一种猪小肠类器官2D培养模型的建立方法

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一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法
技术领域
1.本发明属于动物组织学技术领域。具体涉及一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法。

背景技术：

2.近十年来，类器官技术作为一个整体技术领域系统地在生物学、医学等多个研究学科得以应用，基于其自组织能力，收获具有诱导形成多功能器官能力的干细胞可以体外形成结构和功能与体内对应物相似的3d结构(juan he，et al.organoid technology for tissue engineering.journal of molecular cell biology.2020，12(8)：569-579.)。类器官培养技术在肠道研究中的应用十分广泛。肠道干细胞在合适地体外培养条件下，最初形成具有单个中央内腔的囊状空泡结构，干细胞进一步分裂增殖产生过渡扩增细胞，囊腔也随之向外扩展形成芽状凸起，过渡扩增细胞经过4-5次分裂后产生肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞等多种终末端分化细胞，使囊状结构呈现出芽特征，5-7天后形成典型的包含所有肠道上皮细胞类型和完整隐窝-绒毛结构的类器官结构(akkerman n，et al.dawn of the organoid era.bioessays.2017，39(4).)。已有研究优化了类器官体外培养的方法，论证了体外长期培养的可能性，至少可以连续传代1年半以上仍保持遗传性质的稳定(sugimoto s，et al.establishment of 3d intestinal organoid cultures from intestinal stem cells.methods in molecular biology.2017，1612：97.)。肠道类器官不仅在细胞谱系组成上与肠上皮组织高度相似，其功能特性也与来源组织保持高度一致(foulke-abelj，et al.human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.gastroenterology.2016，150(3)：638-649)。由此可见，小肠类器官这一全新技术的引入，必将深化我们对生物活性物质对肠粘膜屏障功能调控的认识，为研究营养物质的肠道健康改善功能提供新的思路也将为个体化的精准营养及代谢研究奠定理论及实践基础。
3.在营养对肠道健康影响领域相关研究中，类器官模型与多个学科交叉应用发挥作用。类器官最显著的特点就是其强大的自我更新能力以及与体内微环境的高度相似性(高云等.肠类器官的研究与应用.国际消化病杂志.2017，37(2)：87-91)。其此类特点的优势，类器官体外培养技术发展迅速。虽然基于啮齿类动物、犬等动物模型开展肠道营养生物学的研究已取得重大进展，但由于上述动物与人类之间在解剖结构和生理特性方面明确差异的存在限制了这些模型的应用(beumer j，et al.regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration.development.2016，143(20)：3639-3649)。例如小鼠模型缺乏代表人类胃肠道疾病的关键临床症状和病理变化，从而限制了用小鼠为模型开展临床营养学研究；而犬类也由于社会伦理问题，在相关研究中的使用也被广泛限制(sara rahmani，et al.intestinal organoids：a new paradigm for engineering intestinal epithelium in vitro.biomaterials.2019，194)。相比较而言，猪是一种相对可靠的动物模型，其优点在于猪与人类肠道生理特点与解剖特征的相
似性(koopmans，sietse jan，schuurman，teun.considerations on pig models for appetite，metabolic syndrome and obese type 2diabetes：from food intake to metabolic disease[j].european journal of pharmacology.2015，759：231-239)。因此，猪肠道类器官结合了上述体内外研究模型的优势。目前，已经研究开发出较完整的猪肠道类器官培养方法但该培养方法形成的类器官在一些模拟真实肠道环境的应用中仍然存在一定的不足。
