地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶栓活性测定中的应用的制作方法

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1.本发明涉及中药分析检测技术领域，尤其涉及地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶栓活性测定中的应用。

背景技术：

2.地龙是我国的一味传统中药，始记载于《神农本草经》，常用于中风等心脑血管疾病。其功效是清热定惊、活血通络、平喘利尿。《中国药典》2020年版收载地龙来源为钜蚓科参环毛蚓pheretima aspergillum(e.perrier)、通俗环毛蚓pheretima vulgaris chen、威廉环毛蚓pheretimaguillelmi(michaelsen)或栉盲环毛蚓pheretimapectiniferamichaelsen的干燥体，前一种习称"广地龙"，后三种习称"沪地龙"，《中国药典》2020版第一部中共收载了含有地龙的成方制剂41个品种。其中发挥清热定惊作用的有3个，占总制剂的7.32％，发挥平喘利尿功效的3个(7.32％)，平肝潜阳，降低高血压的3个(7.32％)，其余32个主要应用地龙活血通络功效，占总制剂的78.04％，主要用于临床症见腿脚屈伸不利、手足拘挛、或者腰膝酸软，口唇暗，舌质暗红或有瘀斑等有血瘀症状的患者，严重者出现半身不遂，偏身麻木，口舌歪斜，语言謇涩等中风症状。
3.地龙中含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸、核苷等，其中蚓激酶为其主要的溶栓活性物质，它是从蚯蚓中提取的一类具有纤溶活性的激酶，又被称为蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme，efe)。蚓激酶标准品是从赤子爱胜蚓eisenia foetida中分离得到到一组酶，目前地龙溶栓活性测定一般以蚓激酶标准品为对照，采用琼脂糖纤维蛋白酶原平板法，通过测量溶圈的直径来确定纤溶活力。该方法为测定一类蚓激酶的总体活性，方法专属性、线性和稳定性均较差。
4.近年来，基于蛋白质组学研究，建立以特征肽为指标的质控方法为动物类中药质控标准的提升打开了新的局面。专利cn111303263a报道了5个特征多肽用于地龙常见品种参环毛蚓、通俗环毛蚓和保宁腔蚓的种属的鉴别。申请人所在课题组前期对地龙种属间蛋白质组差异进行研究，筛选出6个离子对用于鉴别药用地龙药材的真伪辨别，能够准确区分参环毛蚓、通俗环毛蚓和栉盲环毛蚓，并能鉴定出地龙常见伪品保宁环毛蚓、直隶腔蚓等。(gu,y.,zhang,j.,sun,j.,yu,h.,feng,r.,mao,x.,yang,x.,zhou,y.,hu,q.,ji,s.marker peptide screening and species-specific authentication of pheretima using proteomics.anal.bioanal.chem.[j].2021；413(12):3167-3176.)。
[0005]
但是，目前特征肽鉴别方法只能用于地龙种属鉴别，不能检测药材的活性。市场上地龙药材溶栓活性参差不齐，甚至没有活性，因此，筛选出一组可以准确反映地龙溶栓活性的标志肽并建立活性测定方法，对于地龙药材的质量控制、规范地龙药材市场、保证临床用药安全具有重要意义。

技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶
栓活性测定中的应用。
[0007]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0008]
本发明第一方面提供一组地龙溶栓活性标志肽，包括
