Vol.34高等学校化学学报No.62013年6月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1475~1482 doi:10.7503/cjcu20120935
贾原媛1，万 同1，霍明明1，闫蒙蒙1，贾士儒1，陈 晗2，周余来3
(1.天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室，天津300457;2.南方医科大学，广州510515;3.吉林大学药学院，长春130021)
摘要 采用超声和高压均质两种方式分散的细菌纤维素(BC)悬浮液制备了BC 纳米纤维稳定的水包油型Pickering 乳液，并考察了纤维用量㊁pH 值和机械分散方式对乳液稳定性的影响.结果表明，乳液的稳定性随纳米纤维用量的增加而增加；碱性条件比酸性条件制备的乳液稳定性高，且在pH =12时达到最高.用高压均质方式分散的BC 稳定乳液的效果优于采用超声方式分散的BC 的效果，这是由于高压均质后的纤维较短，可以提供更多的纳米纤维稳定乳液.计算结果表明,BC 纳米纤维在液体石蜡/水界面上的三相接触角为72.5°，说明BC 适合稳定水包油型乳液.关键词 细菌纤维素;Pickering 乳液；稳定性；接触角；屈服应力；界面张力 中图分类号 O648.2 文献标志码 A
收稿日期:2012⁃10⁃15.
基金项目：国家自然科学基金(批准号:21106105)和吉林省科技发展计划项目(批准号:200905136)资助.
联系人简介：贾士儒，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物工程方面的研究.E⁃mail:jiashiru@ 传统的乳化剂主要为表面活性剂和具有表面活性的聚合物(如蛋白质㊁多糖等).20世纪初,Ramsden [1]发现胶体尺寸的固体颗粒也可以稳定乳液.随后,Pickering [2]对这种乳液体系开展了系统的研究，因而此类乳液又被称为Pickering 乳液.为使固体颗粒能够有效地稳定乳液，其中一个重要条件是固体颗粒能够被两种液体部分润湿，即颗粒具有一定的润湿性(Wettability).通常用三相接触角θ来描述颗粒的润湿性.亲水颗粒的接触角θow <90°，颗粒大部分位于水相中，易形成水包油型(O /W)乳液或亲水泡沫；疏水颗粒的三相接触角θow >90°，颗粒大部分位于油相或者空气中，易形成油包水型(W /O)乳液或气溶胶.当θow =90°时，颗粒既能被水润湿又能被油润湿.目前，公认的Pickering 乳液的稳定机理主要为固体颗粒吸附于油/水界面并形成固体颗粒单层/多层膜，从而稳定乳液[3~5].固体颗粒稳定的乳液与表面活性剂稳定的乳液相比有如下优势[5]：降低了表面活性剂的用量，避免使用有毒有害的表面活性剂；乳液稳定性好，不易破乳；乳液的黏度和流变性可通过改变固体颗粒的种类和含量而调整.目前，人们对Picking 乳液已经进行了广泛的研究[3,6~14].人工合成的润湿性可调的二氧化硅纳米颗粒已成为研究Pickering 乳液的模型微粒，研究内容主要包括Pickering 乳液的转相行为[15~17]㊁油水界面上吸附颗粒层的排列㊁覆盖稳定性及其影响因素[18~21]㊁Pickerin g 乳液稳定性与油相极性[17]㊁颗粒润湿性[22]及油滴聚并[23]的关系.对于以各向异性的片状颗粒(如黏土㊁高岭土㊁蒙脱石㊁合成锂皂石等)稳定的Pickering 乳液也进行了研究[5,8,11,12,24~26].以Pickering 乳液滴为模板，还可以方便地制备有机/无机杂化超结构微胶囊和微球材料[27,28].纤维素是自然界中分布最广㊁含量最多的一种多糖，是可降解㊁可再生的生物资源.除了来源于植物以外，纤维素也可由一些细菌合成，称为细菌纤维素(BC)，其分子结构与植物纤维素完全相同，但细菌纤维素具有很多植物来源纤维素所不具备的独特性能，如纯度高(99%)㊁持水性好(可保持重于自身几百倍的水)㊁生物兼容性高和生物可降解性好等[29].细菌纤维素的纤维宽度仅为几十纳米，远小于植物纤维，是一种优良的纳米材料.文献报道的采用纤维素衍生物制备的乳液体系有以微晶纤维素(MFC)[30,31]稳定的水包油型乳液和利用疏水改性的纤维素[32~34]稳定的油包水型乳液等.Kalashnikova 等[35]用细菌纤维素纳米晶体制备了水包油型乳液，但纳米晶体的制备过程较复杂.
