DOI:10.3877/cma.j.issn.1674⁃6880.2019.02.002
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（8170010395）；嘉兴市第一医院（启明星）资助项目（2016QMX007）；嘉兴市科技计划项目（2018AY32017）
作者单位：314001浙江嘉兴，嘉兴市第一医院麻醉科1、ICU2、中心实验室6；325000浙江温州，温州医科大学附属第二医院麻醉科3；310003杭州，浙江大学医学院附属第一医院呼吸科4；221002江苏徐州，徐州医科大学附属医院ICU5
通信作者：杨茂宪，Email：yangmaoxian2009@126 ·论著·
姜黎珊1姚明1杨茂宪2孔敏1邓厚盛3宦才娟4赵文静5沈辉6
【摘要】目的探讨内窥镜下辅助滴注脂多糖及气管暴露法滴注脂多糖诱导急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠动物模型的差异。方法32只Sprague Dawley大鼠分为EC组（内窥镜下辅助气管插管滴注等渗NaCl溶液）、EL组（内窥镜下辅助气管插管滴注脂多糖）、IC组（气管暴露法滴注等渗NaCl溶液）、IL组（气管暴露法滴注脂多糖），每组各8只。记录制作动物操作时间。滴注脂多糖24h后采集动脉测定动脉血氧分压（PaO2）及氧合指数，计算肺组织湿/干重比值（W/ D），检测支气管肺泡灌洗液
（BALF）中蛋白含量，血清中肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）、白细胞介素6
（IL⁃6），并进行弥漫性肺泡损伤（DAD）评分。结果EC组、IC组、EL组及IL组大鼠手术操作时间分别为（212±24）、（296±53）、（233±44）、（321±56）s，四组大鼠间比较，差异有统计学意义（F=9.808，P<0.001），且与IC组和IL组比较，EC组、EL组制作动物模型的操作时间均明显缩短（P均<0.05）。四组大鼠间PaO2、氧合指数、肺W/D、BALF蛋白含量、血清TNF⁃α、IL⁃6及DAD评分比较，差异均有统计学意义（F=124.752、123.920、73.775、65.922、48.342、419.548、655.623，P 均<0.001）。进一步两两比较发现，与EC组及IC组比较，EL组及IL组大鼠的PaO2[（104±10）、（105±9）、（54±3）、（53±4）mmHg]、氧合指数[（498±48）、（502±43）、（261±17）、（255±21）mmHg]均显著降低，肺W/D[（4.14±0.16）、（4.36±0.18）、（5.53±0.31）、（5.58±0.29）]、BALF蛋白含量[（0.39±0.07）、（0.34±0.05）、（2.19±0.13）、（2.15±0.11）g/L]、血清TNF⁃α[（177±38）、（186±51）、（414±61）、（440±74）ng/L]、IL⁃6[（104±11）、（113±28）、（584±42）、（603±56）ng/L]及DAD评分[（0.90±0.29）、（0.82±0.38）、（11.65±0.89）、（12.23±0.97）分]均显著升高（P均<0.05）。结论采用内窥镜下辅助气管插管滴注脂多糖能简单、有效地建立大鼠ARDS模型。
【关键词】脂多糖类；内窥镜；急性呼吸窘迫综合征；大鼠
挤爆胶囊Study on rats with acute respiratory distress syndrome induced by intratracheal instillation of lipopolysaccharide in different ways Jiang Lishan1,Yao Ming1,Yang Maoxian2,Kong Min1, Deng Housheng3,Huan Caijuan4,Zhao Wenjing5,Shen Hui6.1Department of Anesthesiology, 2Department of Intensive Care Unit,6Central Laboratory,the First Hospital of Jiaxing,Jiaxing 314001,China;3Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou325000,China;4Department of Respiration,the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou310003,China;5Department of Intensive Care Unit,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou221002,China Corresponding author:Yang Maoxian,Email:yangmaoxian2009@126
建立急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）疾病模型的方法包括脂多糖滴注法、脂多糖股静脉注射法、盐酸吸入法、海水淹溺法、油酸尾静脉注射法、盲肠结扎⁃穿孔法等[1⁃5]。脂多糖气管内滴注导致肺泡上皮细胞损伤、炎症细胞浸润、液体渗出增加、诱发顽固性低氧血症，从而模拟ARDS病理生理过程[6]。既往研究表明，经颈部皮肤切开，气管暴露法滴注脂多糖可以制作ARDS 模型，但对动物模型的体质量以及滴注速度有一定的要求，甚至在滴注过程中可能导致动物窒息[6⁃7]。颈部皮肤切开可能会引起局部皮肤感染，可能对实验结果造成影响，而经口气管插管制作ARDS模型对研究人员要求较高[8]。故本研究分别采用内窥镜下辅助气管插管滴定脂多糖与气管暴露法滴注脂多糖制作ARDS大鼠动物模型并进行比较。1材料与方法捆扎胶带
1.1实验动物选择及分组
