蛋白水解酶在纳米二氧化硅上的固定化闵行中学高二（8）胡宇轩摘要采用溶胶-凝胶法制作纳米二氧化硅载体，用来固定蛋白水解酶。将附有酶的载体 放入有蛋白质的水中，待其反应一段时间，通过测定固定化酶活来探究不同因素对固定化酶活性的影响。我研究了温度，PH值，储存时间及载体与
酶的配比对固定化酶活性的影响。得出的结论为：载体吸附的最合适的温度大约为32度，固定化酶的最适PH值为5左右，最佳载体和酶的配比大
约为0.6g/mL，相比游离的酶纳米二氧化硅使酶的稳定性有较大提升。关键词：酶的固定化，纳米二氧化硅载体，凝胶法，蛋白水解酶引言 蛋白水解酶和其他酶一样都是由蛋白质构成的，蛋白质的结构对环境十分敏感，所以蛋白水解酶对热，强酸，强碱等情况下不够稳定容易在反应中失
活。因此对蛋白水解酶的固定化十分重要。而二氧化硅呈立体网状结构，有极强的吸附力，并且作为原子晶体它的性质十分稳定。所以我猜想二氧化
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硅是一个良好的酶的载体并对此展开了研究。实验目的将纳米二氧化硅作为载体运用到酶的固定化上，探究在什么条件下载体上的酶的催化作用最智能商用豆浆机
强，以增加蛋白水解酶的重复利用。实验内容采用凝胶法制取纳米二氧化硅载体探究各个因素对固定化酶活性的影响（PH值，储存时间，载体与酶
的配比，温度）实验原理关于纳米二氧化硅纳米二氧化硅是极其重要的高科技超微细无机新材料之一,因其粒径很小，比表面积大，表面能大，化
学纯度高、分散性能好、热阻、电阻等方面具有特异的性能，以其优越的稳定性、补强性、增稠性和触变性，在众多学科及领域内独具特性，有着不
可取代的作用。纳米二氧化硅的空间结构是立体网状，有很多孔并有极强的吸附力，化学，物理性质稳定可以通过吸附作用将酶吸附在其上。关于用
凝胶法来制取纳米二氧化硅凝胶法是加入酸使碱度降低从而诱发硅酸根的聚合反应，使体系中以胶态粒子形式存在的高聚态硅酸根离子粒径不断增
环己胺氢溴酸盐大，形成具有乳光特征的硅溶胶。成溶胶后,?随着体系pH值的进一步降低，吸附?OH-?带负电荷的SiO2胶粒的电动电位也相应降低,，
胶粒稳定性减小,SiO2胶粒便通过表面吸附的水合?Na+的桥联作用而凝聚形成硅凝胶，去水即得纳米粉。该法原料与沉淀法相同,只是不直
接生成沉淀，而是形成凝胶，然后干燥脱水，产品特性类似于干法产品,?价格又比干法产品便宜,但工艺较沉淀法复杂,成本亦高。关于纳米二氧
化硅性能的测试通过控制变量法，分别探究在催化时间，不同PH值，催化的次数，吸附不同酶量的情况下对固定化酶活性的影响。实验器材耐高
温蛋白水解酶，正硅酸乙酯，无水乙醇，纳米二氧化硅分散浆，蒸馏水，盐酸，氢氧化钠，氨水，氯化铵PB210型pH计,J2221型离心机
，酒精灯，烧杯，胶头滴管，搅拌机，温度计，计时器，烘干机实验步骤制作纳米二氧化硅载体将正硅酸乙酯，无水乙醇，蒸馏水，按一定比例配置
成溶液，放在搅拌机中充分搅拌成均匀液体加入适量的氯化铵溶液，调节体系温度运用水浴方法将温度控制在60度，反应30min后加入氨水调
节PH值（将ph值控制在6左右），带反应完成后生成凝胶，在凝胶溶液中加入少量的纳米二氧化硅分散浆所得的纳米凝胶液体，喷洒在纸上，在
纸上均匀撒上细小的蛋白酶粉末，放在烘干机中让温度保持50度使水分蒸发析出，得到含酶的纳米二氧化硅探究温度对固定化酶的影响取3克含蛋
白酶的纳米载体，另外单独取3g蛋白水解酶放在一边取两个烧杯加入相同的水及相同浓度的蛋白质并（保持其他条件相同）并加热到相同温度（2
2度，26度，30度，34度，38度）同时将含有酶的载体和无载体的酶放入含蛋白质的水中，测定固定化酶活多次重复试验取平均值探究PH
值对固定化酶的影响取3克含蛋白酶的纳米载体，另外单独取3g蛋白水解酶放在一边。取两个烧杯加入相同的水及相同浓度的蛋白质（保持其他条
高分散白炭黑
件相同）并将PH调到相同（4.55.05.56.06.5）同时将含有酶的载体和无载体的酶放入含蛋白质的水中，测定固