[0009]
参环毛蚓溶栓活性标志肽1～11，其氨基酸序列如seq id no:1～seq id no:11所示；
[0010]
沪地龙溶栓活性标志肽3、11，其氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:11所示。
[0011]
进一步地，所述沪地龙为通俗环毛蚓和威廉环毛蚓。
[0012]
进一步地，所述溶栓活性标志肽1～11的质谱条件为：
[0013][0014][0015]
本发明第二方面是提供上述地龙溶栓活性标志肽在地龙溶栓活性测定中的应用。
[0016]
本发明第三方面是提供基于上述地龙溶栓活性标志肽的地龙溶栓活性测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0017]
步骤一，对待测样品进处理，得到待测多肽混合液；
[0018]
步骤二，采用超高效液相谱-三重四级杆质谱仪检测所述待测多肽混合液，得到待测样品的溶栓活性标志肽质谱谱图。
[0019]
进一步地，所述超高效液相谱-三重四级杆质谱仪检测的谱条件为：
[0020]
分析柱：cortecs c18谱柱，2.7μm 2.1
×
50mm；
[0021]
进样量：1μl；
[0022]
流速：0.2ml/min；
[0023]
流动相：流动相a为0.1％甲酸-水溶液，流动相b为乙腈，
[0024]
梯度洗脱：0～10min，2～35％b；30～32min，35～90％b。
[0025]
进一步地，所述超高效液相谱-三重四级杆质谱仪检测的质谱条件为：喷雾电压为4000v，气体温度270℃，流速16l/min，nebulizer 45psi，采用mrm模式。
[0026]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0027]
本发明以地龙鲜品为研究对象，开展地龙组织与体腔液非标记蛋白质组学研究和地龙干燥温度的tmt标记蛋白质组学研究，通过系统比较上调和下调相关蛋白和多肽的变化，筛选出了11个与溶栓活性相关的标志肽，其含量与活性测定结果具有较强的正相关性。
[0028]
本发明从参环毛蚓中筛选出11条溶栓活性标志肽，其含量与地龙的溶栓活性呈现较强正相关性，可用于参环毛蚓溶栓活性的测定；其中2条与沪地龙溶栓活性具有强相关性，可用于沪地龙溶栓活性的测定。
附图说明
[0029]
图1是纤溶酶谱表征地龙组织与体腔液纤溶活性；
[0030]
图2是不同干燥温度对地龙纤溶活性蛋白的影响；
[0031]
图3是不同干燥温度样品鉴定非冗余肽heatmap分析；
[0032]
图4是参环毛蚓溶栓活性标志肽dmrm谱图；
[0033]
图5是参环毛蚓溶栓活性标志肽dmrm谱图-续；
[0034]
图6是栉盲环毛蚓溶栓活性标志肽dmrm谱图；
[0035]
图7是通俗环毛蚓溶栓活性标志肽dmrm谱图；
[0036]
图8是溶栓活性标志肽专属性验证；
[0037]
图9是广地龙药材标志肽含量与纤溶活力；
[0038]
图10是沪地龙药材标志肽含量与纤溶活力pearson相关性分析相关系数r值；
[0039]
图11是沪地龙药材溶栓活性与标志肽含量；
[0040]
图12是沪地龙药材标志肽含量与纤溶活力pearson相关性分析相关系数r值；
[0041]
图13是本发明实例1中广地龙药材样品eic图；
[0042]
图14是本发明实例2中广地龙药材样品eic图。
具体实施方式
[0043]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0044]
本发明从参环毛蚓中筛选出11条溶栓活性标志肽，其含量与地龙的溶栓活性呈现较强正相关性，可用于参环毛蚓溶栓活性的测定；其中2条与通俗环毛蚓溶栓活性具有强相关性，可用于通俗环毛蚓溶栓活性的测定。具体内容如下：
[0045]
1.特征肽的筛选
[0046]
