一种耐辐射球菌及其应用

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1.本发明属于微生物发酵生产黄酮类物质的技术领域，具体涉及一种耐辐射球菌及其应用。

背景技术：

2.黄酮类物质是植物中作为次级代谢物产生的一组多酚化合物，广泛存在于水果、蔬菜和其他粮食作物中。由于其具有极强的抗氧化活性，它们对多种疾病(例如心血管疾病和动脉粥样硬化等)以及其他生物活性(例如抗炎和抗衰老等)具有积极的作用。大量体外和体内生物活性研究已经证明了它们对许多退行性疾病和病症的强大效果和预防益处，包括神经变性、糖尿病、炎症、自身免疫性疾病和癌症；例如，槲皮素可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡，而芹菜素具有低的内在毒性和对癌细胞的显著抑制作用。与传统合成药物相比，黄酮类物质的不良副作用几乎可以忽略不计，因此目前黄酮类物质已成为许多营养保健品中必不可少的成分。
3.大部分陆生植物经过长期的环境驯化进化出了生产黄酮物质的能力，黄酮类化合物通常存在于花、叶和种子中。作为次级代谢物，植物中的黄酮类物质在介导植物对生物和非生物环境因素的反应方面起着至关重要的作用。例如，花青素类物质参与水果和花卉的着以吸引动物，并保护植物免受食草动物、细菌、真菌等生物胁迫因素和非生物环境压力源(如紫外线光吸收)的侵害。因此，黄酮类化合物在所有植物中都无处不在。目前，市场上流通的大部分黄酮类物质的获取依靠从银杏、大豆、芹菜等植物中提取，但是由于植物生长受季节、地域等环境因素的限制，以及市场需求量的逐年递增，从植物中提取黄酮类物质已近远远不能满足市场需求，同时通过常规化学合成生产这些产品物质比较复杂，仍然面临许多难题，导致黄酮类物质大规模工业化生产还有一定的距离。
4.近年来，由于基因测序技术的发展以及一系列分子生物学工具的开发应用，利用合成生物学的方法进行黄酮的生产得到迅速发展，但是，目前暂无报道有发现天然产槲皮素的细菌。大部分研究仍然集中于产黄酮类物质工程菌的构建，利用合成生物技术改造大肠杆菌或酵母菌生产黄酮骨架物质，通过从头设计的途径构建、模块化改造途径优化和基因沉默系统的菌体代谢网络改造等一系列的合成生物学方法和策略，以实现黄酮类物质在工程菌中的高效异源合成。然而，工程菌株的建立存在许多问题待解决，比如，c4h是一种负责将反式肉桂酸羟基化成香豆酸的p
450
细胞素单加氧酶，由于其不稳定性和缺乏特异性细胞素p
450
还原酶，最终导致其在大肠杆菌中是无功能的；酵母菌也是用的比较多的基因工程底盘菌之一，但利用酵母宿主设计次级代谢物途径时也存在一个问题，因为它们缺乏支持多基因(多顺式)转录单元的能力；此外，由于基因工程技术中基因只能来源于自然界中已存在的，且往往同时涉及到多个基因，这就意味着需要花费大量时间从自然界中筛选出理想的基因，同时组装这些基因时需考虑适配性等多个因素。《自然》杂志就曾发表“合成生物学面临的五大挑战”一文，指出，合成生物学进一步发展面临着技术创新和技术整合的瓶颈，需要克服五个方面的挑战：(1)许多生物组件未能准确描述，因此难以进行应用；(2)
即使每个组件的功能已知，但当多个组件组装到一起，可能无法按事先想象的那样工作，基因网络难以预测；(3)随着基因网络变得越来越大，基因网络的建设和测试过程也变得更加艰巨；(4)合成的基因网络一经构建好并放入细胞，就可能对其宿主细胞产生无法预期的影响，许多组件开始表现出不兼容性；(5)细胞内的分子活性容易随机波动或形成噪音，生长条件的变化也会影响行为，而且长期由随机产生的基因突变可以损坏基因网络的功能。这些都可能导致人工合成的生命体系最终崩溃，因而这些存在的问题和挑战亟需解决。以上种种因素共同导致构建产目标黄酮工程菌株时存在许多问题亟需解决；目前关于天然产黄酮细菌的发现暂未有报道，本发明发现了一种耐辐射球菌，其可以作为工业化发酵生产槲皮素，在黄酮类物质工业发酵上具有巨大潜力。

