复合材料学报第28卷 第1期 2月 2011年A cta M ateriae Co mpo sitae Sinica
V ol 28
N o 1
F ebr uar y
2011
文章编号:1000-3851(2011)01-0104-05
收到初稿日期:2010-01-28；收到修改稿日期:2010-05-08
基金项目：国家重点基础研究发展计划(2007CB936104)；国家863计划(2007AA021905)
通讯作者：何农跃，教授，博士生导师，从事生物传感器和纳米材料方面的研究 E mail:电视定制
王大新，教授，博士生导师，从事新药与组织工程研究 E m ail:daxinw
杨文静1，付 静2，何 磊2，王 婷1，王大新*3，何农跃*1
(1.东南大学生物科学与医学工程学院，南京210096; 2.东南大学公共卫生学院，南京210096;
3.扬州大学临床医学院，扬州225001,China)
摘 要: 结合壳聚糖(CS)和聚己内酯(PCL )二者的优点，以静电纺丝的方法制备了CS/PCL 血管支架。采用SEM 和电子万能试验机检测了该支架的结构和力学性能，将内皮祖细胞(EPCs)与该支架膜复合培养，评估了该血管支架维持细胞黏附、繁殖和分化的能力。SEM 结果显示：通过静电纺丝可以得到多孔、类似于天然细胞外基质的直径约400nm 的纤维微结构；当CS 与P CL 质量比为0.5时，静电纺丝所制备的CS/P CL 血管支架弹性最大形变达到31.64%，应力-应变曲线显示其弹性变形能力较强;EP Cs 在CS/PCL 血管支架黏附率可达95.1%，荧光显微镜观察结果也显示了CS/P CL 血管支架利于细胞黏附、生长。关键词: 壳聚糖；聚己内酯；血管支架；静电纺丝；内皮祖细胞中图分类号: R318.08 文献标志码: A Preparation and characterization of chitosan/polycaprolactone vascular
scaffolds by electrospinning京能恒基
YANG Wenjing 1,FU Jing 2,H E Lei 2,WANG Ting 1,WANG Daxin *3,H E Nongy ue *1
(1.School of Biolog ical Science and M edical Engineering ,So utheast U niver sity,N anjing 210096,China;
远红外烘干炉2.Schoo l of Public Health Southeast,Southeast U niv ersity ,N anjing 210096,China;
3.Clinical M edical Colleg es,Yang zhou U niver sity,Yang zhou 225001,China)
Abstract: T he chitosan/polycaprolactone(CS/P CL )v ascular scaffo lds w ere prepared by elect rospinning in order to co mbine the advantage of chito san(CS )and po lycapro lacto ne (P CL)into the vascular scaffolds.T he obtained CS/PCL v ascular scaffolds w ere character ized by SEM and electr onic univer sal testing machine.T he endo thelial pr og enit or cells (EPCs)w ere implanted in the scaffo lds w ith v arious mass rat ios of CS to PCL.T he v ascular scaffo lds w ere ex amined by adhesion rate in different culturing times and the cells breeding w as observ ed.T he obtained CS/P CL vascular scaffolds show poro us,nano structur ed surfaces,simila r to the natur al ex tracellular matrix.When t he mass r atio of CS to PCL is 0.5,t he br eaking elong at ion o f CS/PCL vascular scaffo lds r eaches 31.64%,and the curves of st ress-str ain indicate that the obtained vascular scaf folds possess g ood elastic defor matio n.T he adhesion rate o f EP Cs on CS/PCL vascular scaffolds is 95.1%,the o bserv atio n of EP Cs labeled with CM -DiI (chlo rmethylbenzam ido 1,1dioc
tadecy l 3,3,3 ,3 tetramethylindo carbocyamine )after culturing 72h by fluor escence micr oscopy also illustrates that CS/PCL v ascular scaffolds ar e beneficial to cell g ro wt h and cell adhesion.
