AKK菌在制备抗肝中毒的药物中的应用

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akk菌在制备抗肝中毒的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及akk菌在制备抗肝中毒的药物中的应用。

背景技术：

2.肝脏是人体以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面充分扮演着氧化还原、储存肝糖，分泌性蛋白质的合成等等，是生物转化的主要场所。肝脏疾病是影响人类健康的最为常见的疾病之一。各种有害因素导致的肝损伤主要有病毒性肝损伤、酒精性肝损伤、免疫性肝损伤和药物性肝损伤等类型。其中药物性肝损伤是由药物或其代谢物诱发的不良反应，可能导致肝坏死、胆汁郁积、肝纤维化、肝硬化以及肝癌等。药物性肝损伤包括广泛的临床表现，也包含肝功能检查中的肝功能指标异常的无症状表现。
3.精神分裂症是一种复杂的重性精神疾病，包括阳性(例如幻觉和妄想)和阴性(例如消极和失语)症状，影响着世界近1％的人口，是全球十大致残原因之一。抗精神病药物主要用于精神分裂症和其他精神疾病。奥氮平是使用最广泛的非典型抗精神病药物之一，目前用于精神分裂症和双相情感障碍。奥氮平能拮抗多巴胺受体、5-羟胺受体和胆碱能受体，其对多巴胺受体的拮抗作用与其精神分裂症的阳性症状有关，对5-羟胺受体的拮抗作用与其精神分裂症的阴性症状有关。然而，奥氮平存在肝毒性。据报道，长期服用奥氮平的患者中有10％至50％出现肝功能异常。服用奥氮平的患者血清转氨酶水平明显升高，引起的各种肝脏生化和组织学改变，临床表现为血脂异常、脂肪肝、胆汁淤积性损伤、细胞性肝炎、肝炎伴黄疸等等。并且随着奥氮平使用的次数和时间增加、常见的精神疾病和代谢障碍的并存和精神病患者的多药联用，奥氮平所致药物性肝损伤的发病率也大大增加了。奥氮平导致的药物性肝损伤机制主要包括药物及其代谢产物不良的副作用、肝脏氧化应激、炎症和脂肪变性。这些肝损伤副作用会使精神分裂症患者的依从性和生活质量下降，死亡率升高。由此可见，如何有效对奥氮平所致肝毒性进行诊治显得尤为重要。
4.大多数的抗精神病药物经过p450酶代谢。奥氮平主要通过cyp1a2酶代谢，部分经过cyp2d6、cyp3a4酶代谢。细胞素p450超家族同功酶的表达受遗传多态性、外源性、细胞因子和激素以及性别和年龄的影响。pgrmc1是一种膜相关孕激素，在生理条件下优先与各种类固醇结合，发挥多种生物学功能，如甾醇合成、损伤修复、药物和激素代谢、凋亡抑制和胆固醇调节，主要在人体肝脏和肾脏中表达，通常它与细胞素p450超家族酶共同存在于于光滑的内质网表面。位于内质网膜上的pgrmc1蛋白可以直接相互作用形成同源和异源二聚体；pgrmc1单体和二聚体可以与细胞素p450超家族酶产生相互作用，通过参与血红素稳态的调控、血铁平衡的调控和细胞素基因表达的转录调控影响细胞素p450超家族同功酶的功能。此外，pgrmc1还参与多种信号通路介导的脂质代谢调节。因此，我们猜测pgrmc1可以介导奥氮平诱导的肝毒性，在此基础上，我们进行了分子对接实验及表面等离子体共振实验，均证实奥氮平与pgrmc1的结合力远大于内源性配体孕酮。ppar-γ是一类配体激活的核转录因子。ppar-γ可以与多种蛋白相互作用，通过调节基因转录和翻译等生物
学效应参与脂质代谢、细胞增殖、分化和凋亡、炎症反应、氧化应激等。β-catenin是一种胞内糖蛋白，在成人肝脏中表达，具有双重功能。一是作为附着连接的组成部分，与钙黏蛋白结合形成复合体参与细胞间连接；二是作为信号分子，是wnt信号途径的重要环节，在胚胎发育和肿瘤发生中起重要作用。β-catenin的表达与肝脏疾病密切相关。β-catenin可以调控葡萄糖、营养物质和外源物质代谢，其活性的改变可能有助于非酒精性脂肪性肝炎的发病。β-catenin信号的改变也会导致肝星状细胞的激活，这会导致肝纤维化。许多肝脏肿瘤细胞存在ctnnb1基因突变，这会导致β-catenin激活。因此合理推测pgrmc1/ppar-γ/β-catenin是奥氮平引起的肝毒性的潜在靶点。
5.目前，临床上只能选择在奥氮平给药诱导产生药物性肝损伤后，再进行对症性的使用已知护肝药物(如水飞蓟宾)，来改善相应的肝功能指标是否改善，尚未发现能够且预防抗精神病类药物引起的肝损伤的药物。akk菌是从人体肠道中分离出来的一种椭圆形革兰阴性菌，主要是在肠道黏液层中进行增殖。aak菌在多种病理环境下可以发挥积极有益的作用，有十分广泛的药理活性。目前未见将akk菌用于抑制抗精神病药物所致肝毒性的报道。