技术实现要素：

5.本发明的主要目的是针对目前未发现天然产槲皮素细菌的问题，提供了一种产黄酮类物质槲皮素的耐辐射球菌，该菌株可以利用高效地生产槲皮素，对于作为工业化发酵生产槲皮素有着极大的应用前景。
6.为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
7.本发明提供了一种耐辐射球菌，分类命名为deinococcus sp.43，所述耐辐射球菌已在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏号为cctcc no：m2022653，保藏时间为2022年5月17日。
8.进一步地，所述耐辐射球菌是从湖南省长沙市岳麓山银杏根际土壤中分离得到的，其生长速度较快，在平板中呈现粉红，菌表面呈光滑状，在液体培养基中呈浅粉，在ph 6-8、28-30℃范围内可快速生长。
9.本发明还提供了上述耐辐射球菌的获取方法，包括如下步骤：
10.(1)取银杏根际土样品用无菌水进行溶解，搅拌后静置取上清液进行梯度稀释；
11.(2)将稀释液涂布在葡萄糖蛋白胨酵母浸膏(tgy)固体平板培养基上进行培养，得到粉红单菌落；
12.(3)在tgy固体平板培养基中加入琼脂粉并高温灭菌，移取上述单菌落涂布在tgy培养基上进行培养，挑选单菌落进行多次划线分离纯菌；
13.(4)将纯化后得到的红单菌落进行16srdna扩增测序，并进行同源性分析，得到耐辐射球菌。
14.所述的方法，步骤(2)中，分别取1ml得到的10-5
、10-6
、10-7
三个梯度的稀释液涂布在tgy固体培养基上进行培养。
15.所述的方法，步骤(2)中，所述tgy固体培养基的组成为：胰蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖1g/l，琼脂15g/l；所述tgy固体培养基在25℃下的ph为6.8-7.2。
16.所述的方法，步骤(2)中，培养时间为24h，培养温度为30℃。
17.所述的方法，步骤(3)中，琼脂粉的加入量为2％(w/v)，高温灭菌的温度为115℃，灭菌时间为30min。
18.所述的方法，步骤(3)中，培养时间为12-48h，培养温度为28-30℃。
19.所述的方法，步骤(4)中，使用30％的灭菌甘油对单菌落进行纯化。
20.进一步地，步骤(4)中，还使用了mega 7.0软件按邻接法构建系统发育树，所得菌
株deinococcus sp.43与耐辐射球菌deinococcus sp.n5的序列有98.72％的同源性。
21.本发明还提供了上述耐辐射球菌的应用，用于发酵生产黄酮类物质。
22.所述耐辐射球菌发酵生产黄酮类物质的步骤如下：
23.(1)吸取所述的耐辐射球菌菌液加入到tgy液体培养基中培养，获得发酵液；
24.(2)将发酵液置于细胞破碎仪上破碎，得到菌体完全破碎开的发酵液；
25.(3)将破碎处理后的发酵液采用有机溶剂提取、浓缩。
26.步骤(1)中，将固体培养基上分离纯化的菌株接种到液体培养基中培养，获得od600＝1菌液用于发酵培养；
27.步骤(1)中，按1％的接种量吸取菌液加入到tgy液体培养基中，所述发酵液的培养时间为60-72h，培养温度为28-30℃，转速为180-200rpm。
28.步骤(1)中，按1-3g/l的浓度加入苯丙氨酸，以作为产黄酮类物质的前体。
29.步骤(2)中，破碎温度为28℃，变幅杆为06，破碎总时长为20min，其中每超声2s，间隙3s。
30.步骤(3)中，将破碎处理后的发酵液与乙酸乙酯混合，静置放置后，分离得到上层有机相，得到初提取发酵液。
31.步骤(3)中，将初提取发酵液再次与乙酸乙酯混合，静置后取上层有机相，将两次乙酸乙酯提取收集到的有机相混合。
32.步骤(3)中，将提取收集到的有机相浓缩，得到浓缩液。
33.进一步地，
34.细胞破碎：将200ml发酵液置于细胞破碎仪上破碎，得到菌体完全破碎开的发酵液，以释放可能存在于菌体细胞内的目标物质。
35.发酵液初提取：将破碎处理后的发酵液与乙酸乙酯按1:1等比例混合，摇晃使其充分接触，静置放置12h后，分离得到上层有机相。
36.发酵液二次提取：将初提取后的发酵液与乙酸乙酯按2:1的比例充分混合，静置后取上层有机相。将两次提取收集到的有机相混合。
37.有机相浓缩：旋蒸水温设置为65℃，冷却塔温度设置为-10℃，旋蒸前，用甲醇将馏瓶充分清洗干净后再使用，旋蒸完后，用5ml甲醇分三次(1、2、2ml)冲洗馏瓶内壁，三次洗液收集于5ml离心管中，得到浓缩液，做好标记；下一个萃取液旋蒸前用2ml甲醇清洗馏瓶，洗三次，弃掉清洗液。
38.液相hplc测定：
39.实验前处理：取1ml上述得到的浓缩液，过0.22μm油系滤膜后收集于液相样品瓶中；蒸馏水、乙腈经0.22μm有机相滤膜在抽滤机上过滤，收集于棕瓶中，抽滤完后，将滤液置于超声水浴中处理30min。
40.本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
41.本发明首次发现耐辐射球菌deinococcus sp.43培养周期短，培养基成分简单，成本低，能够在短时间内快速高效发酵生产槲皮素，其产量高达1.37mg/l。
附图说明
42.图1为菌株deinococcus sp.43在tgy固体平板(a)和液体培养基(b)中的形态；
43.图2为菌株deinococcus sp.43的系统发育树；
44.图3为槲皮素、酚和异鼠李素的标准品谱图(a)、耐辐射球菌deinococcus sp.43发酵液萃取后的谱图(b)以及耐辐射球菌deinococcus sp.43发酵液及其对照由谱图换算后得到的槲皮素的产率图(c)。
