前处理：
称取叶片0.5克，加5ml（1+4）提取液PH7.8 Pbs，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为粗酶提取液。 1.SOD测量
取透明度好的指形管，按下表加入各溶液：
试剂（酶） | 用量（ml） |
0.05M磷酸缓冲液 | 1.5 |
65mM Met溶液 | 0.3 |
500uM NBT溶液 | 0.3 |
100uM EDTA-Na2 | 0.3 |
200uM核黄素 | 0.3 |
酶液 | 0.1（对照管加缓冲液） |
蒸馏水 | 0.5 |
总体积 | 3.3 |
| |
混匀后将一支对照管置暗处作空白对照，其余各管于4000lx光下反应20-30min，反应结束后，以不照光的对照管为空白，560nm测定OD值。按下式计算SOD活性。 SOD总活性=[(ACK—AE)×V]/[ ACK×1/2×W×a]
SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度
SOD总活性以每克鲜重每单位表示：比活力单位以酶单位/mg蛋白表示
ACK—照光对照管的消光度值
AE—样品管的消光度值
V—样液总体积（ml）
a—测定时样品用量（ml）
W—样重（g）
蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。
【试剂配制】
磷酸缓冲液配制：
母液：A：Na2HPO4•12H2O 36g，稀释至500ml
B：NaH2PO4•2H2O 15.92g，稀释至500ml
提取液配制：取0.0186gEDTA（0.1mM），5g PVP （1%（g/ml））,用磷酸缓冲液（PH7.8）稀释至500ml。
PH7.8 Pbs配制：A 114.35ml + B 10.625ml，定容至500ml。
PH7.0 Pbs配制：A 152.5ml（76.25ml）+ B 97.5ml（48.75ml）稀释至1000ml（500ml）。
65 mmol/L Met: 取0.97g Met 用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml；
500 umol/L NBT:取0.0409g NBT用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml（避光保存）；
100 umol/L EDTA-Na2: 0.03721g（0.0186g）EDTA-Na2磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；
200 umol/L 核黄素：0.0753（0.03765）g核黄素磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；（现用现配）
注：若要抑制Cu-Zn/SOD的活性，可加入30mM的KCN0.3ml；若要抑制Cu-Zn/SOD Fe-SOD的活性，可加入50mM的H2O2 （0.52ml 30%的H2O2稀释至100ml） 0.3ml；
2.CAT
酶提取液：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，4℃下保存备用。（同上）
三基荧光粉0.1 ml 酶提取液+ 2.9 ml CAT 反应液，240nm比，（10s∕20s）。
【E=39.4mMcm-1】活性=OD×1000/E(umol/L);
CAT反应液：0.28ml 30%的H2O2用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至250ml。（H2O2为10mM）
。
3.APX
酶液提取液配制：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（同上）和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为APX酶粗提液，4℃下保存备用。（如果是长期保存的材料，则提取液为0.186g EDTA，0.7418g ASA，用pH7.0的缓冲液定容到500ml，此处作用是防止APX失活，但是新鲜材料则两种提取方法对后来结果影响差异不明显）。
APX 反应液：11.2ul 30%H2烧录icO2+0.04718gASA，磷酸缓冲液（pH7.0）定容到500ml。（此反应液必须现配现用）
0.1 ml 酶提取液+2.9 ml APX反应液，290nm比（0~40s）。
4.POD
酶液提取液配制：取材料0.5g，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（同上）和少量石英砂研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为POD粗提液，4℃下保存备用。
POD反应液：0.125ml愈创木酚+0.2553ml 30%H2O2，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至250ml。
20ul酶提取液+3ml POD反应液，470nm比（0s/30s）。
5.可溶性蛋白测定
0.1 ml酶提取液（测SOD的酶提取液）+5ml 考马斯亮蓝G250，反应2 min，595nm比，按下式计算蛋白质含量：
蛋白质含量（mg/g鲜重）=（C×V/a）/W
C—查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）
V—提取液总体积（ml）