[0004]
肠道类器官3d培养模型是研究组织成体干细胞生长分化以及器官形成的新兴体外研究系统，是肠道生物学研究领域里程碑式的研究成果。但是，3d化培养的肠道类器官由于其肠腔面被包裹在球形结构的腔体内侧，阻碍了其与外界环境的接触，导致对肠道营养健康的研究受阻，此外，3d培养类器官的内腔会积聚来自细胞更新的碎片，其可结合或阻碍注射物质与顶膜的相互作用，从而对整个类器官的培养造成影响。所以，优化培养程序并形成更方便操作的体外类器官应用模型具有一定现实意义，也正是本文所解决的技术问题。

技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是建立一种稳定的猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，首先获取可传代的猪小肠类器官、制备猪小肠类器官组织悬液，再培养形成猪小肠类器官2d生长模型。
[0006]
本技术是通过以下技术措施来实现的：一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，包括：获取可传代的猪小肠类器官：无菌采集来自猪空肠中段约5～10cm，经过两次清理至上清液澄清；吸去上清液，将肠段转移至含有30ml 8mm edta-pbs溶液中，平放于冰上摇动40min，去除上清液，加入新的30ml 8mm edta-pbs溶液，再次冰上摇动40min，吸去edta溶液，用30ml pbs晃动清洗，置于冰上让肠组织块通过重力沉降，去上清，重复此过程1～2次；将沉淀转移至15ml离心管中，于5ml dmem/f12(含10％fbs，1％三联抗生素)培养基中重悬沉淀，取3-5μl镜检计数隐窝数量；在4℃下500g离心5min后，弃去上清液，将沉淀与基质胶matrigel均匀混合，按20μl/孔的量点于48孔板中；将48孔细胞培养板转移到二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2条件下孵育15min，至matrigel固化；待matrigel固化后，加入预热的200μl/孔完全培养基；将其置于37℃培养箱中继续培养，每隔2-3天更换一次新鲜培养基；每5-7天根据生长情况进行传代；
[0007]
制备猪小肠类器官组织悬液：将培养的猪类器官在生长至可传代的时候，吸去培养基，每孔加入500μl预冷的pbs，室温下孵育1min；移液吸取pbs将肠类器官混匀，转移至15ml离心管中；每孔加1ml pbs冲洗，加入同一15ml离心管中；4℃下200g离心5min，弃去上清液；根据细胞量加入适量trypl e，37℃水浴5min，期间每隔2min摇晃一次；加入适量dmem/f12(含10％fbs)培养基终止消化；室温500g离心5min，弃去上清液；加入适量培养基吹打，得到猪小肠类器官组织悬液；
[0008]
建立猪小肠2d模型：将制备好的猪小肠类器官组织悬液接到铺好胶的细胞培养板表面或加入细胞培养板中，形成猪小肠类器官2d单层。
[0009]
作为优选，采用matrigel铺胶法建立猪小肠2d模型，具体包括：
[0010]
(1)将matrigel和冰浴pbs按1∶100比例稀释后用于包被48孔细胞培养板；
[0011]
(2)每孔加入100μl基质胶用于孔板的包被；
[0012]
(3)滴入100μlpbs，将其压在matrigel上层；
[0013]
(4)在37℃二氧化碳细胞培养箱中静置2h，待基质胶凝固后吸出pbs；
[0014]
(5)加入pbs，在37℃二氧化碳培养箱中静置5min，重复三次；
[0015]
(6)加100μlpbs到孔中，在37℃二氧化碳培养箱静置备用；
[0016]
(7)取适量制备好的猪小肠类器官组织悬液按照约104个/ml的密度接到铺好胶的48孔细胞培养板表面，静置培养于37℃细胞培养箱，最终汇合成2d单层细胞。
[0017]
作为优选，所述matrigel和冰浴pbs的比例为1∶20。
[0018]
作为优选，采用transwell法建立猪小肠2d模型，具体包括：(1)将已经制备好的猪小肠类器官组织悬液按照2