具体实施方式
45.本发明有下列实施例进一步说明，但不受这些实施例的限制。
46.实施例1
47.本实施例为菌株deinococcus sp.43的分离纯化及鉴定，所述的耐辐射球菌deinococcus sp.43是从湖南省长沙市岳麓山银杏根际土中分离得到的，具体步骤如下：
48.取适量银杏根际土样品用无菌水进行溶解，充分搅拌使大颗粒土粒溶解，静置后取1ml上清进行梯度稀释，分别取10-5
、10-6
、10-7
三个梯度的稀释液1ml均匀涂布在tgy固体平板培养基上，所述tgy固体培养基的组成为：胰蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖1g/l，琼脂15g/l；所述tgy固体培养基在25℃下的ph为7.0。在30℃条件下培养24h，得到一个粉红单菌落。在培养基中加入2％(w/v)的琼脂粉，115℃灭菌30min，倒平板，移取上述单菌落到固体tgy培养基上进行涂布，在30℃培养24h，挑选单菌落进行多次划线分离纯菌。最后将分离到的单菌用30％的灭菌甘油保存在-80℃冰箱中。
49.图1(a)为菌株deinococcus sp.43在tgy固体平板培养基中的形态；从图中可以看到，耐辐射球菌deinococcus sp.43在固体培养基平板上生长形成边缘光滑的圆形粉红菌落。
50.从新鲜固体培养基上挑取菌株deinococcus sp.43到离心管内，用细菌基因组提取试剂盒提取dna，使用16s通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5
’‑
ggctaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增。pcr产物由上海生物有限公司进行测序，使用bioedit软件拼接数据，然后上传到在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，进行blast序列比对，并进行同源性分析，并使用mega 11.0软件按邻接法构建系统发育树，结果如图2所示。结果表明菌株deinococcus sp.43与耐辐射球菌deinococcus sp.n5的序列有98.72％的同源性。
51.16s rdna测序拼接结果如下：
52.》ggggaagggcgggtgcttagaatgcagtcgaacggcagtcttcggactgtagtggcgcacgggtgagtaacgcgtaactgacctaccccaaagtcgcggataacgattcgaaagaatcgctaatacgtgatgtgctgtcagattgtgttctgccagtaaagattgattgctttgggatggggttgcgttccatcagctagttggtggggtaaaggcccaccaaggcgacgacggattagcccggccctgaggaggggggccggccacaaggggcaactgaaaacacgggtcccaactcctacgggaggcagcagttaggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcgacgccgcgtgagggatgaaggtcttcggatcgtaaacctctgaatcagggacgaaagacacgttatgtgggatgacggtacctgagtaatagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttacccggaatcactgggcgtaaagggcgtgtaggcggacacttaagtctggttttaaagactgcggctcaaccgcagggatggactggatactgggtgtcttgacctctggagagagaactggaattcctggtgtagcggtggaatgcgtagataccaggaggaacaccaatggcgaaggcaggttcttggacagaaggtgacgctgaggcgcgaaagtgtggggagcgaaccggattagatacccgggtagtccacaccctaaacgatgtacgttggctaaccgcaggatgctgtggttggcgaagctaacgcgataaacgtaccgcctg
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53.实施例2
54.本实施例为菌株deinococcus sp.43产槲皮素情况，具体步骤如下：
55.发酵：本实验发酵所用培养基为tgy培养基，从保藏编号为deinococcus sp.43的菌种保藏管中挑取适量菌液涂布于tgy固体平板上，在30℃过夜培养，得到单菌落。挑取单菌落，置于tgy液体培养基中，在30℃、200rpm条件下培养24h至od600＝1；菌株deinococcus sp.43在tgy液体培养基中的形态如图1(b)所示，其在液体培养基中培养至生长对数期时呈现出黄；同时，培养基中按2g/l的浓度加入苯丙氨酸，以作为产黄酮类物质的前体物，发酵体系为200ml；按照1％的接种量从种子液中接种至发酵体系中，30℃、200rpm条件下培养72h，同时，设置不加种子液发酵的空白培养基作为空白对照。