采用鸟法蛋白质组研究和tmt标记蛋白质组学策略，将提取的地龙蛋白进行酶解，得到多肽混合物，经谱柱分离后，采用串联质谱进行分析，通过搜索数据库进行蛋白质鉴定，以确定蛋白信息、肽段序列、来源蛋白等信息，采用统计学方法筛选溶栓活性标志肽。
[0047]
1.1地龙组织与体腔液蛋白的提取与含量测定
[0048]
1)地龙体腔液与组织蛋白提取：将20mg地龙体腔液与组织粉，分别加入50mm nh4hco3提取液400ul，37℃超声提取40min，离心，固体加入50mm nh4hco3提取液200μl 37℃超声提取30min，离心，合并上清液得地龙蛋白。
[0049]
2)不同干燥温度地龙蛋白的提取：将40mg地龙体腔液与组织粉，分别加入50mm nh4hco3提取液800μl，37℃超声提取40min，离心，固体加入50mm nh4hco3提取液400μl 37℃超声提取30min，离心，合并上清液，取400μl溶液加入甲醇-氯仿(1:1，v:v)溶液，涡旋，4℃放置过夜(12小时)，离心，取上层，冻干的地龙溶栓蛋白。
[0050]
3)还原烷基化：取100～200μg蛋白，分别加入冷tris-酚200μl，室温涡旋20分钟。加入在-20℃下用五倍量的的100mm乙酸铵的甲醇溶液沉淀过夜。离心、去除上清，固体用尿素(8m，1％sds)溶液溶，超滤除去尿素。加50mm的dtt(用50mm碳酸氢铵溶解，现用现配，dtt终浓度为25mm)95℃放置30min，加50mmiaa(用50mm碳酸氢铵溶解，现用现配，iaa终浓度为50mm)暗处放置40min。
[0051]
4)胰蛋白酶酶解、除盐和富集：trypsin用1ml醋酸溶解，浓度100μg/ml，取各样品加入trypsin(约1:50，w/w)37℃酶解18小时，用10％tfa酸化至ph 2-3终止反应。冻干，加入磷酸盐缓冲液(ph7.8)200μl，加入trypsin(约1:50，w/w)45℃酶解4小时。c18除盐：缓冲液a：h2o 38.4ml，5％tfa 1.6ml；缓冲液b：h2o 6.4ml，acn 32ml，10％tfa 1.6ml；50％acn活化c18小柱，缓冲液a吹打，吸取样品上样，缓冲液a除盐，缓冲液b 200μl反复吹打提取肽段，重复一次。于真空离心浓缩仪中常温旋干，加入0.1％fa100μl复溶，离心去上清装于塑料液相小瓶中，即得。
[0052]
1.2地龙溶栓活性的测定
[0053]
1)纤溶酶谱表征地龙蛋白活性：纤溶酶酶谱是一种基于聚丙烯酰胺凝胶的纤溶活性测定方法，纤溶蛋白依据其分子量不同进行分离，凝胶中的纤维蛋白在孵育过程中被酶降解，通过测定样品的特异性蛋白水解活性来表征纤溶活性。具有纤溶活性的蛋白在纤溶酶谱上显示为清晰透明的条带。自制12％分离胶中加入纤维蛋白原(终浓度0.5mg/ml)和凝血酶(0.012bp/ml)。电泳结束后凝胶以2.5％的triton x-100溶液浸泡30min脱，然后用pbs缓冲液(ph 7.4)37℃孵育30min，考马斯亮蓝r250染过夜，甲醇-乙酸-水(4:1:5，v:v:v)脱液洗脱至透明条带清晰，bio-rad xr+拍照。
[0054]
参环毛蚓、通俗环毛蚓和栉盲环毛蚓的组织和体腔液中提取的蛋白纤溶酶谱见图1，体腔液具有纤溶活性，条带清晰，与蚓激酶的纤溶条带有差异，不同种属体腔液纤溶蛋白分布存在明显差异，主要分布在15kda～55kda间，其中参环毛蚓和通俗环毛蚓分在15kda～35kda间的纤溶活性蛋白条带较为丰度；而组织没有纤溶活性。采用参环毛蚓组织与体腔液为研究对象进行非标记蛋白组学研究筛选地龙溶栓活性标志肽。
[0055]