本文利用超声和高压均质两种机械分散方式制备了两种BC 纳米纤维，测试了两种纤维悬浮液的
6741高等学校化学学报 Vol.34 流变性和絮凝团尺寸.以液体石蜡为油相，分别用两种BC悬浮液制备了水包油型乳液，研究了其稳定性与BC含量和pH值的关系，并比较了两种长度的BC微纤维稳定乳液的效果.
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
葡萄糖㊁酵母粉㊁蛋白胨㊁Na2HPO4㊁醋酸㊁氢氧化钠㊁盐酸㊁液体石蜡等均为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂.实验用水为反渗透水，电阻率大于18MΩ㊃cm.
组织捣碎匀浆机(JJ⁃2，江苏省金坛市宏华仪器厂)；超声波细胞破碎仪(JY98⁃3D，宁波新芝生物科技有限公司)；高压均质机(NS1001L，意大利GEA Niro Soavi公司)；旋转黏度计(DV⁃Ⅲ，美国Brook field公司)；动态接触角测量仪(PGX3.4a，瑞典Fibro System AB公司)；全量程界面张力测量仪(TX⁃500C，美国科诺工业有限公司)；数字表面张力仪(K9⁃MK1，德国Kruss公司)；电导率仪(FE30，梅特勒⁃托利多中国公司)；光学显微镜(CH20BIM MF200，日本Olympus公司)；原子力显微镜(JSPM⁃5200,AFM，日本电子公司)；透射电子显微镜(7650,TEM，日本Hitachi公司)；扫描电子显微镜(SU1510,SEM，日本Hitachi公司)；聚焦光束反射测试仪(FBRM，瑞士Mettler⁃Toledo AutoChem公司)；哈克旋转式流变仪(MARSⅢ，德国Thermo Electron公司).
1.2 实验过程
1.2.1 BC膜的制备与处理 木葡糖酸醋杆菌(G.xylinum,CGMCC No.2955)由天津科技大学教育部工业微生物重点实验室筛选并保存在中国微生物菌种保藏中心.
采用静置法培养BC.培养基由碳源㊁蛋白胨㊁酵母粉㊁磷酸氢二钠和醋酸构成，浓度分别为25, 7.5,10,10和10g/L，初始pH=6.0，于121℃灭菌20min.将1~2环G.xylinum斜面接入装有100mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在30℃,160r/min的条件下培养24h，得到液体种子菌种[36,37].G.xylinum的接种量为6%(体积分数)，于30℃恒温静置培养6~8d.恒温静置培养6d后生成的BC膜浮于液面.取出后，用水多次冲洗以除去膜表面的培养基及杂质.再将膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液中，于100℃煮沸20min去除液膜中的菌体和残留培养基(膜呈乳白半透明)，然后用蒸馏水或0.1mol/L的醋酸溶液多次冲洗至其pH值约为7.0.
1.2.2 Pickering乳液的制备和表征 制备了两种不同长度BC的分散液.先用组织匀浆捣碎机初步打散BC膜，制成悬浮液，再用超声波细胞破碎仪将上述悬浮液进一步打散，超声5min，制备出的悬浮液记为USBC.为防止过热将悬浮液置于冰水浴中，变幅杆ϕ=8mm，功率为650W.将组织匀浆机初步打散的BC悬浮液在高压均质机中进一步分散，得到HGBC悬浮液.高压均质后的HGBC纳米纤维比用超声波分散的USBC纳米纤维的长度短.悬浮液的固含量[BC的质量分数w(BC)]用恒重法测定.
分别以USBC和HGBC悬浮液为水相，液体石蜡为油相，用超声波细胞破碎仪处理5min，得到Pickering乳液(USBC乳液和HGBC乳液).为避免过热采用冰水浴，变幅杆ϕ=3mm，功率40W.每种乳液做两个平行样.取一滴乳液加入去离子水或液体石蜡中，所制备的乳液在去离子水中都能分散开，而在液体石蜡中则不能分散，说明所制备的乳液均为水包油型(O/W).乳液的电导率测量结果高达几百至上
哺乳睡衣>太阳能灯笼千μS/cm，也表明所制备的乳液为水包油型.
乳液制备好后，记录乳液相㊁分出的水相和油相的体积随时间的变化.乳液稳定性(Emulsion stability index,ESI)用乳液相在混合物中的体积分数表示.考察了BC用量(体积浓度,mg/L)和pH值对于乳液稳定性的影响.取一滴乳液于血球计数板上，用去离子水稀释，在光学显微镜下观察并记录图片.对每个乳液照3~5张照片，采用Image J1.45s软件计算液滴的直径.在每种乳液的照片中选择100个液滴进行测量.
