一种地芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用

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1.本发明涉及有机废物处理领域，具体涉及一种地芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。

背景技术：

2.众所周知，在易腐有机废弃物的处理、高温有机废水的处理过程中，存在许多难题，例如，易腐有机废弃物在常规好氧菌的作用下会有腐熟度不高，易腐物质降解不够完全的问题；高温生产废水在实际处理过程中，因常规处理菌所适的温度在25-35℃，因此在需要将易降解有机高温废水与常温水混合降温后才能处理，这会大大增加处理量并且降低处理效率。
3.地芽孢杆菌属的菌种均来源于温泉、火山、堆肥等高温环境中，因而其菌种本身以及产生的芽胞均具有极强的耐热性能。芽孢杆菌能够形成芽孢，芽孢在120-140℃还能生存几小时。
4.嗜热菌在实际应用中具有很多优点：
①
嗜热菌的世代时间较短，从而缩短了合成次级代谢产物的生产周期。
②
发酵温度较高，可以实现有害病原菌的彻底灭活，减少了污染杂菌的可能性。
③
减少了大规模发酵过程或水处理过程中的冷却费用，维持极端嗜热菌最适生长温度所需的能量消耗与冷却嗜中温菌所需的能量消耗基本一样多。
④
随着温度上升，培养基的粘度下降.这样便可以减少搅拌所需的能量，并使培养基得到更好的混合。
⑤
在较高温度下，大多数无机盐和有机分子增加了离子化作用和增大了溶解能力，从而有利于产生更多的生物量和产物量。
⑥
嗜热菌产生的酶在常温下具有酶活低，稳定性高等优点。