Keywords: chito san;po ly ca pr olacto ne;vascular scaffold;electro spinning;endot helial pr og enit or cells
自1964年Dotter
[1]
首次提出血管支架(Endo
v ascular stent,EVS)概念，并于1969年成功地用金属环在动物体内制作血管支架以来，人们陆续开发出各种材料、多种成型的血管支架
[2]
。目前常用
于制作血管支架的材料有金属钽、医用不锈钢、镍
钛合金、涤纶(Dacr on)及聚四氟乙烯(PT FE )等。金属支架在进入临床后取得了令人瞩目的疗效[3]，但是经过10多年的应用也逐渐暴露出一些
不足和弊病[4]，金属支架易造成血管内膜损伤，诱发血管内膜增生导致血管再狭窄。金属支架还存在血栓形成、出凝血并发症、屈曲性不匹配、金属物永久存留于体内增加支架内再狭窄发生率等缺陷[5]。药物涂层支架可显著降低支架置入术后的再狭窄的发生率，在一定程度上克服金属裸支架的缺点，但是由于不能降解，还是给药物涂层支架的长期应用带来了隐患。Dacron和PT FE材料易于加工成独特的微孔结构并具有优异的力学性能而被认为是比较有应用潜力的血管内支架材料。但它们疏水的表面易于诱导凝血，形成血栓，不能完全满足心血管疾病的要求，而且这些非降解材料不支持内皮细胞的黏附和生长，血管难以充分内皮化。此外，材料不降解，对血管的长期适应性造成障碍[6]。近年来，生物可降解高分子医用材料由于其独特的成型性和良好的生物相容性引起了人们的广泛关注。
壳聚糖(CS)是天然生物大分子甲壳素通过脱乙酰而得到的衍生物。它不仅具有优良的生物可降解性、生物相容性[7]和生物黏附性[8]，而且易加工成为膜状物或多孔支架。但是壳聚糖的力学性能较弱，可塑性差，难以加工成特定的形状[9]，因而限制了它的应用。聚己内脂(PCL)是一种由生物可降解聚合物构成的晶体材料，具有极好的力学性能，其特殊的碳链结构使其具有很好的柔韧性和可加工性[10]，并且PCL在生物体内的降解速度较慢，可作为血管支架材料避免血管再狭窄，实现长期通畅。
这2种材料的混合物具有良好的生物相容性和可调的力学性能。用超细纤维制备的组织工程支架具有多孔结构、比表面积大及适合于细胞迁移和增殖等特点[11]，而且细胞在小于本身的直径(微米级)的纤维上具有更好的黏附特性[12]。
静电纺丝技术具有实验条件简单，易操作，步骤少，得到产物长径比大等优点[13]。近年来，静电纺纳米纤维在组织工程中的应用研究不断有所报道。静电纺纳米纤维不但能够形成所需口径的管状结构，特别是能够制备3~6mm口径的血管，而且能够模仿细胞外基质的组成和结构，为细胞提供良好的生长环境，为自体血管的再生和重建提供重要前提。而采用电纺丝制备的多孔三维细胞支架能够更好地仿生天然细胞外基质的结构特点，有望成为理想的组织工程支架。
本研究中综合CS和PCL二者的优点，以静电纺丝的方法制备了CS/PCL血管支架，研究了该血管支架形貌结构、力学性能及在该支架上复合培养内皮祖细胞(EPCs)，评估该血管支架维持细胞黏附、繁殖和分化的能力。
1 实验方法
1.1 材料与制备
壳聚糖(CS,M w=5.5105)，脱己酰度(DD)为90%，购自济南海得贝公司；聚己内酯(PCL)购自山东岱罡
生物科技有限公司，平均分子量为8104；聚乙二醇(PEO),M w=1104，购于Aldrich试剂公司；实验室自备冰醋酸、氯仿、乙醇等溶剂。
把CS和PEO的混合粉末(CS和PEO的质量比为4)溶于90%的冰醋酸水溶液中配置成4%的溶液。然后加入一定的PCL，磁力搅拌溶解，配置成CS与PCL质量比分别为0.5、1、2的混合溶液。另分别配置不含PCL的CS溶液和以氯仿为溶剂配置PCL溶液作为对照。将配制好的混合溶液分别注入5mL的注射器，注射器固定于静电纺丝装置的微量注射泵上，电源阳极输出端与针头相连，阴极输出端与金属接收轴相接，混合溶液在静电力的作用下从针尖喷出，轴心旋转收集所纺纤维，得到血管支架。静电纺丝条件：电压,15kV；推进速度,5m L/min；距离,15~20cm；温度,<30!；湿度,<45%；马达转速,2000r/min。常温下干燥制备CS/PCL普通膜。
1.2 测试方法
干燥的PCL、CS/PCL(CS与PCL的质量比为
2)静电纺丝血管支架喷金，扫描电子显微镜(SEM,
H itachi2s100，日本)观察其形貌和结构。
将血管支架材料剪成长33mm、宽6mm的矩形，浸入盐浴系统中，而后在电子万能试验机(CM T8502，
深圳)上进行单向拉伸实验，拉伸速度为5m m/m in，直至样本拉断，测试温度为常温。以CS/PCL混合溶液常温下干燥制备普通膜。每组平行测试5个样品。
实验分A、B、C、D4组，分别为CS/PCL(CS 与PCL的质量比为2)、PCL、CS静电纺丝膜和普通膜(CS与PCL的质量比为2)。将细胞密度为1105cell/mL的EPCs悬液取3mL滴加到膜上。孵育箱静态复合培养4、12和24h后,PBS洗涤3次。0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，计数板计数,
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杨文静，等：静电纺丝制备壳聚糖/聚己内酯血管支架及表征
计算细胞黏附率：黏附率=黏附细胞数/细胞接种数 100%。将消毒后支架膜(24mm 24mm 1mm)置于超低吸附6孔培养板，调整CM -DiI 标记EPCs 浓度为1 105cell/m L，将细胞悬液3mL 滴加到材料上。置孵育箱中复合培养72h 后,PBS 洗涤3次，荧光显微镜观察拍片。
2 结果与讨论
2.1 C S/PCL 血管支架的SEM 观察
图1为PCL 和CS/PCL(CS 与PCL 的质量比为2)静电纺丝血管支架的SEM 图。可见，静电纺丝法所得到的血管支架表面具有微/纳米的类似天然细胞外基质的微/纳米结构特点，多孔而利于细胞的黏附生长。加入CS 所得CS/PCL 血管支架