技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了akk菌或其培养物在制备预防、改善和/或肝损伤的药物中的应用。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.akk菌或其培养物在制备预防、改善和/或肝损伤的药物中的应用。
9.本发明中，所述肝损伤为抗精神病药引起的化学性肝损伤。具体的，所述抗精神病药物包括奥氮平、氯氮平、阿立哌唑、利培酮、喹硫平、氨磺必利，舒必利，齐拉西酮中的至少一种。
10.本发明首次研究发现，akk可以改善长期使用抗精神病药物(如奥氮平所致的肝脏脂肪蓄积、变性和氧化应激损伤，阐明了其机制是通过pgrmc1/ppar-γ/β-catenin通路所介导的。
11.本发明中，给予akk菌的具体形式不作具体限定，可以是单独的akk菌，也可以是根据本领域制备制剂的常规方法制成的各种剂型的药物；也可以与其他药物组合使用，如将akk菌与益生元制成复方制剂；还可以多种药物配伍使用，如将akk菌、益生元、抗精神病药物以一定比例制成复方制剂。
12.本发明中，给予akk菌的时机包括在给予抗精神病药物之前、之后或同时给予。在给予抗精神病药物之前或同时给予时可预防肝损伤；所述akk菌在给予抗精神病药物之后给予可以改善和/或肝损伤。
13.一些实施方案中，预防、改善和/或肝损伤的药物中，抗精神病药物的剂量为8mg/kg/d，akk菌的给药量为1.5
×
108cfu/kg/d。
14.本发明中，所述肝损伤包括肝脏中脂肪蓄积、脂肪变性和氧化应激损伤中的至少一种。
15.本发明中，所述预防、改善和/或肝损伤包括(1)～(3)中至少一种：
16.(1)调节pgrmc1的表达水平；
17.(2)上调pgrmc1、ppar-γ和/或β-catenin的表达；
18.(3)降低肝脏中tg、tc、nefa中至少一种物质的含量。
19.本发明提供的上述应用中，所述akk菌为活菌、灭活菌体、akk菌培养物、akk菌提取物中的至少一种。
20.本发明还提供一种预防、改善和/或肝损伤的药物，包含akk菌和药学上可接受的载体。其中，所述akk菌为活菌、灭活菌体、akk菌培养物、akk菌提取物中的至少一种。
21.本发明还提供一种预防、改善和长期使用抗精神病药物所致的肝损伤的方法，包括：在给予抗精神病药物的之前、之后或同时给予本发明所述的akk菌。
22.本发明研究发现，akk菌可以预防、改善和长期使用抗精神病药物(以奥氮平为代表)所致的肝脏脂肪蓄积、变性和氧化应激损伤，akk菌的预防作用不仅不会对患者的身体造成损害，还可以减轻经济负担，具有极大的临床应用价值。
附图说明
23.图1为实验流程图；
24.图2为分子对接实验的结果；
25.图3为表面等离子体共振实验结果,其中，a～g为不同抗精神病药物处理组的结果；
26.图4为组间微生物丰度差异结果；
27.图5为组间疣微菌门丰度差异结果；
28.图6为lefse分析图；
29.图7为组间不同分枝lda分数直方图；
30.图8为组间akk菌丰度差异结果：
31.图9为肝脏脂质代谢水平的结果，其中，a～c依次为tc、tg和nefa的表达水平；
32.图10为肝脏切片oro染图，其中，a～e为不同处理组的染结果，f为各组相对con组的百分比差异；
33.图11为肝脏切片he染图，a～e为不同处理组的染结果；
34.图12为b-gos对小鼠肝脏相关蛋白水平的影响，其中，a为westernblot检测结果，b～d为pgrmc1、ppar-γ、β-catenin的相对表达量结果。
35.图13为cck-8测定不同浓度奥氮平干预24h后l-02细胞活性(a)并测定不同浓度奥氮平对pgrmc1表达的影响(b)；
36.图14为akk菌液对l-02(a)和奥氮平处理后的l-02(b)细胞活性的影响；
37.图15为akk菌液对l-02细胞相关蛋白水平的影响，其中，a为westernblot检测结果，b～c为pgrmc1和β-catenin的相对表达量结果。
具体实施方式
38.本发明提供了akk菌在制备抗肝中毒的药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法
和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
39.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
40.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
41.实施例1
42.(一)实验材料和方法：
