魏丹芸;张洪;彭锐;张英
【摘 要】Objective To construct the lentiviral vecter carrying human ABCC2 gene,then to screen out the stable cell line over -ex-pressing ABCC2 after package and transfection to HEK293 cells,thus to provide cell model to determine substrate drugs of multidrug re-sistance protein 2(MRP2)in vitro.Methods The primers were designed according to the cDNA sequence of ABCC2 gene from Gen-Bank.The gene were amplified by PCR and connected to lentiviral vector PEZ -LV105.The recombined lentiviral vector was pack-aged and transfected to HEK293 cells.After puromycin screening,HEK293 cells over -expressing human ABCC2 gene were selected and cloned.Finally,gene sequencing,real -time quantitative PCR(RTQ -PCR)and Western blot assays were performed for identifica-tion.Results RTQ -PCR showed that the ABCC2 mRNA in HEK293 cells transfected with exogenous ABCC2 gene was about 320 times higher than that of normal HEK293 cells and blank carrier HEK293 cells.MRP2 protein level in HEK293 cells with ABCC2 gene transfecti铸铁工艺
on was nearly 150 times higher than that of normal HEK293 cells and blank carrier HEK293 cells according to the Western blot.Conclusions Stable recombinant cell line over -expressing ABCC2 was successfully generated.The cell line could be useful in the confirmation of substrate drugs of multidrug resistance protein 2(MRP2)and the transport mechanism in vitro.%目的：构建携带 ABCC2基因的慢病毒载体，转染 HEK293细胞，筛选出稳定过表达 ABCC2基因的细胞株并进行鉴定，为体外实验确定与多药耐药相关蛋白2（MRP2）外排转运相关的底物药物及其转运机制提供细胞模型。方法根据 GenBank提供的 ABCC2基因 cDNA 序列设计引物，PCR 扩增该基因并将其连接至慢病毒载体 PZE －LV105，包装病毒并感染 HEK293细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到过表达 ABCC2基因的稳转细胞株，通过基因测序、实时荧光定量 PCR（RTQ －PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）对稳转细胞进行鉴定。结果测序结果证明重组慢病毒过表达载体所携带的 ABCC2基因序列与 Gen-Bank 提供的 ABCC2序列一致；RTQ －PCR 分析结果显示转染了 ABCC2基因的 HEK293细胞中 MRP2的 mRNA 相对表达比正常 HEK293细胞和空白载体对照 HEK293细胞高出约320倍；蛋白免疫印迹试验显示，转染了 ABCC2基因的 HEK293细胞中MRP2蛋白表达水平比正常 HEK293细胞和空白载体对照 HEK293细胞高出约150倍。结 论该实验成功构建了稳定过表达ABCC2基因的细胞株，该细胞株可用于初步筛选确定 MRP2的特异性外排转运底物及其转运机制。
落叶的忧伤【期刊名称】《安徽医药》
喜博论坛【年(卷),期】2016(020)003
【总页数】4页(P433-436)
【关键词】ABCC2 基因;过表达;慢病毒载体;HEK293 细胞
【作 者】安徽医药魏丹芸;张洪;彭锐;张英
【作者单位】武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060;武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060;武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060;武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060
【正文语种】中 文
ABCC2基因编码的蛋白质是一种ATP结合盒转运蛋白，一般称作ABCC2转运蛋白或者多药耐药相关蛋白2(MRP2)。该蛋白主要分布在肝脏、胆囊、肾脏、小肠和结肠等组织细胞[1]，负责外排转运特异性底物，尤其在很多物和有毒性外源性物质的胆汁排泄中发挥重要作用[2-4]。虽然ABCC2转运蛋白的底物化合物广泛，但其在不同的底物化合物转运中发挥作用的大小却不尽相同，因此，该转运蛋白很可能与底物药物的药效和不良反应等高度相关。目前，国内外已经有一些研究通过比较正常小鼠和ABCC2缺陷小鼠对一些药物的转运活性来确定ABCC2蛋白的特异性底物及其对药物应用的影响[5-6]，然而，通过构建稳定过表达ABCC2的细胞株不仅可以直观地定量该蛋白表达水平，研究该蛋白的功能活性，减少科研成本，还可以一定程度上排除体内其他相关转运体的干扰。除此之外，构建目的基因表达沉默的重组细胞也可以从另一方面反映目的蛋白的作用。因此，本研究通过分子克隆技术，构建了稳定过表达ABCC2的HEK293细胞株，为进一步研究确定与多药耐药相关蛋白2(MRP2)外排转运相关的底物药物及其转运机制提供重要的实验工具。
1.1 细胞 HEK293细胞(购自莱德尔生物科技有限公司)；293Ta 慢病毒包装细胞系(GeneCopoeia Cat No. Clv-PK-01)；GCI-L3 化学感受态细胞(GeneCopoeia Cat No. STK300-10)；H1299 细胞系(ATCC Cat No.CRL-5803)。
