预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。
将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。 分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心 (9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。
（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g
（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+
KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）
1、试剂
（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑 0.6808g+250mmol/L蔗糖 21.3931g+5mmol/LEDTA 0.3653g
（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑 1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033g+40mmol/LKCl 0.7455g
（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g
（4）30%三（TCA）9g TCA+21mlH2O
（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556g钼酸铵+90mlH2O
每10ml加入FeS04 0.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2O 0.2353g，临用前配制。5mol/LH2SO4：2.7ml H2SO4+7.3mlH2O
（6）1mmol/L乌本苷（100ml）：0.0767g
（7）50µg/mL磷标准溶液（1000ml）：0.2195gKH2PO4
2、无机磷标准曲线的绘制：各试管分别加磷标准溶液0、0.20、 0.40、0.60、 0.80、1.00m1及蒸馏水1.00、0.80 、0.60、0.40、0.20、0 m1，混匀后各吸取0.08ml加入酶标板，同时加入0.08mlTCA，0.08ml定磷试剂，混匀后650nm处比测吸光值。
3、酶活性测定
ATPase制剂：匀浆比（W/V）为1:40，离心10min（9000r/min）取上清液得到。
总酶活：酶液10µ1+反应缓冲液40µl+H2O 20µ1+ Na2ATP 10µ1（空白用H2O代替Na2ATP，空白仍需加入酶液）。25℃保温15min后加入冷的30%TCA80µ1终止反应+定磷试剂80µ1，静置5min后读数。
Mg2+-ATP酶活：酶液10µ1+反应缓冲液40µl+H2O 10µ1+乌本苷10µ1+ Na2ATP 10µ1，其余同总酶活性测定。
4、蛋白质含量测定
5、计算
10µl蛋白质含量：X*5*10 µg
Pi浓度计算：有标准曲线得Y µg/ml
10µl酶液的量：m= X*0.08 ml
Pi的物质的量：n=m/M=m*103/31 nmol
ATP活性：n*4/蛋白质含量= X*0.08*103*4/31 µmol/mg pro/h
SOD酶活性测定
1、试剂
（rbd-4461）Tris-HCl 缓冲液
0.1mol/l 的盐酸：取浓盐酸（密度为1.18，36%）8.4ml，加双蒸水稀释至1000ml。
0.1mol/l 的Tris 溶液：取6.057 克Tris，加水溶解，配成500ml。Tris-HCl 缓冲液（pH 为8.4，浓度0.1mol/l）：取86ml 0.1mol/l 盐酸，取250ml 0.1mol/l 的Tris 溶液，加双蒸水稀释至500ml。
（2）10mmol/l HCl：取0.1mol/l 的盐酸10ml,加双蒸水稀释至100ml。
（3）6mmol/l 邻苯三酚(精确)：用10mmol/l HCl 配制。0.07567 g+100ml 10mmol/l HCl。
2、邻苯三酚自氧化速率的测定
邻苯三酚自氧化速率的测定：在酶标板孔中加入300μL Tris-HCl 缓冲液，放置酶标仪中25℃恒温10min，加入预热的邻苯三酚及10μL双蒸水，在420nm处每30s测定一次吸光值，自氧化速率在3 分钟内有效。调整邻苯三酚用量，使线性范围内吸光度值的变化速率控制在0.020OD/分。(注：实验时要确定邻苯三酚的用量，可先做8、9、10μL各两个)
3、酶活性测定
SOD活性测定与步骤2相同，只是将双蒸水换成同体积酶液。在420nm 下，每隔30 秒钟测吸光度值一次，计算平均每分钟的吸光度变化值△A420/分。控制SOD 样品液的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定体系后，使邻苯三酚自氧化速率的吸光度值逐渐下降，即联苯三酚自氧化速率被抑制50%左右。注：取组织匀浆时，可先做1、3、5 倍稀释管各两只，以确定稀释倍数。（参考：将1:9匀浆液再稀释20倍用以测定鱼肝酶活。
（3）计算）