雄性Sprague Dawley大鼠32只，体质量250~ 280g，购自徐州医科大学，按照随机数字表方法分为4组：内窥镜下辅助气管插管滴定等渗NaCl溶液组（EC组）、内窥镜下辅助气管插管滴定脂多糖组（EL组）、气管暴露法滴注等渗NaCl溶液组（IC 组）、气管暴露法滴注脂多糖组（IL组），每组各8只。
1.2实验仪器和主要试剂
i⁃STAT血气分析仪血气分析仪购自美国雅培公司，脂多糖购自美国sigma公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度试剂盒购自海门碧云天公司，白细胞介素6（interleukin⁃6，IL⁃6）酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自海门碧云天公司，肿瘤坏死因子
【Abstract】Objective To explore the rat model with acute respiratory distress syndrome (ARDS)induced by instillation of lipopolysaccharide(LPS)in endoscopic assisted endotracheal intubation and tracheal exposure.Methods Totally32Sprague Dawley rats were randomly divided into4groups:the EC group(instillation of isosmotic NaCl solution in endoscopic assisted endotracheal intubation),EL group(instillation of LPS in endoscopic assisted endotracheal intubation),IC group(insti
llation of isosmotic NaCl solution in tracheal exposure),and IL group (instillation of LPS in tracheal exposure),8rats in each group.The operation time among groups was recorded.The levels of arterial oxygen partial pressure(PaO2)and oxygenation index were detected on24hours after instillation of LPS.The wet/dry weight ratio(W/D)of pulmonary tissue,protein content of bronchoalveolar lavage fluid(BALF),levels of tumor necrosis factor alpha(TNF⁃α)and interleukin⁃6(IL⁃6)in serum,and diffuse alveolar damage(DAD)scores were estimated and compared.Results The operation time in the EC group,IC group,EL group and IL group were(212±24),(296±53),(233±44),(321±56)s,respectively.The operation time among four groups showed significant difference(F=9.808,P<0.001),and the operation time was much shorter in the EC group and EL group than in the IC group and IL group(all P<0.05).The levels of PaO2,oxygenation index,pulmonary W/D ratio,protein content of BALF,TNF⁃α,IL⁃6and DAD scores all showed significant differences among four groups(F=124.752,123.920,73.775,65.922,48.342,419.548,655.623;all P<0.001).Compared with the EC group and IC group,the levels of PaO2[(104±10),(105±9),(54±3),(53±4)mmHg]and oxygenation index[(498±48),(502±43),(261±17),(255±21)mmHg]were much lower,and the pulmonary W/D[(4.14±0.16),(4.36±0.18),(5.53±0.31),(5.58±0.29)],protein content of BALF[(0.39±0.07),(0.34±0.05),(2.19±0.13),(2.15±0.11)g/L],TNF⁃α[(177±38), (186±51),(414±61),(440±74)ng/L],IL⁃6[(104±11),(113±28),(584±42),(603±56)ng/L] and DAD scores[(0.90±0.29),(0.82±0.
38),(11.65±0.89),(12.23±0.97)]were much higher in the EL group and IL group(all P<0.05).Conclusion It is simple and effective to establish a ARDS rat model by instillation of LPS with endoscopic assisted endotracheal intubation.