定化酶活多次试验取平均值探究酶与载体的最佳配比分别取3克酶与载体配比不同的纳米载体（分别使m载体/v游离酶的值为0.20.4
0.60.8）在多个烧杯加入相同的水及相同浓度的蛋白质（保持其他条件相同）将不同配比的载体放入水中反应并测定酶活性重复实验取
平均值探究储存时间对固定化酶的影响取3克含蛋白酶的纳米载体，另外单独取3g蛋白水解酶放在一边。重复上述步骤制取多组实验材料将每一组
放在1个玻璃瓶中储存（储存时间2天，4天，6天，8天，10天）到了存储时间后将其拿出测定固定化酶活实验结论探究温度对固定化酶的影响
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固定化反应最适温度随着温度的提高酶的反应速率加快,但同时蛋白水解酶也在逐渐变性而失去活力引起酶反应速率的下降,当酶活的增长速
挂包钩率和酶的失活速率相等时，产生酶的最适反应温度。由图可以看出,固定化蛋白水解酶和游离蛋白水解酶的最适温度分别为30℃和26℃,实验结
果表明,固定化蛋白水解酶明显比游离蛋白水解酶有更宽的温度适应范围,提高了游离酶的耐热性，使其有了更广泛的温度应用。（点为游离酶，
三角为固定化酶）探究PH值对固定化酶的影响固定化蛋白水解酶的最适PH值纳米二氧化硅具有的热稳定性和抗有机溶剂腐蚀的特性也比高分子材
料具有更好的固定化性能。其应用在固定化蛋白水解酶时能提高酶对蛋白水解酶和温度的适应范围,提高酶的操作和储藏稳定性，由图可以看出固定
化蛋白水解酶比游离蛋白水解酶具有更广泛的pH适应范围,且保持了较高的酶活,说明了固定化蛋白水解酶能够提高酶的pH耐受能力。另外,
由于固定化材料略显酸性,固定化酶的最适pH值要比游离酶低。当pH在5左右时游离酶达到最大活力,而固定化酶并未达到最适pH
值,活力低于游离的固定化酶。探究酶与载体的最佳配比载体和游离酶配比对固定化酶酶活的影响纳米二氧化硅具有很好的载体性能,同其他载
体相比较,有利于固定化酶迅速达到平衡吸附,而且能够比介孔材料容纳更多的酶。由图可以看出,随着载体和游离酶配比的增加,固定化蛋白水
解酶的活力也不断增加,当其质质量配比大约达到0.6g/mL后酶活增长趋于平缓,增加配比对酶活影响不大。这是因为固定化时载体的
加入量对酶的固定化有很大影响,一方面,载体的加入量越多,给酶的固定化提供了更大的空间,固定上去的酶更多,对固定化有利。另一方面,所
提供的游离酶毕竟有限,即便载体再多由于游离酶数量的限制,到达一定程度后,酶的固定化达到饱和.载体量多了反而造成浪费,降低了载体的利
用效率。综合考虑固定化的经济实用性,配比大约为0.6g/mL时为最佳。探究储存时间对固定化酶的影响固定化蛋白水解酶的贮藏稳定性
由图可以看出,固定化蛋白水解酶和游离蛋白水解酶的活性随着时间的增加而降低,因为酶随着贮藏时间的延长而变性失活。固定化酶对于游离酶的
一个实用优势就是能保存更长时间的活力。由图可以看出10天后固定化蛋白水解酶的酶活仍高于50%,明显高于游离蛋白水解酶的活性,这说
明固定化能明显提高酶的贮藏稳定性。六．实验结论通过凝胶法制得纳米二氧化硅载体用来固定蛋白水解酶所得的最佳条件为：载体吸附的最合适
的温度大约为30度，固定化酶的最适PH值为5左右，最佳载体和酶的配比大约为0.6g/mL，相比游离的酶纳米二氧化硅使酶的稳定性有较
大提升。致谢感谢指导老师的耐心与细致的指导和及时的纠错，让我实现了从初步了解到深入研究，没有您的帮助单凭一己之力很难完成这庞大且
复杂的实验，也要感谢那些为我提供实验场所和实验器材的老师们。参考文献钱军民,李旭祥,锁爱莉.氨基化硅胶固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].生物化学与生物物理进展,2002,29(3):394-397中山大学生物系生化微生物教研室.生化技术导论[M].北京:人民教育
出版社,1978