技术实现要素：

5.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种地芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。将嗜热菌用于易腐有机废物和易降解有机高温废水，使解决技术瓶颈成为了可能。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.一种地芽孢杆菌新菌种，该新菌种被识别为嗜热地芽孢杆菌cx412的地芽孢杆菌属的一个菌种，被称为geobacillus sp.cx412，保藏号cgmcc no. 22926。
8.进一步地，该新菌种属于风险等级1，菌种的核糖体dna具有seq idno.1。换句话说，geobacillus sp.cx412为地芽孢杆菌属的一个新菌种，其16srrna序列如seq id no.1所示。
9.进一步地，该新菌种在氨基酸和多糖存在下能够产生生物源物质，并且能在70-90℃的嗜热条件下生长。
10.一种如上所述地芽孢杆菌新菌种的培养方法，该方法为：将热泉周围土壤稀释后涂布在筛选培养基上，进行筛选培养，得到新菌种；再将纯化的新菌种接种于发酵培养基中，进行发酵培养。
11.进一步地，所述的筛选培养基包括以下质量份组分的基料：胰蛋白胨7-9 份，酪蛋白6-8份,葡萄糖2-4份，氯化钠4-6份，磷酸氢二钠1-3份，脱水小牛脑浸粉9-11份，琼脂14-16份，ph值为7.0-7.4。
12.进一步地，所述的发酵培养基包括以下质量份组分的基料：牛白蛋白4-6 份，胰蛋白胨4-6份，酪蛋白4-6份，葡萄糖4-6份，大豆粉木瓜蛋白酶消化物4-6份，氯化钠5-7份，磷酸氢二钠1-3份，脱水小牛脑浸粉4-6份，琼脂 14-16份，ph值为7.2
±
0.4。
13.进一步地，筛选培养的温度为70-75℃，时间为20-72h；发酵培养的温度为70-90℃，优选80℃，ph＝6.8-7.6，优选ph＝7.2-7.4。上述的培养在需氧条件下进行。
14.一种如上所述地芽孢杆菌新菌种的应用，该新菌种用于易腐有机废弃物的好氧发酵。
15.一种如上所述地芽孢杆菌新菌种的应用，该新菌种用于处理含大量易降解有机物的高温废水。
16.易腐有机废弃物与易降解有机高温废水为二次资源。其中二次资源自组包括污水污泥、畜禽粪便、含易降解有机物的高温废水。其中菌种产生生物源物质，其促进易腐有机物降解并合成丰富的腐殖质；菌种在嗜热条件生长，其促进易降解有机高温废水的降解与沉降。
17.进一步地，高温废水的温度范围为70-90℃。
18.与现有技术相比，本发明提供了一株新菌种嗜热地芽孢杆菌(geobacillussp.)，该菌分离自热泉周围的土壤，其能够促进易腐有机物的好氧发酵来生产有机肥料、处理易降解有机高温废水等，具有广阔的市场前景。
19.菌种保藏说明
20.本发明的嗜热地芽孢杆菌cx412，已于2021年7月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号：cgmcc no.22926。该菌株的分类命名是地芽孢杆菌geobacillussp.，名称为cx412。
附图说明
21.图1为菌株cx412在培养基上的纯培养菌落图；
22.图2为菌株cx412的16s rrna系统发育进化树；
23.图3为菌株cx412与已有菌株序列相似性的比对；
24.图4为菌株cx412与模式菌株进行ani分析的结果。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
26.一种地芽孢杆菌新菌种，该新菌种被识别为嗜热地芽孢杆菌cx412的地芽孢杆菌属的一个菌种，被称为geobacillus sp.cx412，保藏号cgmcc no. 22926。该新菌种属于风险等级1，菌种的核糖体dna具有seq id no.1。该新菌种在氨基酸和多糖存在下能够产生生
物源物质，并且能在70-90℃的嗜热条件下生长。
27.培养方法为：将热泉周围土壤稀释后涂布在筛选培养基上，进行筛选培养，得到新菌种；再将纯化的新菌种接种于发酵培养基中，进行发酵培养。筛选培养基包括以下质量份组分的基料：胰蛋白胨7-9份，酪蛋白6-8份,葡萄糖2-4 份，氯化钠4-6份，磷酸氢二钠1-3份，脱水小牛脑浸粉9-11份，琼脂14-16 份，ph值为7.0-7.4。发酵培养基包括以下质量份组分的基料：牛白蛋白4-6 份，胰蛋白胨4-6份，酪蛋白4-6份，葡萄糖4-6份，大豆粉木瓜蛋白酶消化物4-6份，氯化钠5-7份，磷酸氢二钠1-3份，脱水小牛脑浸粉4-6份，琼脂 14-16份，ph值为7.2
±
0.4。筛选培养的温度为70-75℃，时间为20-72h；发酵培养的温度为70-90℃，ph＝6.8-7.6。
28.该新菌种用于易腐有机废弃物的好氧发酵，或用于处理含大量易降解有机物的高温废水。高温废水的温度范围为70-90℃。
29.实施例
30.嗜热地芽孢杆菌(geobacillus sp.cx412)的分离与纯化
31.geobacillus sp.cx412是从云南省腾冲市的热泉土壤中取样，经过驯化、分离及纯化得到。具体步骤如下:
32.用无菌蒸馏水配置生理盐水(0.85％)，将10g样品土壤稀释至10-5
，涂布于筛选培养基上70℃培养；其中，筛选培养基的配方为：胰蛋白胨8g，酪蛋白7g，葡萄糖3g，氯化钠5g，磷酸氢二钠2g，脱水小牛脑浸粉10g，琼脂15g，ph值为7.0-7.4，1000ml去离子水。在筛选培养基上，75℃好氧培养 48h挑取单菌落，三区划线分离纯化5次，得到分离纯化的纯培养细菌。
33.将活化的纯培养细菌接种于适合菌体繁殖的发酵培养基中，在80℃繁殖培养60h；其中，发酵培养基的配方为：牛白蛋白5g，胰蛋白胨5g，酪蛋白 5g,葡萄糖5g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g，氯化钠6g，磷酸氢二钠2g，脱水小牛脑浸粉5g，琼脂15g，ph值为7.2
±
0.4，1000ml去离子水。从中优选出一株编号为cx412的菌株，参见附图1。
34.嗜热地芽孢杆菌(geobacillus sp.cx412)的鉴定
35.菌株cx412由上海生工进行全基因组测序，得到全基因组序列。系统进化树如图2所示。
36.将测得的cx412 16s rrna序列，在ncbi和ezbiocloud中与已有菌株序列进行比对(图3)，根据相似度选取菌株16s rrna序列进行系统进化树的构建，如图2所示，cx412与地芽孢杆菌属的亲缘距离相近，且在系统进化树中为独立分支，确定其为地芽孢杆菌属，同时根据相似度(99.59％)得知其相似株为parageobacillus toebii nbrc 107807，从ncbi下载相似的模式菌株全基因组，然后在jspeciesws(http://jspecies.ribohost/jspeciesws)和 ezbiocloud进行比对，同时进行平均核苷酸相似度(average nucleotideidentity，ani)(图4)和dna杂交数值(ddh)分析。ani是在核苷酸水平比较两个基因组亲缘关系的指标。ani被定义为两个微生物基因组同源片段之间平均的碱基相似度，他的特点是在近缘物种之间有较高的区分度。相对于传统的ddh，ani指标计算简单省时，且有助于构建结构性数据库，方便生物信息学者的后续研究。
37.本实验中菌株cx412与菌株geobacillus sp.wch70的ani为92.08％，与模式菌株parageobacillus toebii nbrc 107807的ani为91.35％，低于新种临界值95％，与模式菌
株parageobacillus toebii nbrc 107807进行基因组 dna-dna同源性杂交(ddh)：dna同源性(ddh)为35.5％[32.1-39％]， ddh小于70％，因此确定为新种。
[0038]
嗜热地芽孢杆菌(geobacillus sp.cx412)的应用
[0039]
将猪粪、鸡粪和屠宰污水污泥按照200kg/组分堆，对照组接种市面售卖的好氧发酵菌剂比例为10％，实验组接种含有实施例的地芽孢杆菌(geobacillussp.cx412)的微生物菌剂比例为10％，接种后进行高温堆积发酵21天，发酵前后分别对两组取三个平行样。
[0040]
对照组的有机质降解率为40％，可溶腐殖质含量为15-25mg/gvs；实验组的有机质降解率为60％(提高50％)，可溶腐殖质含量为25-50mg/gvs。表明本发明的新菌种可促进易腐有机物降解并合成丰富的腐殖质，具有广阔的市场应用前景。
[0041]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：