【Key words】Lipopolysaccharides;Endoscopes;Acute respiratory distress syndrome;Rats
α（tumor necrosis factor⁃аlpha，TNF⁃α）ELISA试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，MULTSKAN⁃MK3酶标仪购自德国Thermo公司，FA1004型天平购自上海良平公司，OlymphusPM⁃CB购自日本奥林巴斯公司，Allegnex⁃22高速离心机购自美国Becman公司，电子内窥镜购自深圳浩特尔电子技术有限公司，气管插管购自中国新航科技有限公司。
1.3模型制备
大鼠自由活动，术前12h禁食，不禁饮。钠（50mg/kg腹腔注射）麻醉，约3~5min，大鼠翻正反射消失后，将大鼠头高脚低仰卧固定于操作台，操作台与水平面呈45°。EC组及EL组借助电子内窥镜置于大鼠口腔内，显示声门，将气管插管插入声门内。EC组气管内滴注等渗NaCl溶液2mL/kg；EL组气管内滴注脂多糖溶液2mL/kg（脂多糖4mg 溶于2mL等渗NaCl溶液中）。IC组及IL组大鼠正中切开颈前皮肤，钝性分离皮下组织，暴露气管。弯针头经环甲膜穿刺。IC组气管内滴注等渗NaCl溶液2mL/kg；IL组气管内滴注脂多糖溶液2mL/kg （脂多糖4mg溶于2mL等渗NaCl溶液中）。滴注完成后，
大鼠直立并作锥形旋转2min，促进脂多糖在肺内分布均匀。模型制备参照文献[6]。
1.4样本采集及指标检测
1.4.1模型操作时间
将大鼠固定在操作台上，将电子内窥镜置于大鼠口腔内，显示声门，将气管插管插入声门内，完成脂多糖滴定所需要时间。
1.4.2动脉血气分析
24h后，钠（50mg/kg腹腔注射）麻醉，分离大鼠股动脉，取股动脉血1mL，检测动脉血氧分压（arterial oxygen partial pressure，PaO2）及氧合指数水平。
1.4.3肺组织湿/干重比值（wet/dry weight ratio，W/D）测定
取右肺中叶组织，滤纸吸干表面水分，称湿重，将肺组织置于80℃烘箱72h至恒重，称其干重，计算肺组织W/D。
空调温度控制1.4.4支气管肺泡灌洗液（bronchoalceolar lavage fluid，BALF）中总蛋白含量测定
左肺用4℃等渗NaCl溶液行支气管肺泡灌洗，缓慢灌洗3次，依次为2、2、1mL，回收率达到85%
以上为合格。灌洗液1500r/min，离心半径80mm，离心15min。采用分光光度计测定BALF中总蛋白含量。
1.4.5血清中的TNF⁃α及IL⁃6的水平测定
取下腔静脉血，置转速3000r/min，离心半径80mm，离心15min取血清，采用ELISA法检测血清中的TNF⁃α及IL⁃6的水平。
1.4.6肺组织病理学评分
取右肺后叶，置于4%甲醛固定后，苏木素⁃伊红染，光镜下观察肺组织病理学改变。按照修正后弥漫性肺泡损伤（diffuse alveolar damage，DAD）系统进行评分，根据肺泡内纤维素渗出、肺间质水肿、肺泡内出血、肺泡内中性粒细胞浸润、肺间质内中性粒细胞聚集等5个参考指标，按照正常、轻、中、重评为0、1、2、3分。各项指标之和为弥漫性肺泡损伤评分：0分代表正常，15分代表严重损伤[9]。
1.5统计学方法
使用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x⎺±s）表示，四组间操作时间、PaO2、氧合指数、肺W/D、BALF中蛋白含量、TNF⁃α、IL⁃6及DAD评分的比较，采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK⁃q法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1一般情况
IL组大鼠滴注过程中2例出现窒息，表现为呼吸费力、口唇紫绀、四肢伸直，需要紧急停止操作，给予气管插管等抢救。EL组滴注过程中1例出现窒息，给予气管插管等抢救。所有窒息大鼠均抢救存活。24h后，EL组、IL组大鼠精神萎靡，活动减少，毛发无光泽，并出现呼吸急促、打喷嚏等情况，鼻腔内或口腔内可见血性分泌物。EC组和IC组大鼠滴注过程中未发现窒息、鼻腔内或口腔内未见血性分泌物等情况，毛发光泽，呼吸均匀。EC组、IC组、EL组及IL组大鼠手术操作时间分别为（212±24）、（296±53）、（233±44）、（321±56）s，四组大鼠间比较，差异有统计学意义（F=9.808，P<0.001），且与IC组和IL组比较，EC组、EL组制作动物模型的操作时间均明显缩短（P均<0.05）。
2.2动脉血PaO 2、氧合指数、肺W /D 、BALF 蛋白含量、血清TNF ⁃α、IL ⁃6及DAD 评分的比较四组大鼠间PaO 2、氧合指数、肺W /D 、BALF 蛋