SOD 活力单位定义：在规定条件下，1ml反应液中，每分钟抑制联苯三酚420nm下自氧化速率达50%时的酶活力单位（U）或称Marklund 单位。样品液中每mg蛋白的总SOD活性单位数称为样品液的SOD 比活。
SOD活力(U/ml)= (0.020-△A420)/0.020×100% /50%× V总/ （V 定义·V 样）×样品稀释倍数
V 总：反应总体积格栅井3（ml）
V 样：加入样品液的体积3（ml）
V 定义：酶活力单位定义体积1（ml）
GST酶活性测定
1、试剂
（1）0.1mmol/L磷酸缓冲液母液：
0.2mol/LNa2HPO4（取Na2HPO4·7H2O 53.65g；Na2HPO4·2H2O 35.61g；Na2HPO4·12H2O 71.64g加蒸馏水定容至1000mL）。0.2mol/LNaH2PO4（取Na2HPO4·H2O 27.6g；Na2HPO4·2H2O 31.21g加蒸馏水定容至1000mL）（母液浓度为0. 2mol/L，配时注意浓度稀释倍数）
PH | A(mL) | B(mL) |
6.5 | 31.5 | 68.5 |
7.0 | 61.0 | 39.0 |
7.4 | 81.0 | 19.0 |
8.0 | 94.7 | 5.3 |
| | |
0.1mol/LNa2HPO4·12H2O 500mL：取17.907g；
0.1mol/LNaH2PO4·2H2O 1000mL：取15.601g；
（2）1.0mmol/LCDNB100m：取0.0202g（巨毒，先用无水乙醇溶解，再加水）
（3）1.0mmol/LGSH（现配）10mL：取0.0031g
（4）反应体系：100µL0.1mmol/L磷酸缓冲液+10µL1.0mmol/LCDNB+10µL1.0mmol/LGSH+880µL双蒸水（共1mL）
2、活性测定
10µL酶液+170µL反应体系，增大药剂340nm读数，20s间隔一次，读3分钟。GST活性定义为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶促反应，使GSH浓度降低1 nmol/L为一个酶活力单位（nmol/mg protein/min）。
3、计算
R=180µL，ε=9.6mmol-1cm-1，P=0.54cm
GST活性=(OD*R*106)/( ε*W)
EROD酶活性测定
1、试剂
（1）0.1mol/L pH8.0Tris缓冲液100mL：50mLTris（0.1mol/L）+29.2mLHCl（0.1mol/L）
PH | 0.1mol/LTris(mL) | 0.1mol/LHCl(mL) |
7.1 | 50 | 45.7 |
7.4 | 50 | 42.0 |
8.0 | 50 | 29.2 |
| | |
0.1mol/LTris100 mL：1.2114g舞蹈把杆
（2）2. 5 mmol/L NADPH 1mL：0.0021g（药品较贵，且每次配量少，不易取，所以应配在锥形容量瓶中，配药时不用称量勺，拿着小瓶直接往称量纸上倒）
（3）40µmol/L乙氧基试卤灵100mL：0.001g
2、活性测定
10µL酶液+140µL缓冲液+40µL NADPH+10µL乙氧基试卤灵，空白不加NADPH ，25℃保温30min， 572nm读数。
3、计算
蛋白质浓度：x=(y-0.0269)/0.806 mg/ml
ε=73mmol-1cm-1
EROD活性=(OD*230*106)/(73*10*W*0.685*30)（W为蛋白质含量）
GSH含量的测定
1、 试剂
（1）10%TCA：1g +10ml H2O
（2）0.4mol/L pH8.9Tris缓冲液100mL：50mLTris（0.4mol/L）+7mLHCl（0.4mol/L）
（3）2.5mM DTNB：0.004g DTNB +2 mL缓冲液（现配，时间长了会变）
（4）25µM GSH储备液：；
2、活性测定
10µL酶液+10µLTCA+ 200µL Tris缓冲液（0.4M pH 8.9）混匀，25℃或室温孵育生物塑化5分钟胸针设计+20µL 2.5mM DTNB，反应总体积240µL，混匀后25分钟，415nm测吸光值。
3、标准曲线绘制：
各试管分别加25µM GSH储备液（零下4℃可放置1个月）0、0.20、 0.40、0.60、 0.80、1.00m1及蒸馏水1.00、0.80 、0.60、0.40、0.20、0 m1，混匀后各吸取10µl加入酶标板，10µLTCA，同时加入200µLTris缓冲液，25℃或室温孵育5分钟后加入20µLDTNB，混匀后25分钟，415nm测吸光值。
4、计算
CAT活性测定
1、试剂
匀浆后用生理盐水稀释10倍，制得粗酶液。
（1） pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液：
（2） 基质液：65μmol/mL H2O2，以pH 7.4 60mmol/L磷酸盐缓冲液稀释100 mL：24.3ml 0.2mol/L Na2HPO4（100 mL用 1.7406g）+5.7ml 0.2mol/L NaH2PO4（100 mL用0.1778g） +670μl 30% H2O2，稀释至100 mL。
30% H2O2（W/V）：密度1.11g/cm3。
（2）钼酸铵：32.4mmol/L（用四水合钼酸铵1235.86，4.0042g/100mL）