2)琼脂糖纤维蛋白平板表征地龙溶栓活性：琼脂糖凝胶250mg至干净小烧杯中，加30ml pbs缓冲液(ph 7.4)，微波加热1min至全部溶解，得琼脂糖溶液，55℃水浴保温备用。取纤维蛋白酶原50mg，加pbs缓冲液30ml溶解，得纤维蛋白原溶液，55℃水浴保温备用。取4bp/ml凝血酶溶液1ml至上述琼脂糖溶液中混合均匀，再缓缓加入预热的纤维蛋白酶原溶液，混匀够倒入直径15cm的培养皿中，静置1h凝固备用。取5μl地龙蛋白溶液(浓度越1mg/ml)上样。取蚓激酶对照加0.5ml水制成48000u/ml的储备液，稀释制成一系列浓度，取5μl上样，以logu为纵坐标，溶圈面积为横坐标绘制标准曲线。
[0056]
将分别采用冻干(freeze-dried，fd)，40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃干燥12h制备地龙样品，采用纤溶酶谱与纤维蛋白酶原平板法表征溶栓活性。随着干燥温度升高，二者都可以观测到溶栓作用下降。纤溶酶谱结果显示温度高于70℃时纤溶溶条带变
浅，溶栓活性下降明显；但不同温度干燥的样品纤溶蛋白条带分布一致(图2)。
[0057]
纤维蛋白酶原平板可以定量的测定溶栓活性，本研究以蚓激酶对照品为对照测定以后80℃干燥12小时，纤溶活力下降约50％，100℃下降80％，高温干燥对地龙溶栓活性影响较大。采用冻干、40℃、60℃、80℃和100℃干燥的地龙样品开展标记蛋白质组学研究筛选溶栓活性标志肽。
[0058]
1.3谱与质谱条件
[0059]
采用ultimate 3000nano rslc-orbitrap fusion lumos高分辨质谱仪(美国thermo fisher公司)，分析柱thermo acclaim pepmap rslc c182μm(50μm
×
15cm)，预柱thermoacclaim pepmap c183μm(75μm
×
2cm)，进样量1μl，流速300nl/min，流动相a(0.1％甲酸-水溶液)，流动相b(乙腈/0.1％甲酸-水溶液＝80/20)，梯度洗脱：0～5min，5％b；5～90min，5～80％b；91～100min，80％b；100～105min，80％～5％b；105～120min，5％b。质谱条件：喷雾电压为2.0kv，离子传输毛细管温度320℃，裂解模式为高能诱导解离(hcd)，归一化碰撞能量30％，分辨率设置：一级120k，二级30k，母离子扫描范围(m/z)：350-1500，二级质谱使用动态数据依赖扫描(data dependent acquisition,dda)，采用“top speed”算法选取一级离子进行hcd碎片扫描。数据采集和处理使用xcalibur 4.0软件。
[0060]
1.4蛋白质的鉴定与特征肽的初步筛选
[0061]
1)蛋白质组学结果鉴定
[0062]
proteome discoverer 2.2软件分析参数：将nano lc-orbirap fusion lumos质谱数据导入pd2.2软件，采用seuqest ht算法对ms2质谱图处理，以地龙转录组得到的理论蛋白数据库库为检索库，seuqest ht参数设置：trypsin enzyme,two missed cleavages allowed,minimumpeptide length of6，母离子的质量偏差：5ppm，碎片离子的质量偏差：0.02daltons。固定修饰：carbamidomethyl，57.02da(c)，可变修饰(肽末端)：pro-hydroxypro，15.99da(p)；oxidation，15.99da(m)；lyshydroxy-lys 15.99da(k)。可变修饰(蛋白末端)：acetyl 42.01da(n-terminus)。多肽匹配误差率使用target-decoy策略与正确和错误匹配的percolator建模相结合来确定。使用由percolator测定的0.01的q值卡值来在肽段匹配水平上过滤数据以控制错误的发现。
[0063]
2)溶栓栓活性标志肽筛选
[0064]
筛选的溶栓活性标志肽应具有以下特征：(1)氨基酸数目在6～25；(2)肽段无修饰或具有固定修饰；(3)能有效电离，信号稳定且具有一定的强度。