1.2.3 接触角的测量 采用接触角测量仪测试BC干膜对水和液体石蜡的静态接触角，液滴大小为4μL，仪器自动记录液滴滴下的图片并在一张膜上取3个位置测量接触角，取其平均值.
1.2.4 油水界面张力的测定 选用旋转液滴式界面张力测量仪测试液体石蜡与水的界面张力，测试时内相为液体石蜡，外相为水，仪器转速为5000r/min，温度为25℃.
1.2.5 BC 悬浮液的流变性测试 采用旋转黏度计测量不同固含量的USBC 和HGBC 水分散体系的流变曲线[即黏度(η,Pa㊃s)与剪切速率(D ,s -1)的关系].对分散体系预剪切30s，然后放置20min，剪切速率从0逐渐上升至160s -1，分散体系的固含量从0.15%提高至1.1%.屈服应力(Yield stress,
τ0/Pa)的测定采用哈克旋转式流变仪，剪切速率范围为0.001~1s -1.将剪切应力的线性部分延长至D =0，读出的数值即为屈服应力[38].通过观察流变曲线和屈服应力的变化，可以了解BC 悬浮液体系
黄粉虫筛选机结构强度和流动性随固含量的变化情况.1.2.6 BC 悬浮液中絮凝团尺寸的确定 将FBRM 探头直接插入500r /min 转速下搅拌的BC 悬浮液
中，使用面积加权后的弦长作为BC 悬浮液中的絮凝团直径.1.2.7 乳液的SEM 观察 采用文献[35]方法，将苯乙烯单体与油溶性引发剂过氧化二苯甲酰(BPO)按0.019g ∶1mL 的比例混合，取86μL 混合物加入到1mL HGBC 悬浮液中，超声制成乳液.然后将乳液加热至85~90℃，并在此温度下聚合反应2h.将聚苯乙烯小球喷金后在扫描电子显微镜下观察纳米纤维在液滴界面上的分布.
2 结果与讨论
2.1 三相接触角的计算
测得水滴在BC 干膜上的接触角θw 为59.4°.纤维素分子上的每个葡聚糖单体有4个羟基[39]，正是纤维素分子上存在的大量羟基赋予了其亲水特性.接触角在30°~90°时表明液体对固体表面有一定的润湿性，但亲水性不佳.对于小的球形颗粒(<5μm)，假设油/水界面是平的，把界面上的颗粒转移至某一相中的能量E 为[22]
信用卡催收系统E =πr 2γow (1±cos θow )2(1)式中,γow (mN /m)为油/水界面张力.若颗粒被转移至油相中，则括号内为加号；若颗粒被转移至水相中，则括号内为减号.若接触角θow <90°，则颗粒容易被转移至水相中；若
接触角θow >90°，则颗粒容易被转移至油相中.当接触角θow =90°时，颗粒在界面上最稳定.即理想的制备Pickering 乳液的颗粒三相接触角为90°.若颗粒能够完全被水相或油相润湿，即接触角在0°~20°或160°~180°范围内，则转
移这样的颗粒所需要的能量E 非常小，不能用来稳定乳液.
式(1)中的接触角θow 是指单个颗粒在油/水界面上的三相接触角，与水滴在空气⁃固体界面上的接触角θw 不完全相同.由于直接测定θow 有一定的难度，可以通过计算得到三相接触角θow .由杨氏方程可知，颗粒在油水界面的接触角θow 为cos θow =(γso -γsw )/γow
(2)式中,γ(mN /m)表示界面张力，下角标中的s,o,w 分别表示固相㊁油相和水相.颗粒在水/空气界面(下角标a 表示空气相)和油/空气界面的接触角分别为cos θw =(γas -γsw )/γaw (3)cos θo =(γas -γso )/γao
(4)将式(3)和(4)代入到式(2)中，得到cos θow =
γw γow cos θw -γo γow cos θo (5)在25℃下测得液体石蜡在BC 干膜上的接触角θo 为35°，水滴在BC 干膜上的接触角θw 为59.4°，液体石蜡的表面张力γo =30.3mN /m，液体石蜡/水的界面张力γow =40.83mN /m.25℃时水的表面张力γw =72mN /m [40].由式(5)可算得BC 纳米纤维在液体石蜡/水界面上的三相接触角θow 为73.1°.由此
可知BC 对水相和油相均有一定的亲和性，具有一定的表面活性，可用来稳定Pickering 乳液.
