网络出版时间：2020-12-29：10网络出版地址0ttps：//koskV oeUkcms/demd/34.1065.R.20201241.1526.htmi
曾健1，蒋斌1，黄果2，陈娟5
摘要目的探究短发夹RNA(shRNA)干扰载体沉默胶原三螺旋重复蛋白1(CTHRC1)诱导人乳腺癌MCFV细胞凋亡的分子机制。方法将shRNAVTHRC1质粒和阴性对照质粒转染至乳腺癌MCFV细胞，采用qPCR法和Western blot 法分别检测CTHRC1mRNA和蛋白表达水平;CCKV法和流式细胞术法分别检测细胞增殖活力和凋亡率；线粒体膜电位试剂盒(JCV0染法)检测细胞线粒体膜电位变化;Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase3、细胞素C(Cyt C)以及p53介导的线粒体凋亡途径相关蛋白p53、Aph-1、C/aveP-caspase9、BclV、Ba和PUMA等表达水平。将shRNA-CTHRC1质粒和siv53干扰质粒分别或同时转染至MCFV 细胞中,Western blot法检测p53和Cyt C蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率。结果沉默CTHRC1可降低MCF-7细胞中CTHRC1mRNA和蛋白表达水平，抑制细胞增殖活力，提高细胞凋亡率，降低线粒体膜电位，上调CleaveP-caspase3、p53、Aph-1、C/uveP-caspase9、B up、PUMA和胞质中Cyt C等蛋白表达水平，下调BclV和线粒体中Cyt C蛋白表达水平。然而，干扰P53表达可逆转CTHRC1 沉默对MCF-7细胞凋亡的促进作用。结论CTHRC1沉默通过激活P53介导的线粒体凋亡途径诱导人乳腺癌MCFV细胞发生凋亡。
关键词乳腺癌；胶原三螺旋重复蛋白1;p53；线粒体；细胞凋亡
中图分类号R737.9
文献标志码A文章编号1004-1492(2424)12-1833-47 doi：14.19445/jki.issnl000-1492.2020.12.404
乳腺癌是一种激素依赖性的高度异质性肿瘤，是女性癌症相关死亡的主要原因［1］，其早期极易漏检，而确诊时往往已是晚期，同时高度异质性使其预后较差［］。胶原三螺旋重复蛋白1(＜：010/60tUpie helio repeat containiny-1,CTHRC1)是一种抑制胶原蛋白表达和增加细胞迁移的分泌蛋白，可参与肿
2222-06-15接收
基金项目：湖南省临床医疗技术创新引导计划(编号：0918SK51525)作者单位：南华大学附属第二医院1烧伤整形科、7乳甲外科、放疗科，衡阳441221
作者简介：曾健，男，硕士研究生；
雾霾污染蒋斌，男，副主任医师，责任作者,E-miai：1022664259@
qq 瘤病理进程。研究［］显示CTHRC1蛋白在乳腺癌组织高表达，并与乳腺癌不良预后相关;Lal el aU4进一步表明CTHRC1可促进乳腺癌细胞增殖、侵袭与转移，并抑制凋亡，但并未阐明其具体分子机制。y23是一种抑癌基因，通过调控细胞生长、凋亡和DNA损伤修复等过程抑制肿瘤进程［］。研究⑷表明CTHRC1可负调控y23表达，促进肝癌的进程。然而，沉默CTHRC1表达是否可通过上调y23表达而激活线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡，目前尚未阐明。因此，该研究通过探讨CTHRC1沉默是否通过激活y23介导的线粒体凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡，为临床靶向乳腺癌提供更多理论基础。
1材料与方法
1-1主要试剂和仪器人乳腺癌MCF-7细胞株购自北京中国医学科学院基础医学研究所;DMEM细胞培养基和胎牛血清购自美国GiVco公司；shRNA CTHRC1干扰质粒及其阴性对照质粒、siRNA y23干扰质粒及其阴性对照质粒均购自广州锐博生物科技公司；Linofectamine TM3400试剂购自美国Ther-moFRher公司；CTHRC1及GAPDH引物均由上海生工生物公司合成;RT-PCR试剂盒购自上海全式金公司；CCKV试剂盒,Annexin V-4ITC/PI凋亡检测试剂盒、胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-10)购自北京索莱宝科技有限公司; CTHRC1
抗体、PUMA抗体、Bax抗体、Bct-2抗体、Apaf-U抗体均购自美国SANTA公司；caspasp3抗体、Cleaved-caspasp9抗体^Cytocnrome C(Cyt C)抗体均购自美国CST公司;COX IV抗体购自美国A2 2冷00公司；GAPDH抗体购自英国Abeam公司; qPCR仪(V1tU M96vd)Therma-Cyc/rS购自美国TnemloFisPer公司；酶标仪(Synvay H1HyCkoP Reader)购自美国BioTd公司；Western blot显影仪购自上海天能生物公司；流式细胞仪(BD CALI-BUR)购自美国BD公司。