56.发酵液萃取：将200ml发酵液置于细胞破碎仪上，设置总超声时间为20min，其中程序为超声2s间歇3s得到菌体完全破碎的发酵液，以释放可能存在于菌体细胞内的目标物质；将破碎处理后的发酵液与乙酸乙酯按1:1等比例混合，摇晃使其充分接触，静置放置12h后，分离得到上层有机相；将经过初提取后的发酵液与乙酸乙酯再次按2:1的比例充分混合，静置后取上层有机相。将两次提取收集到的有机相混合；将300ml乙酸乙酯萃取液进行旋蒸处理，旋蒸水温设置为65℃，冷却塔温度设置为-10℃，旋蒸前，用甲醇将馏瓶充分清洗干净后再使用，旋蒸完后，用5ml甲醇分三次(1、2、2ml)冲洗馏瓶内壁，三次洗液收集于5ml离心管中，得到浓缩液，做好标记；浓缩后的甲醇溶液过0.22μm滤膜后吸取适量置于棕高效液相试样瓶中。下一个萃取液旋蒸前用2ml甲醇清洗馏瓶，洗三次，弃掉清洗液。
57.标准样品的制备：精确称取槲皮素、酚、异鼠李素分别0.020g、0.020g、0.010g，用甲醇溶解并定容至50ml，配置成浓度分别为0.4mg/ml、0.4mg/ml以及0.2mg/ml的母液。将母液分别稀释，配置成一系列浓度的三种黄酮标准品的标准溶液，浓度系列为0.100mg/ml、0.050mg/ml、0.025mg/ml、0.0125mg/ml、0.00625mg/ml。将三种黄酮标准品的一系列标准溶液过0.22μm滤膜后置于棕高效液相试样瓶中(-20℃保存)。
58.检测条件设置如下：自动进样器设置为10μl的进样体积，总流速1.0ml/min(a:b＝1:1)；谱柱柱温为35℃；检测器设置检测波长为360nm；提取洗脱程序设置为0-10min停止。流动相a：乙腈，流动相b：双蒸水；谱柱：ymc-triartc18(250mm
×
4.6mm，5μm)。
59.清洗谱柱：测定样品前使用a、b相清洗谱柱半小时以上，直至无峰出现。
60.配置槲皮素、酚、异鼠李素浓度分别为0.4mg/l、0.4mg/l、0.2mg/l的标准品。将上述甲醇浓缩液与标准品进行hplc检测，检测结果如图3所示。
61.图3为菌株deinococcus sp.43发酵液液相结果及槲皮素含量情况；图3(a)表示槲皮素、酚和异鼠李素的标准品谱图，在该图中三个出峰从前之后依次表示槲皮素、山
奈酚和异鼠李素，其出峰时间依次为4.4min、6.0min和6.2min左右；图3(b)是耐辐射球菌deinococcus sp.43发酵液萃取后的谱图，在图中可以看到在4.4min左右有明显的出峰，表示该菌发酵产槲皮素；图3(c)表示的是经过进一步的换算之后得出的槲皮素的量，图中ck表示空白培养基(没有添加菌株的培养基)，d-43表示菌株deinococcus sp.43发酵液，经计算，发酵72h后，菌株deinococcus sp.43实验组的槲皮素产率为1.37mg/l，具有天然产槲皮素的能力，用于槲皮素的发酵具有可行性。
62.实施例3
63.本实施例为菌株deinococcus sp.43发酵产物的代谢组情况，对deinococcus sp.43进行与实施例2中相同的发酵处理，利用uplc-ms/ms对发酵液进行代谢物检测，数据采集仪器系统主要包括超高效液相谱(ultra performance liquid chromatography，uplc)(shimadzu nexera x2,https://www.shimadzu/)和串联质谱(tandem mass spectrometry，ms/ms)(applied biosystems 4500qtrap，http://www.appliedbiosystems/)。
64.液相条件主要包括：
65.(1)谱柱：agilent sb-c18 1.8μm，2.1mm*100mm；
66.(2)流动相：a相为超纯水(加入0.1％的甲酸)，b相为乙腈(加入0.1％的甲酸)；
67.(3)洗脱梯度：0.00min b相比例为5％，9.00min内b相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00-11.10min，b相比例降为5％，并以5％平衡至14min；
68.(4)流速0.35ml/min；柱温40℃；进样量4μl。
69.质谱条件主要包括：
70.电喷雾离子源(electrospray ionization，esi)温度550℃；离子喷雾电压(is)5500v(正离子模式)/-4500v(负离子模式)；离子源气体i(gsi)，气体ii(gsii)和气帘气(cur)分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在qqq和lit模式下分别用10和100μmol/l聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。qqq扫描使用mrm模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的去簇电压(declustering potential，dp)和碰撞能(collision energy，ce)优化，完成了各个mrm离子对的dp和ce。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的mrm离子对。
71.利用软件analyst 1.6.3处理质谱数据，用multiquant软件打开样本下机质谱文件，进行谱峰的积分和校正工作。
72.结果如表1所示，此次共检测出了77种黄酮类物质，包括黄酮醇、异黄酮、花青素、黄烷醇、二氢黄酮等物质，其中包含槲皮素，表明该菌具有产槲皮素的能力；其次，代谢组数据还显示出存在槲皮素相关的衍生物，比如槲皮万寿菊素，而槲皮素本身的溶解性比较差从而导致其生物利用度较差，这预示着该菌可能具有相关酶能将槲皮素转化为更利于生物体吸收利用的物质，具有广泛应用前景。
73.表1发酵液代谢组槲皮素产量情况
74.