[0065]
3)基于地龙组织与体腔液非标记蛋白质组学研究筛选溶栓活性标志肽
[0066]
基于发现纤溶活性标志物的目的，本发明从以下两个方面筛选候选靶标：一是从组织中下调的非冗余肽中筛选，筛选条件为丰度》e+8且三个生物学重复中均检测到并且ratio variability(％)》100的非冗余肽；二是从下调的蚓激酶中筛选。
[0067]
4)基于tmt标记蛋白质组学研究筛选溶栓活性标志肽
[0068]
采用proteome discoverer 2.4软件对鉴定的非冗余肽heatmap分析，聚类结果显示冻干、40℃和60℃干燥聚为一组，80℃和100℃干燥聚为一组(图3)。heatmap图有两个明显下调区域，包含132个非冗余肽，参照以下方法筛选与溶栓活性相关标志肽：40℃与60℃干燥的ratio在0.67～1.2间，80℃与100℃干燥ratio《0.67的肽。
[0069]
1.5特征肽验证
[0070]
proteome discoverer软件初步筛选的溶栓活性标志肽肽，采用三重四级杆质谱对其进行验证。采用超高效液相谱-三重四级杆质谱仪(agilent 1290/agilent6495)，分析柱cortecs c18谱柱(2.7μm 2.1
×
50mm)，进样量1μl，流速0.2ml/min，流动相a(0.1％甲酸-水溶液)，流动相b(乙腈)，梯度洗脱：0～10min，2～35％b；30～32min，35～90％b。质谱条件：喷雾电压为4000v，气体温度270℃，流速16l/min，nebulizer 45psi，采用多重反应检测模式(mrm)，数据采集和处理使用mass hunter软件。对初步筛选的特征肽的专属性进行验证，结果显示，11标志肽可区分参环毛蚓组织与体腔液活性。进一步在其他种属中验证：4标志肽可区分栉盲环毛蚓组织与体腔液活性，5标志肽可区分通俗环毛蚓组织与体腔液活性。结果如图5-7所示。
[0071]
表1地龙溶栓活性标志肽序列和质谱条件
[0072][0073]
2.溶栓活性标志肽含量测定方法的方法学验证
[0074]
本发明以合成的龙溶栓活性标志肽为对照，考察了方法的线性及其范围、精密度、重复性、稳定性和准确度等。其结果如下：
[0075]
2.1专属性试验
[0076]
为了考察建立方法的专属性，通过与合成的标志肽对照品离子对的保留时间比对其专属性进行考察，指认了各合成标志肽，空白溶剂无干扰，见图8。结果表明建立方法的专属性良好。
[0077]
2.2标准曲线
[0078]
精密称取合成肽对照品适量，用水制成浓度分别为5μg/ml的混合对照品溶液，分别精密量取混合对照品溶液适量至一定体积的量瓶中，制得系列标准溶液，分别吸取各对照品溶液1μl进样分析，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标x，峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线，并计算得回归方程(表2)。
[0079]
表2线性关系
[0080][0081]
2.3准确度
[0082]
取样品9份，于酶解前，分别精密加入相当于原有量50％(低浓度水平)，100％(中浓度水平)，150％(高浓度水平)的11个溶栓活性标志肽对照品，按照供试品制备中酶解方法制备样品，用于测定加样回收率，考察方法的准确度，11个溶栓活性标志肽的加样回收率结果见表6-6。其中pep.1、pep.2、pep.3、pep.7范围分别为84.3％～113.1％、99.6％～118.9％，83.9％～117.5％，85.5～108.5，rsd均小于11％，说明方法准确度较好可以。pep.4、pep.5、pep.6、pep.8、pep.9、pep.10、pep.11、范围分别为76.4％～123.9％，102.2％～149.4％，99.7％～138.8％、99.7％～138.8％、80.3％～133.0％、80.3％～133.0％、111.6％～215.3％，81.2％～133.4％，101.3％～199.7％，rsd值较高。其中pep.5和pep.11在低浓度加样回收率较高，但中高浓度加样回收率较好。
