乔录新;张玉林;丁渭;陈德喜
【摘 要】Objective To construct a eukaryotic expression vector which can transport foreign protein into mitochondria. Methods The mitochondrial transit peptide's sequences were fused with EGFP through multiplex PCR amplification and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1, constructing the eukaryotic expression vector pcDNA5. 1-EGFP. Then the P53 gene was inserted into pcDNA5. 1-EGFP and pcDNA3. 1, constructing pcDNA5. 1-P53 and pcDNA3. 1-P53 vector. After verification by restriction enzyme digestion and sequencing, the plasmids were transfected into 293T cells for profiling the distribution of EFGP and cytochrome C in the cell, and the positioning of P53 protein in the cell. Results The distribution of EGFP was consistent with cytochrome C, and the P53 protein expressed by pcDNA5. 1-P53 was concentrated in mitochondria in the cytoplasm, while the vector pcDNA3. 1-P53 was mainly distributed in the nucleus. Conclusions The eukaryotic expression vector was successfully constructed, which may tra
nsport foreign protein into the mitochondria.%目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿荧光蛋白与细胞素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿荧光的表达分布与细胞素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体. 【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2012(000)009
【总页数】指纹检材是什么意思6页(P992-997)
【关键词】表达载体;绿荧光蛋白;线粒体导肽
【作 者】乔录新;张玉林;丁渭;陈德喜
【作者单位】首都医科大学附属北京佑安医院感染科,北京100069;首都医科大学附属北京佑安医院感染科,北京100069;首都医科大学附属北京佑安医院感染科,北京100069;首都医科大学附属北京佑安医院感染科,北京100069
【正文语种】城市表层土壤重金属污染分析中 文
【中图分类】R34
广德县卫生局线粒体是真核细胞重要的细胞器，是人体的动力工厂，无论是细胞的成活(氧化磷酸化)和细胞死亡(凋亡)均与线粒体功能有关，特别是呼吸链的氧化磷酸化异常与许多人类疾病有关。自从Luft等［1］首次报道1例线粒体肌病以来，因线粒体功能障碍导致的疾病已累及全身多个系统，其中以神经系统和肌肉系统受累表现突出，近年来有发现线粒体与各种肿瘤的发生有密切关系［2］。因此有关线粒体的研究已经成为人们关注的焦点。
每个线粒体内大约含有1 000～1 500种蛋白质［3］。这些蛋白质大部分都是由细胞核DNA编码经转录翻译并在细胞质核糖体合成后运入线粒体的，参与电子传递和ATP合成、
三羧酸循环、脂肪酸氧化或氨基酸降解等重要生理过程，与众多线粒体疾病的发生发展有着密切关系。因此，对这些蛋白质在生理及病理状态下的变化趋势及相互关系的研究是一项十分必要和有意义的工作。本研究构建含有线粒体导肽的真核表达载体，并且在载体上加有EGFP示踪其蛋白的表达情况，为研究线粒体内蛋白质的功能及相互作用提供直观便捷的工具。
限制性内切酶 ApaⅠ，XbaⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，DNA Marker，T4 DNA Ligase，Taq酶(Takara公司);质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒(博迈德生物科技有限公司);细胞转染试剂Lipofectin(Invitrogen公司);JM109感受态(北京全式金生物科技有限公司);鼠抗细胞素C抗体(Zymed Lab公司);鼠抗P53抗体(Sigma公司)。 1.2.1 引物:Cyc-S1:5'-TGGCAAGAGAGGGGGTTC TCATCATCATCATCAT-3'，Cyc-S2:5'-TTAGCCTAAT TGGCAAGAGAGGGGGTTCTCATCATC-3'，Cyc-S3:5'-ACCAGGGCACTTAGCCTAATTGGCAAGAGAGGGGG-3'，Cyc-S4:5'-CCATGTTGGCTACCAGGGCACTTAG CCTAATTGGCA-3'，Cyc-S5:5'-AGCAAGCTTGCCAC CATGTTGGCTACCAGGGCACTTAGCC-3'，Cyc-AS:5'-AGCGGG
TTTAAACGGGCCCTC-3';P53-S:5'-TATCT AGAGAGGAGCCGCAGTCA-3'，P53-AS:5'-GAGGGC CCAGTCTGAGTCAG-3'。引物的合成及测序均由上海生工生物技术有限公司完成。
