切的ｐＧＣＳＩＬ－ＧＦＰ载体质粒，与辅助元件载体质粒ｐＨｅｌｐｅｒ １．０及ｐＨｅｌｐｅｒ ２．０共同导入感受态细胞Ｔ２９３进行慢病毒包装，收集、浓缩并测定病毒滴度。用所得病毒转染Ｕ８７胶质瘤细胞；实时定量ＰＣＲ检测转染后ｍｉＲ－１８１ｂ表达，流式细胞术检测细胞凋亡以及Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验评价细胞侵袭能力的改变。结果 目的序列成功连接 入载体，测序分析证实目的序列载体构建成功，并测得病毒滴度为６×１０９ ＴＵ／ｍｌ；病毒转染Ｕ８７胶质瘤细胞能够显著上调ｈａｓ－ｍｉＲ－
１８１ｂ表达，该病毒载体能够有效诱导胶质瘤细胞凋亡，显著抑制Ｕ８７细胞的侵袭性。结论 成功建立高效稳定表达ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ的慢病毒转染系统，体外实验中能够有效诱导Ｕ８７
胶质瘤细胞凋亡，
并且可以抑制胶质瘤的侵袭能力。【关键词】 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－
１８１ｂ；慢病毒表达载体【中图分类号】 Ｒ７３０ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 ０２５３－３６８５（２０１２）１０－１１１７－０４Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ ＷＵ Ｄｅｇａｎｇ，ＬＵＯ Ｈｕｉ，ＦＡＮ Ｌｉｇａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ ＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００２９，ＣＨＩＮＡ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ
ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｗｏ ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ
ｏｌｉｇｏｓ ｏｆ ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＧＣＳＩＬ－ＧＦＰｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ
ｍｉｘ ｉｎｔｏ Ｔ２９３ｃｅｌｌｓ ａｎｄｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｔｏｃｋ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ－ｉｎｆｅｃｔｅｄＵ８７ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ
ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｕ８７ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｂｙ
ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｗｈｉｃｈ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｈｅ ｃｏｒｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ．Ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂｗａｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔ２９３ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，
ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｆｏｒ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ ｗａｓ ６×１０９ ＴＵ／ｍｌ．Ｔｈｅ ｈａｓ－ｍｉＲ－
１８１ｂｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂｃｏｕｌｄ ｌｅａｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｐｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ Ｕ８７ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂｈａｓ ｂｅｅｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ
ｉｎｄｕｃｅ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ Ｕ８７ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．【Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ】 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１８１ｂ；Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ［Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｍａｙ
２０１２，３８（１０）：１１１７－１１２０．］ 基金项目：
国家自然科学基金（８１１７２３８９、８１１０１９０１）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１０５８０、ＢＫ２０１１８４７
）；江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者单位：２１００２９ 江苏省，南京医科大学第一附属医院神经外科
