一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物及其应用

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1.本发明属于食品加工技术领域，具体地，涉及一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物及其应用。

背景技术：

2.高脂血症的发病率正日渐增高，且呈年轻化趋势高胆固醇血症是冠状动脉粥样硬化、心肌梗死、脑卒中等多种心脑血管疾病的直接诱因，而心血管疾病每年的致死率均高于其他疾病因素，已成为全球死亡的主要原因。动脉粥样硬化主要是由于血清胆固醇异常升高，低密度脂蛋白胆固醇等脂质颗粒在动脉血管壁的沉积所致。
3.胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病。据报道，很多胰岛素靶器官或组织的病变，包括高血压、2型糖尿病、肥胖以及慢性肾脏病等，其疾病发生和进展的机制都与胰岛素抵抗及其信号调控途径紊乱有关。
4.目前，临床上常以他汀类药物高胆固醇血症，主要通过抑制羟甲基戊二酰辅酶a还原酶活性，阻断人体细胞里的羟甲戊酸的代谢途径，减少总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的合成，加速血清内的胆固醇清理速度，抑制肝脏中载脂蛋白的合成，从而起到降脂保护心血管的作用。临床上缓解胰岛素抵抗的药物主要是:曲格列酮、吡格列酮等二酮类化合物，还有最近新发现的二甲双胍和维生素类。通过促进胰岛素分泌、增强胰岛素信号活性来提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。如日本专利号jp4433496b2，发明名称为“抑制atp柠檬酸裂解酶表达的药物组合物及其用途”，公开提供一种抑制atp-柠檬酸裂解酶表达的药物组合物，该药物组合物包含当施用到活体内时抑制atp-柠檬酸裂解酶表达的化合物。当给药至活体内时，抑制atp-柠檬酸裂解酶表达的化合物的实例包括胰岛素分泌促进剂，例如那格列奈。该药物组合物有效预防，改善和代谢综合征，特别是与脂质代谢错误有关的肝脏疾病，例如脂肪肝和nash。但是，长期服用上述药物，会对肝脏产生一定程度的毒副作用。因此，无毒副作用的具有缓解高胆固醇和胰岛素抵抗的活性成分是功能性食品研发的重要方面。且兼具降血糖、降血脂等活性作用的食品还鲜有存在。
5.中国专利申请公布号cn113549574 a，发明名称为“一种凝结芽孢杆菌及其应用”，公开了一株凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)bc2000，该菌株具有耐高温、耐胆盐、耐酸性、储存稳定性好、产乳酸、产酶丰富、可降解亚硝酸盐、抑制病原菌生长、能降解多种真菌毒素等多种优良特性。欧洲专利公开号ep2303252a1，发明名称为“compounds for the treatment of metabolic syndrome and insulin resistance”，公开了一种包含鞣花酸部分的化合物，例如鞣花酸本身、鞣花单宁和鞣花酸糖苷，以及包含它们的植物提取物，用于或预防代谢综合征或非糖尿病胰岛素抵抗。是浆果、水果和坚果种类，优选覆盆子、黑莓、云莓、北极荆棘、草莓、石榴、核桃或橡树的提取物。

