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【摘 要】微囊藻(Microcystis)产生大量胞外多糖(EPS),包括包裹在细胞外的胶鞘多糖(CPS)和释放到周围环境中的水溶性多糖(RPS).为探究EPS在蓝藻水华发生中的生理生态学意义,迫切需要了解微囊藻EPS的化学特性.本文从太湖分离体微囊藻,经过大约18个月实验室培养后,其中一些藻株转变为单细胞形态.选择5株体藻和4株单细胞藻,比较分析这些藻株EPS的化学特性发现:(1)所有9株藻的EPS均为含有脱氧己糖的酸性杂多糖;(2)所有9株藻的CPS的糖醛酸含量(1.2％ ～2.1％)均低于RPS的糖醛酸含量(2.4％～6.2％);(3)所有9株藻的EPS均含有乙酰基和硫酸基,其中,每一株藻CPS的乙酰基含量均高于RPS的乙酰基含量,所有体藻CPS的乙酰基含量(4.1％～6.6％)高于所有单细胞藻CPS的乙酰基含量(2.0％～3.2％).本文进而讨论了EPS化学特性对EPS水溶性和微囊藻体形成的影响,以及对其生态学作用的影响.在这些化学特性中,乙酰取代基团被认为可能是影响微囊藻EPS生理生态学作用的重要因素.【期刊名称】《湖泊科学》
【年(卷),期】2016(028)003
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复方金荞麦颗粒【总页数】7页(P609-615)
【关键词】微囊藻;胞外多糖;乙酰基;疏水性;体形成
【作 者】陈毛珍;谢梅娟;巫伟;喻富根;李朋富
【作者单位】南京大学生命科学学院,南京210093;南京大学生命科学学院,南京210093;南京大学生命科学学院,南京210093;南京大学生命科学学院,南京210093;南京大学生命科学学院,南京210093
【正文语种】中 文
蓝藻水华是危害公共健康和环境安全的全球性问题．微囊藻(Microcystis)是在湖泊和水库中形成蓝藻水华的最常见藻类．与其他蓝藻一样，微囊藻产生大量胞外多糖(EPS)，其中包括粘附在细胞外的胶鞘多糖(capsular polysaccharide，CPS)和释放到周围环境中的水溶性多糖(water-soluble released polysaccharide，RPS)[1]．据报道，英国Cheshire郡一个富营养化淡水湖泊中，其变温层(epilimnion)中的微囊藻胞外多糖粘液层占湖水总体积的0.0001%～0.007%，在水华暴发高峰期，细胞多糖粘液层达到湖水总体积的0.06% [2]．大
加热膜量存在的微囊藻EPS影响水环境中的微生物丰度和多样性、有机颗粒(organic aggregates)形成、碳循环和金属元素循环[3-4]．
众所周知，在自然界中微囊藻主要以体形态存在，细胞因多糖粘液层包裹而成为体[5]．然而，在实验室中长期培养后，微囊藻丧失体特性，主要以单细胞形态存在[6]．体的形成有利于微囊藻垂直迁移和抵御浮游动物的摄食[7]．此外，体微囊藻比单细胞微囊藻拥有更高效的光合电子传递系统，有更高的低磷水平亲和力和较高的防御溶藻细菌的能力[8-10]．研究表明浮游动物摄食和藻菌相互作用可能是影响体形成的重要因素[11-12]．此外，微囊藻细胞表面疏水性可能在细胞间粘附和体形成中发挥重要作用，而细胞疏水性与细胞表面多糖相关[13]．
到目前为止，对微囊藻EPS化学特性的了解较少．已有报道显示，微囊藻EPS的单糖组成具有藻株特异性，并且多为酸性杂多糖[4,14-17]．为了探究微囊藻EPS在蓝藻水华发生过程中的作用，迫切需要对EPS的化学特性进行更多更深入的研究．本文对体微囊藻和单细胞微囊藻CPS和RPS的化学特性进行比较研究，并讨论EPS化学特性与其生理生态作用的相关性．
2011年8月从太湖采集微囊藻水华样品，在显微镜下观察并进行形态学分类鉴定[18]，用微量进样器头挑取单个微囊藻体，经过无菌水洗涤后用BG11培养基在试管中进行培养[19]，随后转入50 ml三角瓶中继续培养．实验室培养约18个月后，有些藻株保持体形态，而一些藻株失去体特性以单细胞形态存在．本文选择5株体藻和4株单细胞藻用于实验．5株体藻为惠氏微囊藻(M. wesenbergii)H4和H16、坚实微囊藻(M. firma)H54、铜绿微囊藻(M. aeruginosa)H169和水华微囊藻(M. flos-aquae)H183，4株单细胞藻为惠氏微囊藻H50和H2、坚实微囊藻H43和铜绿微囊藻H177．所选藻株在3 L三角瓶中培养，培养时连续通入过滤空气．培养温度为25℃，光照强度为2500 lx，光暗周期比为12 h∶12 h．