×
104个/孔加入嵌套transwell嵌套的24孔细胞培养板中；(2)置于细胞二氧化碳培养箱中培养约3天，每隔24h测量一次电阻并换液，观察电阻值变化情况；(3)培养至猪小肠类器官2d单层培养物形成。
[0019]
作为优选，所述采用transwell法建立猪小肠2d培养模型，通过透射电镜观察细胞结构，具体包括：a.将接种了猪小肠类器官并经过3天培养后的transwell膜用pbs润洗两次，用刀片割下该transwell膜，置于戊二醛溶液(2.5％)中，4℃固定过夜；b.吸弃掉固定液，加入0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)漂洗膜，重复三次，每次15min；c.加入1％的锇酸溶液固定样品1-2h；d.吸出锇酸废液，加入足量的0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)漂洗膜三次，每次15min；e.准备浓度分别为30％、50％、70％、80％的乙醇溶液依次浸没样品15min，使样品脱水，此后，再将样品依次浸入90％和95％的丙酮溶液中，分别浸泡15min；最后，将样品置于纯丙酮中20min，重复进行一次；等待过程中，为使其脱水完全，需适度振荡样品；f.将样品置于spurr包埋剂∶丙酮＝1∶1(体积比)的混合液中浸泡1h；g.将样品置于spurr包埋剂∶丙酮＝3∶1(体积比)的混合液中浸泡3h；h.将样品置于纯包埋剂中，室温过夜；i.包埋、切片及染观察：将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品，样品在leica em uc7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染5-10min，在hitachi h-7650型透射电镜中观察。
[0020]
作为优选，将所述获取可传代的猪小肠类器官的方法和/或制备猪小肠类器官组织悬液的方法应用于猪肠道类器官的相关研究。
[0021]
作为优选，将所述采用matrigel铺胶法建立猪小肠2d培养模型和/或采用transwell法建立猪小肠2d培养模型的方法应用于猪肠道类器官的相关研究。
[0022]
本技术的有益效果：本技术改变了猪肠道类器官单层获得方法，将传统的机械解离改变为酶法解离，有利于保持细胞的完整性；利用细胞2d(二维)培养有助于减小3d培养过程中由于内腔积聚的碎片阻碍注射物质与顶膜相互作用的影响；利用2d小肠类器官模型使生物活性物质的功能性研究更加符合真实生理情况，能为高通量的营养素筛选和生物活性物质功能鉴定提供更为简易、方便的操作，弥补了3d肠道类器官肠腔面无法与培养环境直接接触，导致对肠道营养与健康相关研究可行性差的问题。
附图说明
[0023]
附图用来提供对本技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本技术，并不构成对本技术的限制。在附图中：
[0024]
图1为猪小肠类器官接板培养三天的光镜图；
[0025]
图2为透射电镜观察培养三天的猪小肠类器官2d单层微观形态。
具体实施方式
[0026]
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0027]
本发明的一种获取可传代的猪小肠类器官，包括如下步骤：
[0028]
(1)无菌采集猪空肠中段约5～10cm，置于预冷的pbs(含1％三联抗生素)并置于冰上作为实验肠段一待用；
[0029]
(2)将实验肠段一转移至含10ml pbs(含1％三联抗生素)的平皿中，去除肠段外表面附着的结缔组织，用10ml注射器清洗肠段内腔，将肠段纵向剥开，用无菌的载玻片刮去肠段中的内容物，再用pbs(含1％三联抗生素)冲洗后转移至超净工作台；
[0030]
(3)将肠段转入装有30ml pbs的无菌离心管中，颠倒清洗肠段，待肠组织自然沉降后，吸去上清液，再次加入30ml pbs重复上述步骤，直至上清液澄清；
[0031]
(4)将肠段转移至盛有10ml pbs的无菌培养皿中，用无菌载玻片轻刮表面去除残留内容物，将肠段剪成长约2mm左右作为实验肠段二；
[0032]
(5)将实验肠段二转移至装有30ml pbs的无菌离心管中，颠倒清洗肠段至上清液澄清；
[0033]