通讯作者：刘宁 Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｎｉｎｇ
０８５３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ｍｉＲＮＡ是一类内源性非编码ＲＮＡ，长约２２－
２４ｎｔ，在精细调控基因表达及生物生长发育过程方面发挥着重要作用。研究发现５０％以上的ｍｉＲＮＡ定位在肿瘤相关基因组区域，通过多种分子机制广
泛参与肿瘤的发生发展［
１］
。我们前期研究发现ｍｉＲ－
１８１ｂ在高级别胶质瘤细胞中表达明显下调，且其表达水平与胶质瘤级别呈负相关，推测其可能是与胶质瘤发生发展关系密切的ｍｉＲＮＡ。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染体上，从而达到持久性表达，
对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，是进行ｍｉＲＮＡ功能及机制研究的理想载体。为了研究ｍｉＲ－１８１ｂ在胶质瘤发生发展中的作用及其作为基因靶点的可能性，我们构建了靶向ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ基因的慢病毒表达载体，并初步探讨其对胶质瘤细胞凋亡、侵袭性的影响。
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７１１１·江苏医药２０１２年５月第３８卷第１０期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｍａｙ ２０１２，Ｖｏｌ ３８，Ｎｏ．１０
材料与方法
一、材料
Ｔ２９３细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。Ｕ８７胶质瘤细胞系由上海华山医院神经外科朱剑虹教授惠赠。ｐＧＣＳＩＬ－ＧＦＰ载体质粒、辅助载体ｐＨｅｌｐｅｒ １．０和ｐＨｅｌｐｅｒ ２．０质粒购自上海吉凯公司。限制性内切酶ＡｇｅＩ和ＥｃｏＲＩ购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ公司。质粒抽提试剂盒购自ＱＩＡＮＧＥＮ公司。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００购自上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。Ｐｌｕｓ－２０离心超滤装置购自ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ公司。一步法ＭｉｃｒｏＲＮＡｏｕｔ购自北京ＴＩＡＮＤＺ公司；ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂＴａｑＭａｎ?ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ、Ｕ６ＴａｑＭａｎ?ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ及ＴａｑＭａｎ?ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ和ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ购自ＡＢＩ公司；７３００ＨＴ荧光定量ＰＣＲ仪购自美国ＡＢＩ公司。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＡＰＣ／ＰＩ试剂盒购自美国Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ公司。
二、方法
１．ＰＣＲ扩增目的片段 通过Ｓａｎｇｅｒ获得ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ序列，应用设计软件设计包含目的片段、保护碱基和分别含有Ａｇｅ Ｉ和ＥｃｏＲＩ酶切位点的上下游引物，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。上游引物：ＡＣＣＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴ－ＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＴＧＣＴＧＴＣＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＴ－ＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＴＣ；下游引物：ＡＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴ－ＧＴＴＴＧＧＴＣＣＧＣＡＧＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡ－ＧＴＧＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＣＣ。以人基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，反应条件：９４℃预变性３０ｓ，９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，
２０个循环。纯化并回收ＰＣＲ产物。
２．重组慢病毒表达载体的构建 上述ＰＣＲ产物和ｐＧＣＳＩＬ－ＧＦＰ载体质粒分别进行Ａｇｅ Ｉ和Ｅｃｏ ＲＩ双酶切及回收纯化，两者产物１６℃连接过夜，所得载体转化ＤＨ５ａ感受态细菌，筛选阳性克隆，送上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。
３．质粒及转染液准备 测序无误的ｐＧＣＳＩＬ－ｍｉＲ－１８１ｂ载体质粒、ｐＨｅｌｐｅｒ １．０和２．０载体质粒分别进行高纯度无内毒素抽提，紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒ＤＮＡ的Ａ２６０／Ａ２８０在１．８－２．０之间，ＤＮＡ浓度在５００ｎｇ／μｌ以上。转染液包括Ａ、Ｂ两部分，液体Ａ：ｐＧＣＳＩＬ－ｍｉＲ－１８１ｂ载体２０μｇ，ｐＨｅｌｐｅｒ １．０载体１５μｇ，ｐＨｅｌｐｅｒ ２．０载体１０μｇ，加入无血清ＤＭＥＭ培养基至总体积２．５ｍｌ，充分混匀，室温孵育５ｍｉｎ；液体Ｂ：１００μｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００与２．４ｍｌ无血清ＤＭＥＭ培养基混合，室温孵育５ｍｉｎ。混匀Ａ、Ｂ溶液，室温孵育２０ｍｉｎ，使转染复合物形成。