a—测定所取提取液体积（ml）
W—样品重（g）
考马斯亮蓝G250：0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%磷酸100ml，蒸馏水定容至1000ml。（配好后最好过滤）
注：抗氧化酶液可以统一提取———称取材料0.5g10 18 100 101，置研钵中，加入5ml 4℃下预冷的提取液（直接用pH 7.8Pbs即可）和少量石英砂，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为酶粗提液，4℃下保存备用。同时酶液可用于测定可溶性蛋白质含量和超氧阴离子自由基的含量！注意CAT反应液和APX反应液要现用现配。
6.MDA含量测定
称取剪碎的材料0.5g（需3个重复，也可直接取1.5g,然后再分3个样），用5ml（2+3） 10%TCA和少量石英砂研磨，10000g离心10min，上清液为提取液。取提取液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min(玻璃试管)，迅速冷却后再3000g离心10min，取上清液测定450nm，532nm，600nm比（M波长添加，三波长，分别是450 532 600，调零：基线400-700 结果：读取或F9）；按下式计算MDAwentimeimei
浓度（umol/l）： C=6.45(D532-D600)-0.56D450
MDA含量（umol/g）= MDA浓度（umol/l）×提取液体积（ml）/植物鲜重（g）
【试剂】
10%三（TCA）：50gTCA溶解于500 ml蒸馏水中。强腐蚀性
0.6%（体积比）硫代酸（TBA）：先用少量的NaOH（10mol/L）溶解，再用10%TCA定容。
7.游离脯氨酸的测定
取剪碎的材料0.2g，置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸盖口，沸水浴中浸提10min，冷却至室温，吸取上清液2ml（对照为蒸馏水），取2ml冰乙酸和3ml 2.5%酸性茚三酮，沸水浴反应40min，冷却后加5ml甲苯，充分震荡，静置分层，取上层甲苯溶液520nm比。
【试剂】
3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸溶于100ml蒸馏水中
2.5%酸性茚三酮显液：0.625g酸性茚三酮+15ml冰乙酸+10ml磷酸。（现用现配）
8.可溶性糖（蒽酮法）
称取0.3g材料，放入试管中，加入10ml蒸馏水，封口，沸水浴30min，提取液过滤入50ml容量瓶，冲洗残渣及试管，定容。吸取提取液1ml（空白为蒸馏水）于20ml刻度试管中，加入1ml贴片变压器蒸馏水，然后再按顺序加入0.5ml蒽乙和5ml浓硫酸，充分震荡，立即放入沸水浴中1min，冷却，630nm比。
按下式计算可溶性糖含量：
可溶性糖含量（%）=（C×V/a×N）/(W×106)
C—标准方程式求的糖含量（ug）
a—吸取样品液体积（ml）
V—提取液量（ml）
N—稀释倍数
W—样品重量（g）
蒽乙（蒽酮乙酸乙酯）：蒽酮1g+50ml乙酸乙酯（棕瓶黑暗保存）
9．细胞膜透性的测定（电导法）
参照赵世杰等（2002）的方法。用直径0.8cm的打孔器避开主脉打取用去离子水冲洗干净的叶圆片4片，放入洁净的具塞试管中，加入5ml含吐温（-80）的去离子水，室温下平衡2小时，期间要多次摇动试管，用DDS-307型电导率仪（上海精密科学仪器有限公司）测其初电导值。测毕，置沸水浴中30min，冷却至室温，测其终电导。以相对电导率表示细胞膜相对透性，其值是电导率与总电导率的比值。
10．膜渗透——电解质外渗法（叶片电导率的测定）
参照赵世杰等（1998）的方法。打取直径直径0.8cm的叶圆片，放入洁净的具塞试管中，用去离子水漂洗3次，加去离子水15ml置真空泵中抽气30min，后放振荡器上振荡3h，取下静置摇匀，测定初电导。然后煮30min，冷却至室温，测其终电导。
相对电导率（%）=（初电导-空白）/（终电导-空白）×100%
伤害度=（处理相对电导率颗粒冷却塔-空白相对电导率）/（100-空白相对电导率）
1) 分别取常温和低温处理的植株上的同一叶位上的叶片，用去离子水清洗2次，然后用吸水纸洗净表面水分。用打孔器打取叶圆片（避开主脉），每个处理打取叶片30片，每个管放10片。
2) 管中加入15 ml含吐温的蒸馏水，然后将试管放入真空干燥箱中真空抽气10min。
3) 然后将试管置室温下在振荡器上振荡1h。
4) 用电导仪测初电导值（S1），然后将试管封口，置沸水浴中10min，以杀死植物组织。取出试管用自来水冷却至室温，并在室温下平衡10min，摇匀，测终电导（S2），然后测含吐温的蒸馏水的电导值（S0）。计算相对电导度L（L=( S1—S0) / ( S2—S0)）
5) 伤害度（%）=（LTK—LCK）/（1—LCK）×100
LTK处理叶片的相对电导；LCK对照叶片的相对电导
6) 注意事项：S0 S1 —S2 必须在同一温度下测定。测定时不要让CO2进入试管。
11．叶片水势的测定
打取叶圆片，置于露点微伏压计（HR-33-T-R,USA）封闭的不锈钢叶室内平衡2h（受胁迫
的叶片时间要长一些），记录电热差，同时读取实测温度（T ℃），电热差除以0.75 uv/bar
便是被测样品的水势（bar），1bar=105Pa。叶片的实际水势=实测水势/（0.325+0.027T）
12. 叶绿素含量的测定
0.1g叶片，加入20ml 96%乙醇，黑暗处放置40h在665，649，470nm比（95%乙醇调零）。
叶绿素a(Ca)=13.95D665-6.68D649