技术实现要素：

6.1、要解决的问题
7.针对现有技术中应用于缓解高胆固醇血症或胰岛素抵抗的药物大多通过促进胰岛素分泌、增强胰岛素信号活性来提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，但长期服用，会对肝脏产生毒副作用的技术问题，本技术提供一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，包括凝结芽孢杆菌bacillus coagulans bc2000和鞣花酸，所述组合物能维持肠道微生物落平衡，缓解高胆固醇血症，预防肥胖等慢性疾病；且能减少肝脏脂肪累积，降低胰岛素抵抗水平，改善炎症。本技术还提供了一种所述组合物的应用，可应用于食品、保健品和药品中。
8.2、技术方案
9.为达到上述目的，提供的技术方案为：
10.本技术的一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，所述组合物包括凝结芽孢杆菌和鞣花酸；所述凝结芽孢杆菌为bacillus coagulans bc2000，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21621。
11.进一步地，所述凝结芽孢杆菌为活细菌、失活的细菌、含有发酵产物或代谢产物的一种或几种。
12.进一步地，所述鞣花酸提取自核桃或石榴的一种或几种。
13.进一步地，所述组合物中凝结芽孢杆菌的活菌数或芽孢数不低于1
×
104cfu、1
×
104个细胞/ml或1
×
104个细胞/g。
14.进一步地，所述鞣花酸不低于200mg/g组合物量。
15.优选的，所述鞣花酸以不低于5mg/kg体重的日剂量提供给人。
16.一种所述组合物的应用，将所述组合物应用于缓解高胆固醇血症或胰岛素抵抗。
17.优选的，所述应用包括降低血液总胆固醇、缓解肝脏脂肪累积、改善机体的胰岛素抵抗或预防高脂饮食引起血液炎性细胞因子升高。
18.目标人：肥胖人、血脂代谢紊乱人或胰岛素抵抗指数升高人。
19.进一步地，将所述组合物应用于食品、保健品和药品中。
20.优选的，所述食品包括混合坚果、乳制品、豆制品、果蔬制品、饮料、软糖或果冻。
21.优选的，所述药品包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、油剂或液体。
22.进一步地，所述食品、保健食品和药品中还包含辅料。
23.优选的，所述辅料包括填充剂、食用香精、甜味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、或营养强化剂中的一种或几种。
24.3、有益效果
25.采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
26.(1)本发明的一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，包括凝结芽孢杆菌bacillus coagulans bc2000和鞣花酸，所述组合物能维持肠道菌平衡，缓解高胆固醇血症，预防肥胖等慢性疾病；且能减少肝脏脂肪累积，降低胰岛素抵抗水平，改善炎症。所述组合物食用可以改善高脂饮食诱导引起的肥胖；可以降脂、改善高脂饮食诱导小鼠的血脂水平；可以改善高脂饮食诱导小鼠的胰岛素水平，缓解胰岛素抵抗。
27.(2)本发明的一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物的应用，将所述组合物应用于缓解高胆固醇血症或胰岛素抵抗。可应用于食品、保健品和药品中，应用广泛，适合不同
的食用场景。
附图说明
28.图1实验过程小鼠体重变化。结果表示为平均值
±
标准差，
*
表示与lfd组存在显著性差异，
#
表示与hfd组存在显著性差异。
29.图2小鼠肝脏切片h&e染(a)和油红o染(b)及脂滴面积(c)。不同字母表示差异显著，p＜0.05。
30.图3小鼠血浆总胆固醇(a)、总甘油三酯(b)、低密度脂蛋白胆固醇(c)和高密度脂蛋白胆固醇(d)。结果表示为平均值
±
标准差，不同字母表示差异显著，p＜0.05。
31.图4小鼠血浆胰岛素水平(a)和胰岛素抵抗指数(b)。结果表示为平均值
±
标准差，不同字母表示差异显著，p＜0.05。
具体实施方式
32.为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
33.生物材料保藏
34.凝结芽孢杆菌bc2000，分类命名为凝结芽孢杆菌bacillus coagulans，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21621，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
35.所述凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)bc2000是来源于东北泡菜，具有耐高温、耐高压、耐酸、耐胆盐的特性。凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)bc2000需要在ph5.2左右的酸性环境才会萌发，经过人体胃酸环境(2.0左右)可以有更高的存活率。
36.所述凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)bc2000在mrs琼脂培养基上的菌落为圆形、光滑、白，直径约1mm。
37.凝结芽孢杆菌bc77，分类命名为凝结芽孢杆菌bacillus coagulans，已于2021年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2021497，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
38.实验例1
39.凝结芽孢杆菌冻干粉的制备
40.细菌发酵液离心，获得的菌泥用生理盐水复溶至25升，并搅拌均匀至没有块状颗粒，加入2kg淀粉搅拌均匀，转移至冻干机于-40℃冻干至水分小于5％，静置20min后取出物料备用。
41.实验例2
42.动物饲养与分组
43.将60只雄性c57bl/6j小鼠，适应性喂养一周后，将小鼠随机分为5组(n＝12)：低脂饮食(lfd)，高脂饮食(hfd)，高脂饮食+鞣花酸(hfd+ea)，高脂饮食+鞣花酸+凝结芽孢杆菌bc77(hfd+ea+bc77)，高脂饮食+鞣花酸+凝结芽孢杆菌bc2000(hfd+ea+bc2000)。鞣花酸剂量为每千克高脂饲料0.3g(饲料配方见表1)，凝结芽孢杆菌bc2000和凝结芽孢杆菌bc77剂量为1
×
108cfu/只
·
天，持续喂养10周，所有小鼠自由饮水和饮食。每周测量小鼠的体质量。在实验结束前，小鼠被禁食16h，麻醉处死前测量空腹血糖水平。
44.表1各组动物饲料配方(g/kg)
[0045][0046][0047]
实施例3
[0048]
组织学和血生化分析
[0049]
在实验结束后，小鼠麻醉处死，收集血样并在1,500
×
g和4℃下离心10min，参照试剂盒说明书进行总胆固醇(tc)、总甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、胰岛素水平的检测。
[0050]
用4％多聚甲醛固定新鲜的肝脏和睾丸脂肪组织，并嵌入石蜡中。准备5μm厚的组织切片进行苏木精和伊红(h&e)以及油红o染。在正置的光学显微镜下进行病理组织学观察。
[0051]
所有数据以平均值
±
标准差(sd)表示，数据绘图用graphpad prism 8.0(graphpad software.，美国)。使用spss软件20.0版(spss公司，美国)进行单因素方差分析(anova)和tukey多重比较检验进行统计学分析，p《0.05或p《0.01，表示在统计学意义上具有差异。
[0052]
实验结果如下：
[0053]
1.凝结芽孢杆菌bc2000和鞣花酸联合食用对高脂饮食诱导小鼠体重的影响
[0054]
如附图1所示，高脂饲料喂养4周后，与lfd组相比，hfd组小鼠体重显著增加(p＜0.05)直到实验结束，高脂饮食诱导的小鼠体重是低脂饮食的1.2倍。喂养9周后，与hfd组相比，hfd+ea+bc77组体重显著降低(p＜0.05)。实验过程中，hfd+ea+bc2000喂养没有引起小鼠肥胖。
[0055]
2.凝结芽孢杆菌bc2000和鞣花酸对高脂诱导小鼠肝脏脂肪沉积的影响
[0056]
喂食高脂肪饮食的小鼠he肝脏切片可见炎性细胞浸润和脂质空泡化(图2-a)。肝脏油红o染结果显示(图2-b)，hfd组小鼠肝脏脂肪着明显,可见大量的脂肪滴，相同视
野范围内hfd组肝脏中的脂滴面积百分比显著高于其他组，喂食ea可以显著降低脂质积聚(p＜0.05，图2-c)。
[0057]
3.凝结芽孢杆菌bc2000和鞣花酸对高脂诱导小鼠血脂的影响
[0058]
如附图3所示，高脂饲料喂养10周后，小鼠血清tg、tc、ldl-c水平显著升高(p＜0.05)。补充鞣花酸喂食可显著减低小鼠血清tg浓度(p＜0.05)。与hfd+ea组相比，补充凝结芽孢杆菌bc2000可显著降低小鼠血清tc、ldl-c水平(p＜0.05)。但hdl-c无显著性差异。凝结芽孢杆菌bc2000和鞣花酸联合食用可以降低血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平，提高高密度脂蛋白胆固醇含量。说明凝结芽孢杆菌bc2000和鞣花酸联合食用可以降脂、调节血脂水平，且协同作用效果优于鞣花酸。
[0059]
4.凝结芽孢杆菌bc2000和鞣花酸对高脂诱导小鼠胰岛素的影响
[0060]
如附图4所示，与hfd+ea组相比，添加凝结芽孢杆菌bc2000可以显著降低胰岛素水平，相应的胰岛素抵抗指数也显著降低到接近正常水平(p＜0.05)。表明凝结芽孢杆菌bc2000和鞣花酸联合食用可改善高脂诱导小鼠的胰岛素水平，缓解胰岛素抵抗。且协同作用效果优于鞣花酸。
[0061]
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：