[0083]
2.4精密度
[0084]
精密量取混合对照品溶液1μl，进样分析6次，记录峰面积，结果见表3。连续分析6次结果显示pep.3(gefpwqlsmtr)的rsd为11.82，说明方法的重复性基本可以。其余10个溶栓活性标志肽面积的rsd均小于8％，对照品溶液的平行性良好。
[0085]
表3精密度考察
[0086][0087]
2.5重复性
[0088]
分别称取本品40mg地龙样品，一式6份，精密称定，按照正文供试品溶液的制备方法制备和测定，结果见表4。6份样品中标志肽pep.3相对标准偏差为10.43％，说明方法的重
复性基本可以。其余10个标志肽的峰面积/称样量(mg)的相对标准偏差小于6.0％，说明方法的重复性较好(表4)。
[0089]
表4重复性考察
[0090][0091][0092]
2.6稳定性
[0093]
取供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24时进样1μl分析，记录峰面积，结果见表5，样品峰面积的相对标准偏差小于6.0％，可见供试品溶液在24小时内基本稳定。
[0094]
表5供试品溶液稳定性考察
[0095][0096]
3.溶栓活性标志肽与纤溶活性相关性分析
[0097]
按建立好的方法测定了39批样品中11个溶栓活性标志肽的含量，包括18批沪地龙(a1-a16为通俗环毛蚓，其中a1-a4为自制药材，a17、a18为威廉环毛蚓)、15批广地龙(b1-b5为自制药材)6批伪品(c1-c6)。并采用采用琼脂糖纤维蛋白平板法测定39批地龙药材溶栓活性，采用pearson相关系数法地龙药材中溶栓活性标志肽含量和纤溶活力相关性。
[0098]
3.1广地龙溶栓活性标志肽与纤溶活性相关性分析
[0099]
分析不同参环毛蚓药材样品中溶栓活性标志肽含量和纤溶活力可知(图9)，当pep.1(tdasnilpntlqk)、pep.3(gefpwqlsmtr)、pep.4(vistdecnr)、pep.5(dscqgdsggplsvk)、pep.7(atfdativ)、pep.8(yainvigr)、pep.9(wpldyfik)、pep.10(vlypssgtaqdysk)和pep.11(vtmtpapgliyr)标志肽，或pep.2(tsasnilpntlqk)和pep.6(gsviagvgswvvr)的检出低于1.198和4.757μg/g时，地龙没有纤溶活性。
[0100]
从图10可看出，参环毛蚓中筛选出的11个溶栓活性标志肽与参环毛蚓药材纤溶活性活力pearson相关系数值均大于0.83(p＜0.01)极显著正相关，其中pep.3、7、8、9、10、11的pearson相关系数值大于0.90(p＜0.01)。说明参环毛蚓药材中筛选的溶栓活性标志肽与其溶栓活性有关。此外，筛选出的11个溶栓活性标志肽间相关系r值在0.790～0.999(p＜0.01)之间，显著正相关。说明筛选的溶栓活性标志肽之间具有不同程度的影响。
[0101]
3.2沪地龙溶栓活性标志肽与纤溶活性相关性分析
[0102]
分析不同通俗环毛蚓药材样品中溶栓活性标志肽含量和纤溶活力可知(图11)，自制四批药材均有活性且5个溶栓活性标志肽均有检出，纤溶活力较高的沪地龙药材(通俗环毛蚓和威廉环毛蚓)中活性的药材标志肽pep.3(gefpwqlsmtr)、pep.11(vtmtpapgliyr)有检出；虽然一批伪品具有纤溶活性，但3批伪品均无伪品中无pep.3和pep.11检出；其他3个标志肽在药材中规律不明显。
[0103]