４．慢病毒包装 转染前２４ｈ，用胰蛋白酶消化对数生长期的Ｔ２９３细胞，以含１０％胎牛血清的培养基调整细胞密度为１．２×１０７细胞／２０ｍｌ，重新接种于１５ｃｍ细胞培养皿培养至细胞密度达７０％－８０％时进行转染。转染前２ｈ将细胞培养基更换为无血清培养基。加入转染液培
养８ｈ后换用ＤＭＥＭ培养基，继续培养至转染后４８ｈ。收集细胞上清液，于４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，除去细胞碎片。使用Ｐｌｕｓ－２０离心超滤装置浓缩样品得到病毒浓缩液，－８０℃长期保存。
５．病毒滴度测定 使用逐孔稀释滴度测定法，ＤＭＥＭ培养基重悬Ｔ２９３细胞至４×１０５细胞／ｍｌ，９６孔板中每孔加入细胞悬液１００μｌ。待测病毒原液１０μｌ用无血清ＤＭＥＭ培养基１０倍体积稀释７次后加入９６孔板中，培养２４ｈ后更换为完全培养基，继续培养７２ｈ后观察荧光表达情况。病毒滴度＝带有荧光的细胞数／加入的病毒原液量。
６．慢病毒转染Ｕ８７胶质瘤细胞 于６孔培养板中接种５×１０５细胞／孔，含双抗和１０％胎牛血清ＤＭＥＭ培养基培养，细胞融合率达到６０％－７０％时加入浓缩病毒１０μｌ／孔，转染空载慢病毒载体的Ｕ８７胶质瘤细胞为阴性对照，未加任何处理的作为空白对照，荧光显微镜观察感染效率。
７．实时定量ＰＣＲ检测ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ 取转染慢病毒后５ｄ后Ｕ８７胶质瘤细胞、空白对照细胞及阴性对照细胞，按照说明书中步骤提取ｍｉＲＮＡ，使用ＡＢＩ公司的ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆转录试剂盒进行逆转录，具体操作及条件按说明书进行。逆转录所得ｃＤＮＡ １．３３μｌ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ或Ｕ６ ２０×Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ １μｌ、ＴａｑＭａ
ｎ ２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ １０μｌ、去ＲＮＡ酶水７．６７μｌ体系进行ＰＣＲ扩增，反应条件：９５℃１０ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，６０℃１ｍｉｎ，４０个循环。ＡＢＩ ７３００系统软件分析基因扩增情况，记录相应Ｃｔ值，以Ｕ６为内参校正，每组设３个复孔。基因相对表达量采用２－ΔΔＣｔ方法计算。
８．细胞凋亡检测 用胰酶消化转染４８ｈ后的Ｕ８７细胞成单细胞悬液并收集，磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗涤２次，１×Ａｎｎｅｘｉｎ结合缓冲液５００μｌ重悬，充分吹打，使细胞密度约为１×１０６／ｍｌ。加入
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５μｌ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ和１００μｇ／ｍｌ的ＰＩ １μｌ，轻轻混匀室温孵育１５ｍｉｎ，１ｈ内上流式细胞仪分析细胞凋亡率。
９．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ试验检测Ｕ８７细胞侵袭力 转染４８ｈ后的Ｕ８７细胞用无血清培养基洗３次。消化后重悬于含０．１％胎牛血清培养基中，取５×１０６／ｍｌ细胞１００μｌ加入至已铺Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的８μｍ孔径Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室（美国Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ公司）的上室，６００μｌ ２０％胎牛血清培养基加入下室。３７℃、５％ＣＯ２培养２４ｈ后，取出Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室，棉球擦去上表面细胞，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ。０．１％结晶紫染３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗２遍，随机取３个视野，倒置显微镜下（×１００）观察，计数每个视野内的穿过微孔的细胞数。
三、统计学处理
采用ＳＰＳＳ １３．０进行统计分析，两组间比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结果
一、慢病毒载体的构建
合成的正向和反向片段溶解于灭菌水中混合，退火反应所得双链与经Ａｇｅ Ｉ／Ｅｃｏ ＲＩ酶切并纯化的ｐＧＣＳＩＬ－ＧＦＰ载体质粒连接。ＰＣＲ所得反应产物为１０９ｂｐ（图１），经酶切并纯化后进行电泳鉴定，绝大部分质粒与插入片段连接成功。含有目的片段的重组质粒经测序鉴定，结果与设计序列核对完全相符。
二、慢病毒滴度测定
本实验中测得慢病毒滴度为６×１０９ ＴＵ／ｍｌ。
三、慢病毒转染Ｕ８７细胞
转染Ｕ８７胶质瘤细胞４８ｈ后目的基因表达量逐渐达到顶峰，荧光显微镜观察培养细胞可见大量的绿荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达（图１）。
四、实时定量ＰＣＲ检测ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ表达
实时定量ＰＣＲ检测转染慢病毒后的Ｕ８７细胞ｍｉＲ－１８１ｂ的表达较空白对照及阴性对照细胞明显上调，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）（图２）。