1.一种地芽孢杆菌新菌种，其特征在于，该新菌种被识别为嗜热地芽孢杆菌cx412的地芽孢杆菌属的一个菌种，被称为geobacillus sp.cx412，保藏号cgmcc no.22926。2.根据权利要求1所述的一种地芽孢杆菌新菌种，其特征在于，该新菌种属于风险等级1，菌种的核糖体dna具有seq id no.1。3.根据权利要求1或2所述的一种地芽孢杆菌新菌种，其特征在于，该新菌种在氨基酸和多糖存在下能够产生生物源物质，并且能在70-90℃的嗜热条件下生长。4.一种如权利要求1-3任一项所述地芽孢杆菌新菌种的培养方法，其特征在于，该方法为：将热泉周围土壤稀释后涂布在筛选培养基上，进行筛选培养，得到新菌种；再将纯化的新菌种接种于发酵培养基中，进行发酵培养。5.根据权利要求4所述的一种地芽孢杆菌新菌种的培养方法，其特征在于，所述的筛选培养基包括以下质量份组分的基料：胰蛋白胨7-9份，酪蛋白6-8份,葡萄糖2-4份，氯化钠4-6份，磷酸氢二钠1-3份，脱水小牛脑浸粉9-11份，琼脂14-16份，ph值为7.0-7.4。6.根据权利要求4所述的一种地芽孢杆菌新菌种的培养方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括以下质量份组分的基料：牛白蛋白4-6份，胰蛋白胨4-6份，酪蛋白4-6份，葡萄糖4-6份，大豆粉木瓜蛋白酶消化物4-6份，氯化钠5-7份，磷酸氢二钠1-3份，脱水小牛脑浸粉4-6份，琼脂14-16份，ph值为7.2
±
0.4。7.根据权利要求4所述的一种地芽孢杆菌新菌种的培养方法，其特征在于，筛选培养的温度为70-75℃，时间为20-72h；发酵培养的温度为70-90℃，ph＝6.8-7.6。8.一种如权利要求1-3任一项所述地芽孢杆菌新菌种的应用，其特征在于，该新菌种用于易腐有机废弃物的好氧发酵。9.一种如权利要求1-3任一项所述地芽孢杆菌新菌种的应用，其特征在于，该新菌种用于处理含大量易降解有机物的高温废水。10.根据权利要求9所述的一种地芽孢杆菌新菌种的应用，其特征在于，高温废水的温度范围为70-90℃。

技术总结

本发明涉及一种地芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。识别为嗜热地芽孢杆菌CX412的地芽孢杆菌属的一个菌种，被称为Geobacillus sp.CX412，分离自火山喷发形成的热泉周围的土壤，保藏号CGMCC No.22926，经过鉴定表明属于典型的新菌种。本发明所提供的嗜热地芽孢杆菌新菌种能在高温好氧环境中(70-90℃)生长繁殖，是一种极端嗜热菌种。该新种具有良好的热稳定性，可在高温环境实现对多糖和氨基酸的高强度代谢，可应用于易腐有机物的好氧发酵来生产有机肥料、处理易降解有机高温废水等，具有广阔的市场前景。广阔的市场前景。广阔的市场前景。