进一步采用pearson相关系数法地龙药材中溶栓活性标志肽含量和纤溶活力相关性。从图12可看出，溶栓活性标志pep.3与通俗环毛蚓药材纤溶活性活力(r＝0.635，p＜0.01)，pep.11与通俗环毛蚓药材纤溶活性活力(r＝0.878，p＜0.01)具有显著的相关性。溶栓活性标志肽pep.3与pep.11之间具有不同程度的影响(r＝0.677，p＜0.01)。从参环毛蚓中筛选出的溶栓活性标志肽pep.3与pep.11可以用于表征通俗环毛蚓的溶栓活性。
[0104]
11个溶栓活性标志肽间具有较强的相关性，其在药材中含量互有影响，因此筛选2个具有代表的标志肽用于药材质量控制。pep.7与其他标志肽的相关系数均大于0.90(p《0.01)，具有极强相关性，且其精密度、重复性、准确度均较好，可选为质控多肽。此外pep.1与参环毛蚓药材具有强相关性(r＝0.865，p《0.01)归属蛋白为蚓激酶与纤溶活性蛋白，在无活性的参环毛蚓中无检出，且具有较好的精密度、重复性、准确度，可选为参环毛蚓质控多肽。标志肽pep.7和pep.1(归属蛋白为纤溶活性蛋白)应用于广地龙药材质量控制检测药材活性，二者均可在有活性的参环毛蚓中检出，无活性的参环毛蚓与伪品中无检出。
[0105]
从参环毛蚓中筛选的11溶栓活性标志肽中有5个可以区分通俗环毛蚓的组织与体腔液，进一步测定这5个标志肽在沪地龙药材中的含量，结果显示标志肽pep.3与pep.11与沪地龙溶栓活性相关性较强，且在伪品中无检出。应用于沪地龙药材质量控制检测药材活性。
[0106]
实施例1
[0107]
购买市场广地龙样品，参照《中国药典》2020年版四部9107中药材dna条形码分子鉴定法鉴定为参环毛蚓。
[0108]
取40mg广地龙药材粉末，加入50mm nh4hco3提取液800μl，37℃超声提取40min，离心，固体加入50mm的nh4hco3提取液400μl 37℃超声提取30min，离心，合并上清液得地龙蛋白。通过琼脂糖纤维蛋白酶原平板测活性，每毫克药材溶栓活力为2395.6u。
[0109]
取100～200μg蛋白，分别加入冷tris-酚200μl，室温涡旋20分钟。加入在-20℃下用五倍量的的100mm乙酸铵的甲醇溶液沉淀过夜。离心、去除上清，固体用尿素(8m，1％sds)溶液溶，超滤除去尿素。加500mm的dtt 10μl(用50mm碳酸氢铵溶解，现用现配，dtt终浓度为25mm)95℃放置30min，加500mm的iaa 20μl(用50mm碳酸氢铵溶解，现用现配，iaa终浓度为50mm)暗处放置40min。
[0110]
trypsin用1ml醋酸溶解，浓度100μg/ml，取各样品加入trypsin(约1:50，w/w)37℃
酶解18小时，用10％tfa酸化至ph 2-3终止反应。冻干，加入磷酸盐缓冲液(ph7.8)200μl，加入glu-c内切酶(约1:50，w/w)45℃酶解4小时。c18除盐：缓冲液a：h2o 38.4ml，5％tfa 1.6ml；缓冲液b：h2o 6.4ml，acn32ml，10％tfa 1.6ml；50％acn活化c18小柱，缓冲液a吹打，吸取样品上样，缓冲液a除盐，缓冲液b 200μl反复吹打提取肽段，重复一次。于真空离心浓缩仪中常温旋干，加入0.1％fa100μl复溶，离心去上清装于塑料液相小瓶中，即得。
[0111]
采用超高效液相谱-三重四级杆质谱仪(agilent 1290/agilent 6495)，分析柱cortecs c18谱柱(2.7μm 2.1
×
50mm)，进样量1μl，流速0.2ml/min，流动相a(0.1％甲酸-水溶液)，流动相b(乙腈)，梯度洗脱：0～10min，2～35％b；30～32min，35～90％b。质谱条件：喷雾电压为4000v，气体温度270℃，流速16l/min，nebulizer 45psi，采用mrm模式，数据采集和处理使用mass hunter软件。所得到的mrm谱图如图13所示，可以同时检测到11个溶栓活性标志肽的谱峰，pep.1～pep.11的含量分别1.294、4.948、1.774、2.287、2.306、12.156、0.509、3.333、1.550、1.253和1.651μg/g。