微囊藻培养30 d后进入稳定期，7000 转/min离心收集含RPS的上清液，并依次用0.45和0.22 μm的微孔滤膜过滤．将滤液转移到截留分子量为7000 Dalton的透析袋中，在蒸馏水中4℃透析72 h，随后45℃减压蒸馏浓缩．CPS从沉淀的藻细胞中提取，用0.05% NaCl溶液重悬藻细胞，60℃水浴30 min[20]．随后离心收集含CPS的上清液，过滤、透析和浓缩的方法同上．由于冷冻干燥的多糖在水中不能完全溶解，因此直接将一部分浓缩后的多糖用于测定蛋白质、糖醛酸和取代基团含量．另一部分浓缩后的多糖溶液在测定体积后，冷冻干燥、称重，并计算浓缩多糖溶液中RPS或CPS含量．
蛋白质含量用Bradford方法测定，标样采用牛血清白蛋白[23]．糖醛酸含量的分析按照Blumenkrantz等[24]的方法，多糖溶液与四硼酸钠硫酸溶液反应后，进一步与间羟联苯反应，反应产物在520 nm处测定光吸收值，以葡萄糖醛酸为标样．乙酰基含量利用多糖中的乙酰基与碱性羟胺反应生成乙酰氧肟酸(acetohydroxamic acid)进行测定，以葡萄糖五乙酸酯为标样[25]．丙酮酸含量分析通过多糖酸水解(1 N HCl，6 h，100℃)释放的丙酮酸转化为2，4-二硝基苯肼衍生物后进行测定，以丙酮酸为标样[26]．硫酸基团含量通过多糖酸水解后释放的硫酸基团与氯化钡反应生成硫酸钡进行测定，以硫酸钾为标样[27]．
蓝藻细胞表面疏水性采用细菌粘附于碳氢化合物(BATH)方法进行测定[28]．测定细胞疏水性前，先用超声波处理微囊藻体(80 W，20 Hz，1 min)[13]．离心收集藻细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS，10 mmol/L，pH 7.2)洗涤两次并重悬于PBS中至OD560≈0.9．取5 ml洗涤后的细胞悬浮液加2 ml二甲苯于试管中涡旋混合1 min．静置10 min，测定下层水相OD560．蓝藻的疏水性表示为：(ODi-ODf)/ODi×100，其中ODi和ODf分别是最初和最终的细胞悬浮液OD560．
从太湖分离到的体微囊藻经过大约18个月的实验室培养后出现3类不同的形态：有的藻
株完全转变为单细胞形态，一些藻株转变为单细胞和体共存的状态，有的藻株仍以体形态存在．为了提取多糖而进行通气培养后发现，体微囊藻在通气搅拌培养后出现了2类形态：有的变成了单细胞和体共存的状态，而有的仍以体形态存在．这说明在实验室培养过程中微囊藻体的稳定性有差异，本文试图通过CPS化学特性的比较分析来探讨导致体稳定性差异的原因．微囊藻H4、H16、H54、H169和H183都是在通气培养后仍然全部以体形态存在的藻株，是体稳定性较高的藻株．微囊藻H50、H2、H43和H177是在培养过程中全部以单细胞形态存在的藻株，是由体很不稳定的微囊藻藻株转变而来的．
体微囊藻的CPS和RPS中含有7～9种单糖，单细胞微囊藻的CPS和RPS中含有7～8种单糖(表1、2)．所有微囊藻的CPS和RPS中都含有蛋白质、脱氧己糖(岩藻糖和/或鼠李糖)和酸性己糖(葡萄糖醛酸和/或半乳糖醛酸)，都含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸(表1、2和3)．对于CPS和RPS，不同的微囊藻藻株间单糖组成存在差异．其中，脱氧己糖岩藻糖在微囊藻H16中缺乏，戊糖阿拉伯糖在微囊藻H50中缺乏，戊糖木糖在微囊藻H2、H43和H177中缺乏，半乳糖醛酸在4个藻株(H16、H183、H169和H50)中缺乏，另外，阿拉伯糖也在藻株H183的CPS中缺乏．比较同一株藻的CPS和RPS发现，除了藻株H
183以外，同一株藻CPS和RPS含有的单糖种类是相同的，但是，从单糖摩尔比看，它们的组成都不同．对于每个微囊藻藻株，CPS的蛋白质含量比RPS的高，而CPS中糖醛酸含量(1.2%～2.1%)低于RPS的糖醛酸含量(2.4%～6.2%)(表3)．比较体藻(5株)和单细胞藻(4株)的单糖组成、糖醛酸和蛋白质含量，不管是RPS还是CPS，都没有发现规律性的差异．