1.2细胞转染取对数生长期人乳腺癌细胞MCF-7种于6孔板中,5xl05个/孔，每孔加2mi含10%牛血清DMEM培养基，置于37C、CO/培养箱进行培养，待细胞贴壁后进行分组：blank组(不做任何处理)、sh-NC组(转染shRNA CTHRC1阴性对照质粒yGPU6/GFP/Nee-NC)、sh-CTHRC1组(转染shR-NA CTHRC1干扰质粒yGPU6/GFP/Nee-4THRC1)。当细胞融合度约达到82%时，按照LinofectamineT M 3000转染试剂说明书进行转染操作，将shRNA CTHRC1阴性对照质粒和shRNA CTHRC1干扰质粒分别转染到MCF-7细胞中，转染48h后，收集细胞样品检测CTHRC1mRNA和蛋白表达情况。CTHRC1shRNA干扰序列：2,-NTCCCAAGTATAAT GGGATN'-2-NTCTGGAGAGATCCAATATV'-
1.3RealPimePCR检测收集各组细胞，采用TRIzoi法提取细胞总RNA，分光光度法测量总RNA 含量及纯度，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。弓|物序列：CTHRC1,F：5'-TCATCGCACTTCTTCTGTGGAt3-R：5'-GCCAACC CAGATAGCAACATCN'；GAPDH,F：5-NAGATCAT CAGCAATGCCTCCN',R：2z VGGACTGTGGTCATGC CTTV；PCR反应条件：95 C.
W min；95C、S5s, 66C、1min,44个循环;94C、S5s;66C、1min; 92C、S5min。以GAPDH为内参，采用7-AA Ct方法计算CTHRC1相对表达量。
1.4Western bloi检测蛋白表达收集各组细胞，采用RIPA裂解液裂解细胞，12000r/min离心22 min，取上清液得到总蛋白样品，使用考马斯亮(G250)检测法测定蛋白浓度。取22pg蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，接着转到PVDF膜上，脱脂牛奶室温封闭2h，洗涤后加入一抗CTHRC1(1 :220)、casyase3(1:1000)、Cyt C(1：1000)、PU-MA(1:520)、Bax(1:520)、Bct-2(1:520)、AyafN (1：1000)、Cleaved-caspase9(1:1000)、COX IV (1:1000)、GAPDH(1:1000),4C孵育过夜，次日PBST缓冲液洗涤后，加入羊抗兔或鼠二抗(1：10000)，室温孵育34min，洗涤后加入显影液，采用Imape-Pro Plush.0软件进行灰度分析，以目的蛋白条带灰度值与对照组条带灰度值的比值为相对表达量。
1.4CCK-7检测细胞活性取对数期各组MCF-7细胞种于99孔板,5000个/孔，置于37C、CO/培养箱分别培养12、24、48、72h。每个培养时间点结束后每孔分别加入10p CCK-5,37C继续培养4h，用酶标仪在452nm下检测吸光度(optica)den-Pty,OD)值，最终以时间为横坐标,OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。
1.2流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期各组MCF-7细胞种于6孔板中,5xl05个/孔，培养48 h后用胰酶轻柔消化得到单细胞，预冷PBS洗3次，加102p i Annexin VVITC结合液重悬浮细胞，再分别加入2p Annexin V-4ITC和10p i PI,25C避光孵育20min后，采用流式细胞仪进行检测。
1.2线粒体膜电位检测取对数生长期各组MCF-7细胞种于6孔板中,5乂105个/孔，培养48h后用胰酶将细胞消化成单细胞，按照线粒体膜电位试剂盒说明书加入1mi1xJCN0染工作液，细胞培养箱中37C孵育22min，用预冷的1x JCN0染缓冲液洗涤2次,200p1xJCN0染缓冲液重悬浮细胞，采用流式细胞仪进行检测。
1.4线粒体和细胞质蛋白中Cyt C蛋白检测收集对数期各组MCF-7细胞，预冷PBS(pH7.4)洗涤细胞2次，按照胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒说明书，利用胞质提取缓冲液和线粒体裂解缓冲液分别提取胞质蛋白和线粒体蛋白，按照上述04实验步骤检测Cyt C蛋白表达情况。