1.2.2 载体:pGEM-T easy载体(Promega公司)，pcDNA4.1-EGFP载体(本实验室构建EGFP插入位点为KpnⅠ和XbaⅠ)，pcDNA 3.1载体(Invitrogen公司)，pCMV-P53载体(Clontech公司)。
人肾上皮细胞系(293T细胞，中国科学院)，在含有10%灭活小牛血清的DMEM培养液中常规培养。
PCR 1:引物:Cyc-S1，CYC-AS;模板:pcDNA4.1-EGFP;PCR反应体系:pcDNA4.1-EGFP 50 ng，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L，终体积50 μL;反应条件:94 ℃ 1 min;94℃ 15 s，65℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环。
PCR 2:引物:Cyc-S2，CYC-AS;模板:1 μL PCR1产物;PCR 条件:每50 μL体系中加1 μL PCR 1产物，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L;反应条件:94℃ 1 min;
94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。PCR 2产物的纯化、连接、转化及验证:二轮产物行0.8%琼脂糖电泳后切胶回收(参照试剂说明书进行)，与pGEMT easy载体连接，连接方法参照Takara T4 DNA Ligase说明书。将上述连接产物pGEM-T-PCR2转化至JM109细胞内，氨苄抗性筛选克隆并提取质粒，EcoRⅠ酶切验证，具体步骤参照精编分子生物学实验指南［4］。
全能教教主
PCR 3:引物:Cyc-S3;CYC-AS模板:pGEM-TPCR2质粒。反应体系:pGEM-T-PCR2质粒50 ng，引 物 200 nmol/L， DNA 聚 合 酶 1 μL， dNTP 200 nmol/L，终体积为50 μL体积，反应条件:94 ℃1 min;94 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环。
PCR 4:引物:Cyc-S4;CYC-AS 模板:1 μL PCR3产物;PCR 条件:每50 μL体系中加1 μL PCR3 产物，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP nmol/L。反应条件:94℃ 1 min;94℃ 15 s，65℃30 s，72℃ 2 min，30个循环。PCR 4产物的纯化，连接、转化及验证具体操作同PCR2。
PCR 5:引物 Cyc-S5;CYC-AS模板:pGEM-T-PCR4(PCR4扩增TA克隆质粒)质粒;反应体系:PGEM-T-PCR4质粒50 ng，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L。
终体积为50 μL体积;反应条件:94℃ 1 min;94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。PCR 5产物的纯化、连接、转化及验证具体操作同上。
PCR6:引物P53-S，P53-AS;模板:pcmv-P53质粒;反应体系:pCMV-P53质粒50 ng，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L，终体积为50 μL;反应条件:94℃ 2 min;94℃15 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。PCR 6产物的纯化、连接、转化及验证:PCR 6产物行0.8%琼脂糖电泳后切胶回收，与pGEM-T easy载体连接，连接方法参照Takara T4 DNA Ligase说明书。将上述连接产物pGEM-T-PCR6转化至JM109细胞内，氨苄抗性筛选克隆并提取质粒，EcoRⅠ酶切及测序验证，具体步骤参照精编分子生物学实验指南［4］。
限制性内切酶HindⅢ 和ApaⅠ双酶切pGEMT-PCR5正确质粒，回收含有线粒体导肽序列的EGFP目的片段，并用限制性内切酶HindⅢ和ApaⅠ双酶切pcDNA3.1载体，回收载体大片段，连接转化提取质粒步骤同上，HindⅢ和ApaⅠ酶切及测序验证，阳性克隆命名为pcDNA5.1-EGFP(因为该质粒上带有线粒体导肽序列，为了和原有pcDNA3.1质粒区别，特命名为pcDNA5.1-EGFP)。
限制性内切酶XbaⅠ和ApaⅠ双酶切pGEM-TPCR6正确质粒，回收P53目的片段，限制性内切酶XbaⅠ和ApaⅠ切 pcDNA5.1-EGFP和 pcDNA3.1载体，分别回收载体大片段，连接转化提质粒步骤同上，提取质粒ApaⅠ酶切及测序验证读码框正确，阳性克隆命名为pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53。
293T细胞从液氮中取出复苏后，传代。转染前1天，胰蛋白酶消化细胞并计数，将细胞铺到6孔板(3盘)，细胞汇合为60% ～80%时转染。取1 μg质粒DNA，按Lipofectin试剂操作说明进行转染。其中1盘细胞转染pcDNA5.1-EGFP，另外两盘细胞分别转染 pcDNA5.1-P53(实验组)和pcDNA3.1-P53(对照组)。转染后，3盘细胞继续培养24 h，做如下处理:PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定，含 5%BSA、0.25%Triton-X-100的 PBS封闭2 h。转染pcDNA5.1-EGFP质粒的细胞加入鼠抗细胞素c抗体，室温下孵育1 h，PBS洗3次，加入荧光素标记兔抗鼠IgG，室温下避光孵育1 h，PBS漂洗后封片;pcDNA5.1-P53实验组细胞和pcDNA3.1-P53对照组细胞分别加鼠抗P53抗体室温下孵育1 h，PBS洗3次，加入荧光素标记兔抗鼠IgG，室温下避光孵育1 h，PBS漂洗去除二抗，加入DAPI染液室温作用15 min以上，PBS漂洗3次后封片;于荧光显微镜下观察细胞素C，绿荧光蛋白以及两组P53蛋白在细胞内的分布情况。
碳片