43.动物实验：6-8周龄的雄性c57bl/6j小鼠(spf级)购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于中南大学实验动物学部spf级别实验室，标准饲料和自由饮水适应性喂养一周后，开始实验。
44.实验设置对照组(给予生理盐水)、奥氮平组、奥氮平+低剂量b-gos组、奥氮平+中剂量b-gos组、奥氮平+高剂量b-gos组，每组8只小鼠。
45.a对照组:生理盐水；b奥氮平组:8mg/kg奥氮平；c奥氮平+低剂量b-gos组:8mg/kg奥氮平+0.5g/kg/d益生元；d奥氮平+中剂量b-gos组:8mg/kg奥氮平+1.5g/kg/d益生元；e奥氮平+高剂量b-gos组:8mg/kg奥氮平+2.5g/kg/d益生元。b-gos为益生元，成分为低聚半乳糖和麦芽糊精，是肠道微生物的养分，通过奥氮平给药，及联合补充益生元，一反一正的对肠道菌进行调节，目的为筛查并确定与奥氮平肝毒性密切关联的菌属种类。
46.评价肝脏毒性：
①
分离肝脏，用自动生化指标仪检测相关生化指标，包括总胆固醇(tc)，甘油三酯(tg)，游离脂肪酸(nefa)；做病理切片，he染检测肝脏组织病理改变。oro染检测肝脏组织脂质堆积情况；
②
肝脏组织提取总蛋白后用westernblot检测pgrmc1、ppar-γ、β-catenin蛋白的表达；
③
粪便用16srna技术测肠道微生物变化。实验流程图如图1所示。
47.细胞实验：人正常l02肝细胞株，自购于上海中桥新舟生物科技有限公司，本实验自行传代冻存备用。
48.通过cck-8实验测定不同奥氮平浓度干预l-02细胞的细胞活性，筛选后续实验的干预浓度。如图13所示，当奥氮平浓度为300μm时，细胞活性接近ic50。因需建立奥氮平所致肝细胞损伤模型，故确定300μm奥氮平作为后续实验干预浓度。
49.评价l-02细胞活性：
①
akk菌培养物上清液对l-02和奥氮平处理后的l-02细胞活性的影响；
②
收集akk菌培养物上清液处理的l-02细胞，用westernblot检测pgrmc1和β-catenin蛋白的表达。其中100％akk为104cfu/mlakk菌的培养物上清液。
50.(二)结果分析：
51.①
分子对接实验中可以看到，抗精神病药物的对接分数均比内源性配体孕酮低，且奥氮平最低；及表面等离子体共振实验所得浓度梯度结合曲线均证实抗精神病药物与pgrmc1的结合力》》内源性配体孕酮(见图2、3)；
52.①
奥氮平给药后会明显影响肠道菌丰度，造成奥氮平给药组小鼠肠道内疣微菌门的丰度显著低于生理盐水组；益生元b-gos联合用药可以逆转这个现象，并且随着b-gos剂量的增加，小鼠肠道内疣微菌门的丰度增加越明显(见图4、图5、图6)；
53.②
奥氮平给药显降低加小鼠肠道内akk菌的丰度；益生元b-gos联合用药可以逆转这个现象，并且随着b-gos剂量的增加，小鼠肠道内akk的丰度增加越明显(见图7、图8)；
54.③
奥氮平给药显著增加小鼠肝脏中tg、tc、nefa的含量，而补充益生元b-g0s可以抑制奥氮平所致的肝脏脂质水平异常，并且随着b-gos剂量的增加，还可以达到降脂的作用
(见图9)；
55.④
oro染：奥氮平给药明显增加肝脏脂质堆积，而补充不同剂量益生元b-gos可以在不同程度上减少奥氮平所致的肝脏脂质堆积现象；与con组相比，红脂肪染明显，差异具有统计学意义(p《0.05)。(见图10)；
56.⑤
he染：对照组中央静脉、汇管区周围及肝实质内均多见肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见体积微小的圆形空泡(见图11a)；奥氮平组中央静脉、汇管区周围及肝实质内均多见肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见体积微小的圆形空泡(见图11b)；奥氮平+低剂量b-gos组中央静脉、汇管区周围及肝实质内均多见肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见体积微小的圆形空泡(见图11c)；奥氮平+中剂量b-gos组肝实质内少量的肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见体积微小的圆形空泡(见图11d)；奥氮平+高剂量b-gos组肝实质内少量的肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见体积微小的圆形空泡；少见肝细胞呈气球样变，细胞肿胀，胞质疏松淡染(见图11e)；
57.⑥