技术特征：

1.一种耐辐射球菌，分类命名为(deinococcus sp.)43，保藏号为cctcc no：m 2022653。2.权利要求1所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，用于发酵生产黄酮类物质。3.根据权利要求2所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，用于发酵生产槲皮素。4.根据权利要求2或3所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，所述耐辐射球菌发酵生产黄酮类物质的步骤如下：(1)吸取所述的耐辐射球菌菌液加入到tgy液体培养基中培养，获得发酵液；(2)将发酵液置于细胞破碎仪上破碎，得到菌体完全破碎开的发酵液；(3)将破碎处理后的发酵液采用有机溶剂提取、浓缩。5.根据权利要求4所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，步骤(1)中，将固体培养基上分离纯化的菌株接种到液体培养基中培养，获得od600＝1菌液用于发酵培养。6.根据权利要求4所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，步骤(1)中，按1％的接种量吸取菌液加入到tgy液体培养基中，所述发酵液的培养时间为60-72h，培养温度为28-30℃，转速为180-200rpm。7.根据权利要求4所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，步骤(1)中，按1-3g/l的浓度加入苯丙氨酸，以作为产黄酮类物质的前体。8.根据权利要求4所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，步骤(3)中，将破碎处理后的发酵液与乙酸乙酯混合，静置放置后，分离得到上层有机相，得到初提取发酵液。9.根据权利要求8所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，步骤(3)中，将初提取发酵液再次与乙酸乙酯混合，静置后取上层有机相，将两次乙酸乙酯提取收集到的有机相混合。10.根据权利要求4所述的耐辐射球菌的应用，其特征在于，步骤(3)中，将提取收集到的有机相浓缩，得到浓缩液。

技术总结

本发明公开了一种耐辐射球菌及其应用，属于微生物发酵生产技术领域。所述耐辐射球菌，分类命名为(Deinococcus sp.)43，所述耐辐射球菌已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC No：M 2022653，保藏时间为2022年5月17日。所述菌株从银杏根际土壤中筛选分离获得，培养24小时达到生长稳定期。将所述菌株用于黄酮发酵，能够在短时间内快速高效发酵生产槲皮素，其产量高达1.37mg/L。所述菌株实现了利用细菌发酵生产槲皮素，使其在工业化发酵生产槲皮素方面具有极大的应用前景。化发酵生产槲皮素方面具有极大的应用前景。化发酵生产槲皮素方面具有极大的应用前景。