[0112]
实施例2
[0113]
购买市场广地龙样品，参照《中国药典》2020年版四部9107中药材dna条形码分子鉴定法鉴定为参环毛蚓。
[0114]
取40mg广地龙药材粉末，加入50mm nh4hco3提取液800μl，37℃超声提取40min，离心，固体加入50mm的nh4hco3提取液400μl 37℃超声提取30min，离心，合并上清液得地龙蛋白。通过琼脂糖纤维蛋白酶原平板测活性，每毫克药材溶栓活力为0u。
[0115]
取100～200μg蛋白，分别加入冷tris-酚200μl，室温涡旋20分钟。加入在-20℃下用五倍量的的100mm乙酸铵的甲醇溶液沉淀过夜。离心、去除上清，固体用尿素(8m，1％sds)溶液溶，超滤除去尿素。加500mm的dtt 10μl(用50mm碳酸氢铵溶解，现用现配，dtt终浓度为25mm)95℃放置30min，加500mm的iaa20μl(用50mm碳酸氢铵溶解，现用现配，iaa终浓度为50mm)暗处放置40min。
[0116]
trypsin用1ml醋酸溶解，浓度100μg/ml，取各样品加入trypsin(约1:50，w/w)37℃酶解18小时，用10％tfa酸化至ph 2-3终止反应。冻干，加入磷酸盐缓冲液(ph7.8)200μl，加入glu-c内切酶(约1:50，w/w)45℃酶解4小时。c18除盐：缓冲液a：h2o 38.4ml，5％tfa 1.6ml；缓冲液b：h2o 6.4ml，acn32ml，10％tfa 1.6ml；50％acn活化c18小柱，缓冲液a吹打，吸取样品上样，缓冲液a除盐，缓冲液b 200μl反复吹打提取肽段，重复一次。于真空离心浓缩仪中常温旋干，加入0.1％fa100μl复溶，离心去上清装于塑料液相小瓶中，即得。
[0117]
采用超高效液相谱-三重四级杆质谱仪(agilent 1290/agilent 6495)，分析柱cortecs c18谱柱(2.7μm 2.1
×
50mm)，进样量1μl，流速0.2ml/min，流动相a(0.1％甲酸-水溶液)，流动相b(乙腈)，梯度洗脱：0～10min，2～35％b；30～32min，35～90％b。质谱条件：喷雾电压为4000v，气体温度270℃，流速16l/min，nebulizer 45psi，采用mrm模式，数据采集和处理使用mass hunter软件。所得到的mrm谱图如图14所示，pep.1～pep.11的含量分别0、0、0、0、0、3.116、0、0、0、0和0μg/g。
[0118]
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

技术特征：

三重四级杆质谱仪检测的质谱条件为：喷雾电压为4000v，气体温度270℃，流速16l/min，nebulizer 45psi，采用mrm模式。

技术总结

本发明公开了地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶栓活性测定中的应用，该地龙溶栓活性标志肽，包括：参环毛蚓溶栓活性标志肽1～11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:11所示；沪地龙溶栓活性标志肽3、11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11所示。本发明从参环毛蚓中筛选出11条溶栓活性标志肽，其含量与地龙的溶栓活性呈现较强正相关性，可用于参环毛蚓溶栓活性的测定；其中2条与沪地龙溶栓活性具有强相关性，可用于沪地龙溶栓活性的测定。定。定。