五、细胞凋亡检测
转染慢病毒４８ｈ后的Ｕ８７细胞出现明显凋亡，凋亡率为（１１．８０±２．９８）％，空白对照细胞及阴性对照细胞均无明显凋亡（Ｐ＜０．０５）。
六、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验分析转染后细胞侵袭能力的改变
在Ｕ８７中，转染慢病毒后，细胞穿过滤膜数
目
注：１ ＰＣＲ产物
图１ ＰＣＲ
产物琼脂糖凝胶电泳图谱
与空白对照组和阴性对照组比较，ａＰ＜０．０１
图２ ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ在慢病毒转染后的Ｕ８７细胞
及阴性对照细胞中的表达水平
为（５３．１４±１７．３４）个，而空白对照组为（１２３．４７±１８．８９）个，阴性对照组为（１１５．５６±２０．３７）个；转染慢病毒组穿过滤膜细胞数目较空白对照组和阴性对照组的明显减少（Ｐ＜０．０５），而空白对照组与阴性对照组之间的差异无统计学意义。
讨论
ｍｉＲ－１８１家族包括ｍｉＲ－１８１ａ－１、ｍｉＲ－１８１ａ－２、ｍｉＲ－１８１ｂ－１、ｍｉＲ－１８１ｂ－２、ｍｉＲ－１８１ｃ和ｍｉＲ－１８１ｄ。在小鼠发育过程中，ｍｉＲ－１８１家族表达于骨髓未分化的造血祖细胞中，在已分化的各系细胞中与之相比较低［２］；脑组织中ｍｉＲ－１８１家族在胎儿和出生后早期阶段呈低表达，而成年后表达则显著升高［３］。
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同时，ｍｉＲ－１８１还参与骨骼肌的分化和原始胚胎血管内皮细胞的分化调节［４－６］。Ｗａｎｇ等［７］发现在肝癌细胞中ｍｉＲ－１８１ｂ表达上调，并通过靶向调节肿瘤抑制基因ＴＩＭＰ３、参与ＴＧＦ－β信号通路及增强ＭＭＰ－２和ＭＭＰ－９的活性促进肝癌细胞的存活和侵袭。
在胶质瘤中ｍｉＲ－１８１ａ和ｍｉＲ－１８１ｂ呈低表达。Ｃｉａｆｒｅ等［８］通过胶质瘤肿瘤组织样本及胶质瘤细胞系中共２４５种ｍｉＲＮＡ进行微阵列检测分析发现胶质瘤中ｍｉＲ－１８１家族表达下调，其中以ｍｉＲ－１８１ａ和ｍｉＲ－１８１ｂ最为显著。我们前期研究发现，ｍｉＲ－１８１ａ与ｍｉＲ－１８１ｂ在高级别胶质瘤细胞中表达明显下调，在胶质瘤细胞Ｕ８７、Ｕ２５１和ＴＪ９０５中转染ｍｉＲ－１８１ａ和ｍｉＲ－１８１ｂ寡聚核苷酸上调ｍｉＲ－１８１ａ和ｍ
ｉＲ－１８１ｂ表达，能够有效抑制胶质瘤细胞侵袭能力，诱导其凋亡［９］。过表达ｍｉＲ－１８１ｂ形成的克隆数较过表达ｍｉＲ－１８１ａ更少，其抑制胶质瘤细胞的转化能力效应亦较后者更为明显，ｍｉＲ－１８１ｂ诱导凋亡效果亦较ｍｉＲ－１８１ａ更为明显。我们推测，ｍｉＲ－１８１ａ和ｍｉＲ－１８１ｂ可能与人类脑细胞发育分化密切相关，参与胶质瘤细胞未分化状态形成或维持，其中ｍｉＲ－１８１ｂ较ｍｉＲ－１８１ａ在胶质瘤发生发展中的生物学作用更为重要。
慢病毒是逆转录病毒的亚科之一，其最大特点在于可同时感染分裂期及非分裂期细胞，并可在体内长期稳定表达，安全性较好，应用范围较逆转录病毒和腺病毒体系更广，是目前基因中研究较为广泛的载体，对包括神经元细胞［１０］、心肌细胞［１１］等多种类型的细胞具有基因的应用前景。
本实验采用分子克隆技术，构建靶向ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ基因的慢病毒表达载体时的插入序列不仅包含Ｓａｎｇｅｒ数据库列出的成熟体ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ的序列，还包含茎环结构及１００－２００ｂｐ长的两端侧翼序列，使表达出的ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ生理活动尽可能接近天然状态，有利于ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ在运输蛋白作用下从细胞核进入细胞质，在Ｄｉｃｅｒ等相关蛋白作用下得到成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ从而发挥生物学作用。重组病毒生产时采用多质粒包装系统，具有更好的生物安全性和有效性。
本实验成功构建了ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ慢病毒表达载体，经ＰＣＲ鉴定、ＤＮＡ测序证明符合设计要求，并获得了可供转染的滴度，而且在感染细胞后能显著升高ｍｉＲ－１８１ｂ在细胞内的表达。在体外实验中，ｈａｓ－ｍｉＲ－１８１ｂ慢病毒表达载体可以促进Ｕ８７细胞的凋亡以及抑制胶质瘤细胞的侵袭性。为进一步研究ｍｉＲ－１８１ｂ在胶质瘤发生发展中的作用及其机制，探索以ｍｉＲ－１８１ｂ为靶点的基因等后续研究奠定了基础。
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［１０］ Ｃａｏ Ｓ，Ｗｕ Ｃ，Ｙａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓＴＮＦＲ－Ｆｃ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏＡＩＤＳ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍ－
ｍａｔｉｏｎ，２０１１，８：４８．
［１１］ Ｓｅｋａｒ ＲＢ，Ｋｉｚａｎａ Ｅ，Ｓｍｉｔｈ ＲＲ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＦＰ ｏｒ Ｋｉｒ２．１ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏ－
ｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７，２９３（５）：
Ｈ２７５７－Ｈ２７７０．
（收稿日期：２０１１－１２－０５）（供稿编辑：王瑶）
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·江苏医药２０１２年５月第３８卷第１０期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｍａｙ ２０１２，Ｖ
ｏｌ ３８，Ｎｏ．１０