图1 静电纺丝制备的PCL (a)和CS /PCL (b)血管支架的SEM 图
Fig.1 SEM images of PCL (a)and CS /PCL (b)
membrane prepared b y electrospinnin g
(M ass ratio of CS to PCL is 2)
的纤维相对PCL 纳米纤维直径变小，平均直径约为400nm ，纤维间的空隙变大，更利于细胞的伸展和黏附。
2.2 血管支架的力学性能
CS/PCL 血管支架必须具有适当的力学特性，才能保证植入宿主体内后能够提供暂时的机械支撑力。CS 与PCL 不同质量比对CS/PCL 血管支架性能的影响如表1所示。可以看出，当CS 与PCL 质量比为0.5时，材料的弹性模量最小，为3.45M Pa 。随着PCL 加入量的增加，断裂强度逐渐降低，断裂伸长率增大，最大达31.64%。图2为CS/PCL 血管支架应力-应变曲线。可见，当CS 与PCL 的质量比为2时，在弹性阶段与其它2种材料相比，相同的外力作用下其弹性变形较大，弹性变形能力较强，韧性较好。
表1 不同质量比CS/PC 血管支架的力学性能Table 1 Mechanical property of vascular scaff olds of
CS/PC L with different mass ratios
M ass ratio of CS to PCL Br eaking strength/M Pa Breaking elongation/%Elas tic m odu lus/M Pa 2.0 6.02#3.4 4.60#0.380.21#0.91.0 2.79#1.516.98#0.57.11#0.40.5
2.05#2.1
31.64#0.7
3.45#0.5
图2 不同血管支架材料在室温下的应力-应变曲线Fig.2 Curves of stress-strain of variou s electrospun vascular scaffolds prepar ed with differen t mass ratios of CS to TPP
2.3 复合共培养EPCs 在血管支架膜上的黏附表2为EPCs 在不同时间和不同CS/PCL 血管支架材料上的黏附率。可以看出，静电纺丝制备的的CS/PCL(CS 与PCL 的质量比为2)、PCL 、CS
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组膜上的黏附率值相对高于CS/PCL(CS 与PCL 的质量比为2)的普通膜；静电纺丝PCL 和CS 膜的黏附率相差不大；而综合了二者优点的静电纺丝CS/PCL 膜的黏附率最高。这说明CS/PCL 血管支架综合了CS 优点，具有良好的生物相容性，并且静电纺丝技术得到的类似天然细胞外基质的微/纳米多孔结构更利于细胞黏附生长。荧光显微镜观察结果(图3)与以上结果相符,EPCs 在静
电纺丝制备的CS/PCL 血管支架上的细胞数量最多。因此静电纺丝制备的CS/PCL 血管支架可为组织工程内皮种子细胞种植提供一种合适的支架。
3 结 论
(1)采用静电纺丝成功制备了CS/PCL 血管支架。SEM 表征和力学性能测试表明CS/PCL 血管
表2 EPCs 在不同时间和不同血管支架材料上的黏附率
Table 2 Adhesion rates at different culturing times on various vascular scaffolds
%
Culturing tim e
4h
12h 24h Electros pun CS/PCL(M ass ratio of CS to PCL is 2)37.02#3.6288.33#3.6995.10#3.33Electros pun PCL 34.87#3.6382.40#5.0388.17#3.24Electros pun CS
30.44#5.2385.34#6.2189.02#2.19Gen eral mem bran e CS/PCL (M ass ratio of CS to PCL is 2)
27.47#4.21
62.82#3.75
70.24#4.
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图3 CM -DiI 标记的EPCs 细胞复合培养72h 的荧光显微镜观察照片
Fig.3 Observation EPCs labeled with CM -DiI on cultu ring tim e of 72h by flu or escence micros copy ((a)Electros pun CS/PCL(M ass ratio of CS to PCL is 2);(b)Electrospun PCL;(c)E lectr os pun CS;
(d)Gen eral memb ran e CS/PCL(M ass ratio of CS to PCL is 2))
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107∀杨文静，等：静电纺丝制备壳聚糖/聚己内酯血管支架及表征
支架具有类似天然细胞外基质微/纳米结构的多孔结构，纤维平均直径在400nm左右。当CS与PCL 的质量比为0.5时，静电纺丝所制备CS/PCL血管支架的弹性最大形变达到31.64%，应力-应变曲线显示其弹性变形能力较强。
(2)复合共培养EPCs测定细胞在血管支架膜上的黏附率和荧光显微镜观察细胞在支架膜上的形态和分布结果表明，静电纺丝制备的CS/PCL血管支架综合了CS和PCL二者优点，具有良好的细胞相容性，
表面多孔结构利于细胞黏附生长。因此静电纺丝制备的CS/PCL血管支架有可能为组织工程内皮种子细胞的种植提供一种合适的支架。
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