(6)吸去上清液，将肠段二转移至30ml含8mm edta的pbs溶液中，平放于冰上摇动40min，去除上清液，加入新的30ml含8mm edta的pbs溶液，再次冰上摇动40min，吸去edta溶液，用30ml pbs晃动清洗，置于冰上使肠组织块通过重力沉降，去上清，重复此过程1～2次；
[0034]
(7)将沉淀的肠组织块转移至新的无菌15ml离心管中，于5ml dmem/f12(含10％fbs，1％三联抗生素)培养基中重悬，取3-5μl镜检计数单个隐窝数量；
[0035]
(8)4℃下500g离心5min后，弃去上清液，将沉淀与matrigel均匀混合，按20μl/孔的量点于48孔细胞培养板中；
[0036]
(9)将48孔细胞培养板转移到二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2条件下孵育15min，至基质胶matrigel固化；
[0037]
(10)待matrigel固化后，按照200μl/孔的量加入预热的200μl/孔完全培养基；将其置于37℃培养箱中继续培养，每隔2-3天更换一次新鲜培养基；每5-7天根据生长情况进行传代。
[0038]
一种猪小肠类器官组织悬液制备方法，包括如下步骤：
[0039]
(1)待培养的猪小肠类器官生长至可传代状态，吸去培养基，每孔加入500μl预冷的pbs，室温下孵育1min；
[0040]
(2)移液吸取pbs将小肠类器官混匀，转移至15ml离心管中；
[0041]
(3)每孔加1ml pbs冲洗，加入同一15ml离心管中；
[0042]
(4)4℃下200g离心5min，弃去上清液；
[0043]
(5)根据细胞量加入适量trypl e，37℃水浴5min，期间每隔2min摇晃一次；
[0044]
(6)加入适量dmem/f12(含10％fbs)培养基终止消化；
[0045]
(7)室温500g离心5min，弃去上清液；
[0046]
(8)加入适量培养基吹打，得到猪小肠类器官组织悬液。
[0047]
本发明的两种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，分别包括如下步骤：
[0048]
matrigel铺胶法：
[0049]
(1)将matrigel和冰浴pbs按1∶100比例稀释后用于包被48孔细胞培养板；
[0050]
(2)每孔加入100μl基质胶用于孔板的包被；
[0051]
(3)滴入100μl pbs，将其压在matrigel上层；
[0052]
(4)在37℃二氧化碳细胞培养箱中静置2h，待基质胶凝固后吸出pbs；
[0053]
(5)加入pbs，在37℃二氧化碳培养箱中静置5min，重复三次；
[0054]
(6)加100μl pbs到孔中，在37℃二氧化碳培养箱静置备用；
[0055]
(7)取适量制备好的猪小肠类器官组织悬液按照约104个/ml的密度接到铺好胶的48孔细胞培养板表面，静置培养于37℃细胞培养箱，通常约72h可汇合成2d单层细胞。
[0056]
其中，matrigel和冷pbs的比例确定：将猪小肠类器官传代后的单细胞悬液接板于三种不同的matrigel铺胶比例中，分别为1∶10、1∶15、1∶20。
[0057]
由图1d可知，在肠类器官组织悬液接板三天后，铺胶比例为1∶10的实验组没有形成单层膜结构，而是出现了3d类器官的结构，说明按照1∶10铺胶比例过厚，从而导致细胞趋向于类器官3d生长方式；而铺胶比例为1∶15和1∶20的实验组中铺胶厚度较为合适，培养三天后，均能形成单层上皮样结构，由图1e和图1f可知，在1∶20的铺胶比例下，单层汇合度高于1∶15铺胶时的汇合度。因此，采用matrigel∶pbs比例为1∶20进行铺胶，采用继续培养三天后汇合形成的猪小肠类器官2d单层培养物进行研究。
[0058]
transwell法：
[0059]
(1)将已经制备好的猪小肠类器官组织悬液按照2
×
104个/孔加入transwell嵌套的24孔细胞培养板中；
[0060]
(2)置于细胞培养箱中培养约3d，每隔24h测量一次电阻并换液，观察电阻值变化情况；
[0061]
(3)待猪小肠类器官2d单层培养物形成后即可进行后续鉴定和分析。
[0062]
采用透射电镜观察2d单层培养物结构的步骤：
[0063]
①
将接种了猪小肠类器官并经过3天培养后的transwell膜用pbs润洗两次，用刀片割下该transwell膜，置于戊二醛溶液(v/v＝2.5％)中，4℃固定过夜；
[0064]
②