白含量、血清TNF ⁃α、IL ⁃6及DAD 评分比较，差异均有统计学意义（F =124.752、123.920、73.775、65.922、48.342、419.548、655.623，P 均<0.001）。进一步两两比较发现，与EC 组及IC 组比较，EL 组及IL 组大鼠的PaO 2、氧合指数均显著降低，肺W /D 、BALF 蛋白含量、血清TNF ⁃α、IL ⁃6及DAD 评分均显著升高（P 均<0.05）。而EC 组与IC 组、EL 组与IL 组上述各指标间的比较，差异均无统计学意义（P 均>0.05），见表1。3
讨论
本研究发现，内窥镜下辅助气管插管滴定脂多糖，脂多糖经气道滴注后可以成功制作ARDS 大鼠动物模型，该模型在PaO 2、氧合指数、肺组织W /D 、BALF 中蛋白含量、炎症因子水平以及DAD 评分等方面与气管暴露法滴注脂多糖比较，差异均无统计学意义。
气管暴露法滴注方案，需要切开颈部皮肤，增加了继发感染的风险[10]；同时，需要分离局部的组织，增加局部的组织损伤；穿刺点也可能引起气管内出血，引起气道阻塞，甚至导致窒息的发生[11]。虽然操作者可以直接看到针头插入气管，
增加气管内滴注的准确性，但是在滴注过程中，由于液体在针尖端形成大的液滴，增加窒息风险，降低模型制作过程中动物的安全性，可能增加实验成本[12]。目前由于可视化技术的进步，在医学成像系统辅助下，进行气管插管成为可能。内窥镜下辅助气管插管法能够克服大鼠声门狭窄、口腔内位置
深、
操作视野暴露困难等问题[13]。同时该技术降低了制作动物模型过程中出现窒息的风险。由于对声门创伤小，
有利于大鼠术后早期进食，便于动物模型制作成功后长期观察。同时，由于创伤较小，对术后大鼠器官功能状态恢复影响较小，减少了非实验因素对结果的影响。本研究证实内窥镜下辅助气管插管法制作ARDS 动物模型，操作过程需要时间更短，
更加方便快捷。脂多糖滴注后，诱发局部炎症反应，在趋化因子和炎症因子的作用下，白细胞在血管壁聚集、粘附，穿过内皮细胞和上皮细胞，到达肺泡腔引起炎症反应扩大。上皮细胞和内皮细胞破坏后，富含蛋白的液体从血管内漏出至肺泡腔，
诱发肺水肿，导致气体交换障碍，引起呼吸窘迫、。肺泡内的上皮细胞和巨噬细胞参与了该过程，包括释放促炎介质TNF ⁃α、IL ⁃6等[14⁃15]。TNF ⁃α是一种致炎因子，导致肺部炎症反应，引起严重的肺损伤[16]。IL ⁃6通过诱导淋巴细胞分化成熟，进一步释放促炎细胞因子，使炎症反应放大[17⁃18]。目前制作ARDS 动物模型的方案如逆行胰胆管注射牛磺胆酸法制作急性胰腺炎诱发ARDS 模型以及盲肠结扎穿孔术制作脓毒症诱发ARDS 模型等，造模过程中均需要开腹等操作[19⁃20]；腹腔内注射百草枯可以诱发以肺组织纤维化为主要病理改变的ARDS 动物模型[21]。此外，根据不同研究的
需要，采用不同的动物，小鼠、大鼠等小动物多用于研究炎症反应过程等，而家兔和犬等大型动物多用于机械通气的研究[22⁃25]。
本研究表明，采用内窥镜下辅助气管插管滴注脂多糖能制作ARDS 大鼠模型，引起大鼠弥漫性肺损伤，诱发炎症反应，产生低氧血症。内窥镜下辅助气管插管滴注脂多糖制作ARDS 的方法创伤小，操作简单，值得进一步推广应用。
表1各组大鼠PaO 2、氧合指数、肺W /D 、BALF 蛋白含量、血清中TNF ⁃α、IL ⁃6及DAD 评分的比较（x ⎺
±s ）组别只数PaO 2
（mmHg ）氧合指数（mmHg ）W /D
BALF 中蛋白
含量（g /L ）TNF ⁃α
（ng /L ）IL ⁃6（ng /L ）DAD 评分（分）EC 组8
104±10498±48
4.14±0.160.39±0.07
177±38
104±11
0.90±0.29
IC 组
8105±9502±43 4.36±0.18
0.34±0.05186±51113±280.82±0.38EL 组8
54±3ab
261±17ab 5.53±0.31ab 2.19±0.13ab 414±61ab 584±42ab 11.65±0.89ab IL 组8
53±4ab
255±21ab
5.58±0.29ab 2.15±0.11ab 440±74ab 603±56ab 12.23±0.97ab
F 值124.752123.92073.775
65.922
48.342
419.548
655.623P 值<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
注：1mmHg =0.133kPa ；PaO 2.动脉血氧分压；W /D.湿/干重比值；BALF.支气管肺泡灌洗液；TNF ⁃α.肿瘤坏死因子α；IL ⁃6.白细胞介素
6；DAD.弥漫性肺泡损伤；EC 组表示内窥镜下辅助气管插管滴定生理盐水组；EL 组表示内窥镜下辅助气管插管滴定脂多糖组；IC 组表示气
管暴露法滴注等渗NaCl 溶液组；IL 组表示气管暴露法滴注脂多糖组；与EC 组比较，a P <0.05；与LC 组比较，b
P <0.05
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（收稿日期：2018⁃12⁃29）
（本文编辑：
马莉）