1.一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，其特征在于：所述组合物包括凝结芽孢杆菌和鞣花酸；所述凝结芽孢杆菌为bacillus coagulans bc2000，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21621。2.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌为活细菌、失活的细菌、含有发酵产物或代谢产物的一种或几种。3.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，其特征在于：所述鞣花酸包含但不限于提取自核桃或石榴的一种或几种。4.根据权利要求1-3任一项所述的一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，其特征在于：所述组合物中凝结芽孢杆菌的活菌数或芽孢数不低于1
×
104cfu、1
×
104个细胞/ml或1
×
104个细胞/g。5.根据权利要求1-3任一项所述的一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，其特征在于：所述鞣花酸不低于200mg/g组合物量。6.一种权利要求1-5任一项所述组合物的应用，其特征在于：将所述组合物应用于缓解高胆固醇血症或胰岛素抵抗。7.根据权利要求6所述的组合物的应用，其特征在于：将所述组合物应用于食品、保健品和药品中。8.根据权利要求7所述的组合物的应用，其特征在于：所述食品、保健食品和药品中还包含辅料。

技术总结

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物及其应用，属于食品加工技术领域。针对现有技术中应用于缓解高胆固醇血症或胰岛素抵抗的药物大多通过促进胰岛素分泌、增强胰岛素信号活性来提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，但长期服用，会对肝脏产生毒副作用的技术问题，本申请提供一种凝结芽孢杆菌联合鞣花酸的组合物，包括凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC2000和鞣花酸，所述组合物能维持肠道菌平衡，缓解高胆固醇血症，预防肥胖等慢性疾病；且能减少肝脏脂肪累积，降低胰岛素抵抗水平，改善炎症。本申请还提供了一种所述组合物的应用，可应用于食品、保健品和药品中。保健品和药品中。保健品和药品中。