吸弃掉固定液，加入0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)漂洗膜，重复三次，每次15min；
[0065]
③
加入锇酸溶液(v/v＝1％)固定样品1-2h；
[0066]
④
吸出锇酸废液，加入足量的0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)漂洗样品三次，每次15min；
[0067]
⑤
准备浓度分别为30％、50％、70％、80％的乙醇溶液依次浸没样品15min，使样品脱水。此后，再将样品依次浸入90％和95％的丙酮溶液中，分别浸泡15min；最后，将样品置于纯丙酮中20min，重复进行一次；等待过程中，为使其脱水完全，需适度振荡样品；
[0068]
⑥
将样品置于spurr包埋剂∶丙酮＝1∶1(体积比)的混合液中浸泡1h；
[0069]
⑦
再将样品置于spurr包埋剂∶丙酮＝3∶1(体积比)的混合液中浸泡3h；
[0070]
⑧
将样品置于纯包埋剂中，室温过夜；
[0071]
⑨
包埋、切片及染观察：用包埋剂将经过上述渗透处理的样品包埋起来，70℃静
置过夜，即可得到包埋好的样品。
[0072]
利用leica em uc7型超薄切片机对样品进行切片，获得70-90nm的切片，将其用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染5-10min，后续即可在hitachi h-7650型透射电镜中观察类器官形成的2d化单层细胞。
[0073]
观察结果：利用透射电镜观察培养约三天后的猪小肠类器官2d单层培养物的微观形态，结果如图2所示。从图中可以清晰地观察到，猪小肠类器官2d单层已经分化出肠绒毛及紧密连接结构，图中箭头所指的部分即为细胞间的紧密连接结构，而圈出的边缘位置则为肠绒毛结构。
[0074]
显然，本领域的技术人员可以对本技术进行各种改动和变型而不脱离本技术的精神和范围。这样，倘若本技术的这些修改和变型属于本技术权利要求及其等同技术的范围之内，则本技术也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，包括：获取可传代的猪小肠类器官：无菌采集来自猪空肠中段约5～10cm，经过两次清理至上清液澄清；吸去上清液，将肠段转移至含有30ml 8mm edta-pbs溶液中，平放于冰上摇动40min，去除上清液，加入新的30ml 8mm edta-pbs溶液，再次冰上摇动40min，吸去edta溶液，用30ml pbs晃动清洗，置于冰上让肠组织块通过重力沉降，去上清，重复此过程1～2次；将沉淀转移至15ml离心管中，于5ml dmem/f12(含10％fbs，1％anti-anti)培养基中重悬沉淀，取3-5μl镜检计数隐窝数量；在4℃下500g离心5min后，弃去上清液，将沉淀与基质胶matrigel均匀混合，按20μl/孔的量点于48孔板中；将48孔细胞培养板转移到二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2条件下孵育15min，至matrigel固化；待matrigel固化后，加入预热的200μl/孔完全培养基；将其置于37℃培养箱中继续培养，每隔2-3天更换一次新鲜培养基；每5-7天根据生长情况进行传代；制备猪小肠类器官组织悬液：将培养的猪类器官在生长至可传代的时候，吸去培养基，每孔加入500μl预冷的pbs，室温下孵育1min；移液吸取pbs将肠类器官混匀，转移至15ml离心管中；每孔加1ml pbs冲洗，加入同一15ml离心管中；4℃下200g离心5min，弃去上清液；根据细胞量加入适量trypl e，37℃水浴5min，期间每隔2min摇晃一次；加入适量dmem/f12(含10％fbs)培养基终止消化；室温500g离心5min，弃去上清液；加入适量培养基吹打，得到猪小肠类器官组织悬液；建立猪小肠2d模型：将制备好的猪小肠类器官组织悬液接到铺好胶的细胞培养板表面或加入细胞培养板中，形成猪小肠类器官2d单层。2.