动物westernblot检测：奥氮平给药后显著降低了pgrmc1、ppar-γ、β-catenin的表达；高剂量益生元组显著增加pgrmc1、ppar-γ、β-catenin的表达(见图12)；
58.⑦
细胞cck8实验：首先测试了奥氮平在不同浓度下对l-02细胞的抑制作用。结果表明，当奥氮平浓为300μm时，细胞活性接近ic50。因需建立奥氮平所致肝细胞损伤模型，故确定300μm奥氮平作为后续实验干预浓度(见图13)。同时，研究了akk菌培养物上清液在不同浓度下对l-02细胞活性的影响。结果表明，不同浓度的akk菌培养物上清液对l-02的细胞活性均有改善作用。进一步，采用了cck-8比法研究akk菌培养物上清液对奥氮平诱导的l-02细胞毒性的保护作用。奥氮平显著降低l-02的细胞存活率，为53％(p《0.05)。然而，添加akk菌培养物上清液后，存活率显著提高。且随着浓度的降低，akk菌的作用逐渐减弱(见图14)；
59.⑦
细胞westernblot检测：奥氮平给药后显著降低了pgrmc1和β-catenin的表达；高浓度akk菌培养物上清液组显著增加pgrmc1和β-catenin的表达(见图15)。分组设置为：未给药干预组(control)；300μm奥氮平组(olz)；0.2％akk+300μm奥氮平(akk-l)；100％akk+300μm奥氮平(akk-h)。
60.综上，奥氮平会引起小鼠发生一定程度的肝损，影响肠道菌的多样性，降低akk菌的丰度以及降低pgrmc1、ppar-γ、β-catenin的表达。而akk的减少是导致小鼠肝损的重要原因。通过益生元b-gos滋养提高akk菌可以通过上调pgrmc1、ppar-γ、β-catenin的表达以抑制奥氮平所致的肝脏异常脂质代谢和炎症反应而达到改善奥氮平所致肝毒性。为了进一步验证akk菌对奥氮平所致肝损的直接影响及分子机制，采用体外实验以奥氮平干预人源l-02肝细胞诱导肝脏损伤模型，通过直接给予不同浓度akk菌培养物上清液进一步探究奥氮平致肝脏脂毒性的分子机制。细胞实验再次证明奥氮平会降低l-02细胞活力，akk菌培养物上清液会抵御奥氮平的肝细胞毒性作用，并改善l-02细胞活力。因此，akk菌对奥氮平诱导的l-02细胞毒性具有保护作用。与动物实验结果一致，该保护作用也与pgrmc1和β-catenin有关。
61.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.akk菌在制备预防、改善和/或肝损伤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝损伤为抗精神病药引起的化学性肝损伤。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗精神病药物包括奥氮平、氯氮平、阿立哌唑、利培酮、喹硫平、氨磺必利、舒必利、齐拉西酮中的至少一种。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述akk菌在给予抗精神病药物之前或同时给予以预防肝损伤；所述akk菌在给予抗精神病药物之后给予以改善和/或肝损伤。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝损伤包括肝脏中脂肪蓄积、脂肪变性和氧化应激损伤中的至少一种。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防、改善和/或肝损伤包括(1)～(3)中至少一种：(1)调节pgrmc1的表达水平；(2)上调pgrmc1、ppar-γ和/或β-catenin的表达；(3)降低肝脏中tg、tc、nefa中至少一种物质的含量。7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述akk菌为活菌、灭活菌体、akk菌培养物、akk菌提取物中的至少一种。8.一种预防、改善和/或肝损伤的药物，其特征在于，包含akk菌和药学上可接受的载体。9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述akk菌为活菌、灭活菌体、akk菌培养物、akk菌提取物中的至少一种。

技术总结

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及AKK菌在制备抗肝中毒的药物中的应用。本发明研究发现，AKK菌可以预防、改善和长期使用抗精神病药物(以奥氮平为代表)所致的肝脏脂肪蓄积、变性和氧化应激损伤，AKK菌的预防作用不仅不会对患者的身体造成损害，还可以减轻经济负担，具有极大的临床应用价值。具有极大的临床应用价值。