1.2 试剂 PRM1640和DMEM培养基(购自美国Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司，Cat.No.SH30087.01)；0.25%胰酶-0.125%EDTA(Gibco公司)；青链霉素(Hyclone，Cat.No. SH30010)；PBS磷酸钾缓冲液(Hyclone，Cat.No.SH30256.01B)；嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific Inc公司，货号A1113802)；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶(购自GeneCopoeia公司)；Premix Prime STARHSR试剂盒、Neasy Mini Kit试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒(购自北京全式金生物公司)；HET高效转染试剂盒(深圳百恩维生物科技有限公司，货号：BW11002)；SYBR Primescript RT-PCR Kit(购自大连Takara 公司)；引物合成及测序(由GeneCopoeia公司完成)；慢病毒载体PEZ-LV105(购自GeneCopoeia公司，Cat.No.EX-Q0603-Lv105)；ABCC2抗体(购自英国ABCAM公司)；二抗Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP (Southern biotech 货号：6170-05 )；Polybrene(Sigma公司产品，Cat. No. H9268)；其它化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，试剂为分析纯。
1.3 仪器 单人超净台(AIRTECH)；CB150CoZ细胞培养箱(德国Binder)；CKX41倒置显微镜(Olympus)；电泳仪(Power Pac Basic，美国Bio-Rad公司)；高速离心机(Thermo Frescozl)；Thermo落地式培养摇床Forma 481(美国Thermo公司)；Odyssey infrared imaging system Odyssey双红外激光成像系统(LI-COR)；定量PCR仪(
庚子国变记
ABI PRISM 7500 Sequence Detection System)；DU730核酸/蛋白分析仪(美国BECKMANCOULTER)；Positive clone 测序(Genecopoeia)。
1.4 重组慢病毒载体质粒的构建与鉴定
1.4.1 PCR扩增人ABCC2基因 根据NCBI基因库中提供的人类ABCC2基因序列(ACCESSION NO. ：NM_000392)并遵照引物设计原则设计相应的引物。用于复制目的基因的PCR上游引物序列F： CTCGAG atgctggagaagttctgcaactc(大写字母代表XhoⅠ 酶切位点)，下游引物序列R： TTCGAActagaattttgtgctgttcacattc(大写字母代表NSPⅤ 酶切位点)。用于检测目的基因表达的RTQ-PCR上游引物序列F：CCGTATCAGGTTTGCCAGTT，下游引物序列R：TGGAGGTGATCCAGGAAAAG。实验中作为内参的β-actin 的上游引物是:5'-ACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3'，下游引物是：5'-CATGTCGTCCCAGTTGGTG-3'，引物均由GeneCopoeia公司合成。常规方法提取正常HEK239细胞中总RNA，配置反转录反应体系合成cDNA，以cDNA为模板，依照Premix Prime STARHSR试剂盒说明书配制PCR扩增体系溶液，PCR反应条件为98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，30个循环。扩增产物行1 %琼脂糖凝胶电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收RT-PCR产物。
1.4.2 PEZ-ABCC2-LV105载体质粒的构建及鉴定 用Xho Ⅰ和NSP Ⅴ 限制性内切酶对ABCC2扩增产物及PEZ-LV105质粒分别进行双酶切，酶切得到的产物通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，用In-Fusion®HD EcoDryTmCloning Kit 做In-fusion连接反应，将反应体系置于37°C孵育15 min，然后50°C孵育15 min，然后置于冰上，使外源DNA片段和质粒载体进行连接。用所得连接产物转化感受态细菌GCI-L3，涂含氨苄霉素抗性平板，挑取克隆，摇菌过夜，提取质粒。重组质粒用Xho Ⅰ 和NSP Ⅴ 限制性内切酶双酶切初步鉴定后，由GeneCopoeia公司测序验证，筛选出所需的重组质粒，质粒命名为PEZ-ABCC2-LV105。
1.4.3 重组慢病毒的包装与转染 复苏293Ta细胞，在24孔板中以每孔2×105个细胞接种，以DMEM和胎牛血清(FBS)配制完全培养液(89%DMEM+10%FBS+1%青链霉素)。用慢病毒载体对应的慢病毒包装试剂盒将PEZ-ABCC2-LV105和包装载体共转染至293Ta细胞中。在细胞培养恒温箱中孵育48 h后吸取上清培养液，用0.45 μm 的低蛋白结合PES过滤膜过滤该培养基收集病毒上清。检测病毒滴度，分装后在-80℃冰箱保存，待用时取出融化。将人胚胎肾细胞HEK293接种于96孔板，24 h后加入包装好的重组慢病毒，再过24 h加0.25 mg·L-1的嘌呤霉素培养基于每孔，压力筛选1周，中间换液1次。1周后倒置显微镜下观察，细胞培养板上圈出每一个细胞，标记，用0.25%胰酶消化画圈的细胞，每一
团细胞收集到新的24孔板的一个孔培养，继续用0.25 mg·L-1的嘌呤霉素压力筛选1周，做亚克隆筛选。再用倒置显微镜下观察，挑选出正常生长细胞传代，用0.20 mg·L-1的嘌呤霉素维持1个月稳定培养，获得稳定转染重组质粒细胞株。将没有插入ABCC2基因片段的载体转染HEK293细胞后得到的细胞作为空白载体对照。
1.5 ABCC2过表达细胞株的鉴定
刘特左
1.5.1 实时荧光定量PCR检测ABCC2 mRNA 分别在6孔板中接种HEK293正常细胞、空白载体对照细胞和ABCC2过表达细胞，每孔约2×105个细胞。24 h后分别提取各自细胞组的总RNA，取1 μL RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus 艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。用Primescript RT-PCR Kit将总RNA转录为cDNA。取三种细胞的cDNA 各5 μL，以之为模板进行Q-PCR，检测ABCC2 mRNA的表达量变化，确认ABCC2过表达细胞株。