根据权利要求1所述的一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，采用matrigel铺胶法建立猪小肠2d模型，具体包括：(1)将matrigel和冰浴pbs按1∶100比例稀释后用于包被48孔细胞培养板；(2)每孔加入100μl基质胶用于孔板的包被；(3)滴入100μl pbs，将其压在matrigel上层；(4)在37℃二氧化碳细胞培养箱中静置2h，待基质胶凝固后吸出pbs；(5)加入pbs，在37℃二氧化碳培养箱中静置5min，重复三次；(6)加100μl pbs到孔中，在37℃二氧化碳培养箱静置备用；(7)取适量制备好的猪小肠类器官组织悬液按照约104个/ml的密度接到铺好胶的48孔细胞培养板表面，静置培养于37℃细胞培养箱，最终汇合成2d单层细胞。3.根据权利要求2所述的一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，所述matrigel和冰浴pbs的比例为1∶20。4.根据权利要求1所述的一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，采用transwell法建立猪小肠2d模型，具体包括：(1)将已经制备好的猪小肠类器官组织悬液按照2
×
104个/孔加入嵌套transwell嵌套的24孔细胞培养板中；(2)置于细胞二氧化碳培养箱中培养约3天，每隔24h测量一次电阻并换液，观察电阻值变化情况；(3)培养至猪小肠类器官2d单层培养物形成。5.根据权利要求4所述的一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，所述
采用transwell法建立猪小肠2d模型，通过透射电镜观察细胞结构，具体包括：a.将接种了猪小肠类器官并经过3天培养后的transwell膜用pbs润洗两次，用刀片割下该transwell膜，置于戊二醛溶液(2.5％)中，4℃固定过夜；b.吸弃掉固定液，加入0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)漂洗膜，重复三次，每次15min；c.加入1％的锇酸溶液固定样品1-2h；d.吸出锇酸废液，加入足量的0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)漂洗膜三次，每次15min；e.按照浓度(30％，50％，70％，80％)的乙醇溶液进行梯度洗脱，每种浓度处理15min，此后，依次过渡到90％和95％的丙酮溶液中，分别浸泡15min；最后样品浸没于纯丙酮中20min共两次；等待过程中，为使其脱水完全，需振荡样品；f.将样品置于spurr包埋剂∶丙酮＝1∶1(体积比)的混合液中浸泡1h；g.将样品置于spurr包埋剂∶丙酮＝3∶1(体积比)的混合液中浸泡3h；h.将样品置于纯包埋剂中，室温过夜；i.包埋、切片及染观察：将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品，样品在leica em uc7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染5-10min，在hitachi h-7650型透射电镜中观察。6.根据权利要求1所述的一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，将所述获取可传代的猪小肠类器官的方法和/或制备猪小肠类器官组织悬液的方法应用于猪肠道类器官的相关研究。7.根据权利要求2所述的一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，将所述采用matrigel铺胶法建立猪小肠2d培养模型的方法应用于猪肠道类器官的相关研究。8.根据权利要求4或5所述的一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法，其特征在于，将所述采用transwell法建立猪小肠2d培养模型的方法应用于猪肠道类器官的相关研究。

技术总结

本申请公开了一种稳定的猪小肠类器官2D培养模型的建立方法，首先获取可传代的猪小肠类器官、制备猪小肠类器官组织悬液，再培养形成猪小肠类器官2D生长模型。本申请改变了猪小肠类器官单层获得方法，将传统的机械解离改变为酶法解离，有利于保持细胞的完整性；利用细胞2D二维培养有助于减小3D培养过程中由于内腔积聚的碎片，会阻碍注射物质与顶膜相互作用的影响；2D肠道类器官模型使得功能性研究更加符合真实的生理情况，能为高通量的营养素筛选和生物活性物质功能鉴定提供更为简易、方便的操作，弥补了3D肠道类器官肠腔面无法与培养环境直接接触导致肠道营养与健康相关研究可行性差的问题。性差的问题。性差的问题。