2.2 BC 悬浮液中纳米纤维的形貌分别采用光学显微镜㊁原子力显微镜和透射电子显微镜观察USBC 和HGBC 悬浮液中的BC 纳米纤维(图1).由图1可见,USBC 悬浮液中的微纤丝弯曲细长，并相互缠绕连接形成了网状结构;HG⁃BC 悬浮液中的微纤丝也呈现出相互缠绕的状态.用Image J 软件测量了图1(B)和图1(E)中微纤丝的7
741 No.6 贾原媛等：细菌纤维素纳米纤维稳定乳液的性能
宽度，均为50nm 左右，长径比非常大.利用FBRM 测得USBC 悬浮液中絮凝团的尺寸为406μm，明显高于HGBC 悬浮液中的156μm，说明USBC 悬浮液中微纤丝的长径比比HGBC 悬浮液中的高.
Fig.1 Morphology of BC nanofibrils in USBC (A C )and HGBC (D ,E )dispersions observed
by optical microscope (A ,D ),AFM (B ,E )and TEM (C )
2.3 USBC 和HGBC 悬浮液的流变性
在一定的剪切力下，纤维悬浮液中碰撞上的纤维会黏贴在一起，从而形成一个絮凝团的 核心”.
其与其它纤维进一步碰撞而形成絮凝团[41].4个浓度的USBC 和HGBC 悬浮液在不同转速下的黏度如图2所示.在USBC 和HGBC 悬浮液中，随着固含量的增加，纤维之间和絮凝团之间的相互作用均增强[42]，导致悬浮液的黏度增加.当固含量由0.15%增加到1.1%时，悬浮液的黏度都增大了近100倍.在相同的固含量和剪切速率下,USBC 悬浮液的黏度总是高于HGBC 悬浮液，这是由于USBC 悬浮液中的纳米纤维较长，纤维之间的缠绕和团聚作用更强，纤维絮凝团尺寸较大，从而使得其黏度更高.Derakhshandeh 等[43]测试了纸浆悬浮液的流变性，发现纸浆悬浮液的黏度随纸浆浓度和纤维长度的增加而增加，与本文结果类似
.Fig.2 Rheological curves of USBC (■)and HGBC (▲)suspensions w (BC)(%):(A)0.15;(B)0.38;(C)0.7;(D)1.1.
由图2还可知，这2种悬浮液均呈现剪切稀释性，即随剪切速率的增加黏度下降.在低剪切速率下，纤维之间及絮团之间的缠绕作用相对强烈，所以黏度较高；随剪切速率的增大，絮凝团中纤维的平均数量随剪切应力的增加而下降，部分纤维网络被剪切力破坏[44]，使得部分纤维能够顺着流动方向排列，所以悬浮液的黏度下降.当剪切速率提高到一定程度时，黏度不再随着剪切速率的提高而下降，呈现牛顿行为.
悬浮体系中颗粒与颗粒之间㊁颗粒与絮凝团之间的相互作用足够大时会形成连续的三维网络结构，这些网络具有一定的强度.为使悬浮液流动起来，必须对流体施加一个最小的剪切应力以破坏悬浮液中的纤维网络结构，这一剪切应力称为屈服应力(τ0)[43].图3为BC 分散体系的τ0值随纤维含量8741高等学校化学学报 Vol.34
的变化.增大纤维含量可以促进BC 颗粒网架结构形成，从而使体系的τ0值不断增大.当悬浮液的固含量高于0.3%时,τ0值急剧增加，表明结构强度提高很快.通常τ0与纤维固含量具有幂指数关系:
τ0=ac b m (6)
式中,c m 为纤维悬浮液的百分含量[44,45].图3中的τ0值与纤维含量亦符合该关系，对于USBC,a =538.793,b =1.78086；对于HGBC,a =96.99046,b =1.27332.
Fig.3 Influence of fiber content on the yield stress of USBC (A )and HGBC (B )suspensions
2.4 Pickering 乳液的稳定性2.4.1 纤维含量对乳液稳定性的影响 所有制备的乳液在5min 后均迅速分层,24h 后各相体积基本Fig.4 Variance of ESI of HGBC⁃stabilized emulsion with time Fiber content /(mg㊃L -1):■
0.5;●1.5;▲3.0;▼5.5.
pH =12;V (Oil)/V (Water)=1∶ 1.Fig.5 Effect of pH and fiber content on the ESI of HGBC⁃(a )and USBC⁃stabilized (b )emulsions
pH:(A)3;(B)5;(C)7;(D)9;(E)12.V (Oil)/V (Water)=1∶1.
不再随时间改变.Ougiya 等[30]也报道了静置培养
和旋转培养BC 稳定的乳液在24h 后各相体积才会
达到稳定.由图4可见，制备24h 后HGBC 乳液的
稳定性与制备30min 后相比下降不大，对于BC 用
量为0.5和1.5mg /L 的两组乳液，制备30min 时
的乳液相的体积分数分别为82%和86%，制备24h 后，乳液相的体积分数均降为79%.对于BC
用量为3.0和5.5mg /L 的两组乳液，乳液相的体积分数一直保持为100%.
图5是制备的水包油型USBC 和HGBC 乳液的
稳定性与纤维含量的关系.图中的ESI 均为乳液制9741 No.6 贾原媛等：细菌纤维素纳米纤维稳定乳液的性能
备24h 时测得的数值.由图5可见，在各个pH 值下,USBC 和HGBC 乳液的稳定性均随纤维用量的增加而提高.USBC 乳液中纤维用量为5.5mg /L 时，乳液稳定性最高，分别在pH 为5和12时ESI 达到100%，此时乳液不分层.HGBC 乳液中纤维用量为3.0和5.5mg /L 时，在各个pH 值下ESI 均达到了100%.两者相比较，在同样的BC 用量下,HGBC 乳液的稳定性更高.这主要是由于HGBC 乳液中的纤维尺寸更小，在同样的纤维用量下，有更多的纳米纤维分布在油水界面上稳定乳液滴.同时,HGBC 纳米纤维之间的缠绕相对较少，纤维团的数量较少，尺寸较小，体系较均一，在单位体积内有更多的离散纤维，这些游离的纳米纤维拥有更大的表面积，这也正是HGBC 稳定乳液效果比较好的原因.BC 纤维
用量高导致稳定性增加的原因有2个：一个是有更多的纳米纤维分布在油水界面上稳定乳液，为了得到稳定的Pickering 乳液，颗粒必须吸附于油水界面并在分散液滴表面形成致密的单层或多层膜，从而阻止液滴聚并[3].基于模型计算,Tambe 等[8]认为当界面上吸附的颗粒足够多时，油水交界区域的流变性得以改变，表现出黏弹性行为.界面膜的黏弹性会延迟乳液滴间液膜减薄的速率，并且提高颗粒被转移自油水界面的能量.固体颗粒稳定乳液的另一个机理是固体颗粒形成了网络结构，从而将乳液滴封存在颗粒的三维阵列中[3].从图3可知USBC 和HGBC 悬浮液的τ0值随固含量的增加而增加，表明体系的结构强度增强，这也是纤维含量增加导致乳液稳定性增强的另一个原因.在同样的固含量下,USBC 悬浮液的屈服应力比HGBC 悬浮液的高，这是由于絮凝团的强度主要决定于纤维的长径比[44].但HGBC 乳液的稳定性比USBC 乳液高，这表明HGBC 纳米纤维的小尺度效
应对乳液稳定性的贡献大于USBC 体系的高结构强度对稳定乳液的贡献.2.4.2 pH 值对乳液稳定性的影响 由图6可知，在各个纤维用量下,ESI 基本上随pH 值的升高而增加(纤维含量0.5mg /L 时例外)，并均在pH =12时达到最高.在碱性条件下，纤维素分子的负电荷增加，使封存有纤维素颗粒的乳液滴间的排斥力增大，阻止乳液滴聚并，从而帮助稳定乳液
.氢气炉
Fig.6 Influence of pH on the stability of HGBC⁃(A )and USBC⁃stabilized (B )emulsions
Fiber content /(mg㊃L -1):■0.5;●1.5;▲3.0;▼5.5.pH =十字滑台
12.
Fig.7 Relationship between average drop diameter of HGBC⁃stabilized emulsion and fiber content V (Oil)/V (Water)=1∶1,pH =7.另外，比较两种乳液的内相体积可知,HGBC 乳液的内相体积明显较高，在体系中BC 含量为0.5mg /L 的情况下，各pH 值水相所制备的乳液内相体积比例最高的样品为60%；而对于USBC 稳定的乳
液，在相同的BC 含量下，内相体积比例最高的样
品为20%.这也在一定程度上说明HGBC 的乳化能
力更强.
由图7数据可知，对于HGBC 乳液，液滴粒径
随纤维用量的增加而减小，在纤维含量为3.0mg /L
时液滴直径最小；当纤维含量达到5.5mg /L 时，虽然乳液的稳定性达到最高，但是乳液滴的直径却有所增加，这可能是由于BC 悬浮液的黏度非常高,0841高等学校化学学报 Vol.34