1.4sh-CTHRCl和si-p53共干扰实验将对数期MCF-7细胞种于6孔板,5xl05个/孔，将细胞分组为NC组(转染shRNA CTHRC1阴性对照质粒和siRNA y23阴性对照质粒)、SP-4THRC1组(转染shRNA CTHRC1干扰质粒)、si-p53组(转染PRNA y23干扰质粒)、sh-CTHRC1+siv53组(共转染shRNA CTHRC1干扰质粒和siRNA y23干扰质粒)，采用LinofectamineTM3400将以上质粒转染至MCF-7细胞中，细胞转染48h后收集细胞，按照上述1.0s 00分别检测线粒体和胞质蛋白中Cyt C以及凋亡通路相关蛋白表达水平。y23PRNA干扰片段：5；GAATGAGGCCTTAGAGTTAP；。
1.10统计学处理所有数据均采用SPSS2
2.0统计软件进行分析，本研究的连续数据以3个独立实验的表示。两组比较采用t检验，单因素方差分
析。P<0005为差异有统计学意义。
2结果
2.4CTHCR1沉默对MCF-7细胞中CTHRC1 mRNA和蛋白表达的影响与blank组比较，sh- CTHRC1组细胞中CTHRC1mRNA和蛋白表达水平均下降，差异有统计学意义(F=5
3.92142.942,P
<0. 001)，而 sP-NC 组的 CTHRC1 mRNA 和蛋白表
达水平无明显差异，见图1o 表明成功干扰乳腺癌 MCF-P 细胞中CTHCR1表达。
A
B
.2
.0.8.64.21- 1- o o o o
丁
** I河南工业大学学报
*0.0
1
2
3
图1 CTHCR1沉默后MCFP 细胞中
CTHRC1 mRNA 和蛋白水平检测
A : qPCR 实验检测MCF-2细胞中CTHRC1 mRNA 表达水平；B
Western b/t 实验检测MCF-2细胞中CTHRC1蛋白表达水平；1: blank 组；2：sh-NC 组；3：sh-CTHRC1 组；与 blank 组比较:…P <
0.001
2.4 CTHRC1沉默对MCFP 细胞活性的影响CCK-3实验结果显示，与blank 组比较,sh-CTHRC1
组细胞在培养24、48、72 h 时其增殖活性均被性抑 制，差异有统计学意义(F = 6. 852、10. 36127. 210,
P<0. 05)，见图2o 表明沉默CTHRC1可抑制乳腺
癌MCF-P 细胞增殖。
2.3 CTHRC1沉默后对MCFP 细胞凋亡的影响
流式细胞术检测结果(图3A)显示，与blank 组比
较,sh-CTHRC1组细胞凋亡率性升高，差异有统计 学意义(F = 73. 254, P < 0. 001) , s h-NC 组细胞
凋亡
发生率无差异性,;Western blot 实验结果(图3B)显
示，与blank 组比较,sP-PTHRC1组细胞中ClevveV-
w o s
fe s
f w
12 24 48
72
时间(h)
图2 CCKP 实验检测各实验组细胞活性
1:blank 组；2 ： W-FC 组；3 ： W-FTHRC1 组；与 blank 组比较：* * * P <0. 05, *** P <0. 001
cnspaseC 表达量升高，差异有统计学意义(F =
53.421, P < 0. 001 ) , sh-CC 组细胞中 ClevveV- caspase3表达无差异性。表明沉默CTHRC1可促进
MCF-P 细胞凋亡。
2.3 CTHRC1沉默后对MCFP 线粒体膜电位及
CytC 蛋白胞内定位影响 线粒体膜电位检测结果
(图4A )显示，与blanC 组比较,sh-NC 组细胞线粒体 膜电位无变化,sh-CTHRC1组细胞线粒体膜电位下
降，差异有统计学意义(F =49.011,P <0. 001 )o Western blot 结果(图4B)显示，与blank 组比较,sh- CTHRC1组细胞线粒体中Co- C 蛋白表达降低，差
异有统计学意义(F = 177. 014,P<0. 401 -，而胞质
中Co- C 蛋白表达升高，差异有统计学意义(F =
193.412,P < 0. 401) o 表明 CTHRC1 沉默可导致 MCF-P 细胞线粒体损伤并可能诱发线粒体介导的细
胞凋亡途径。
2.3 CTHRC1沉默后对p53介导的线粒体凋亡途
径相关蛋白表达影响 与blanC 组比较,sh-CTHRC1
组中p53蛋白表达升高，差异有统计学意义(F =
王潮歌老公
60.714,P< 0.401), p53介导的线粒体凋亡途径相
关蛋白Apaf-1、Cleaved-caspase 9表达上升，差异有
统计学意义(F = 42. 331、57. 683, P < 0. 401)，抑凋 亡因子Bci-2蛋白表达下降，差异有统计学意义(F
=23.214,P<0. 001)，而促凋亡因子 Bnx 和 PUMA
蛋白表达上升，差异有统计学意义(F = 44. 075、35. 237, P < 0. 001)，而 sh-NC 组细胞中 Apaf-1、 C/aved-caspase9、Bci-2、Bax 和 PUMA 蛋白表达水平
无差异变化。提示CTHRC1沉默可能通过p53介导 的线粒体途径凋亡诱导MCF-P 细胞凋亡。见图5o
2. 3 CTHRC1和p53共干扰后对MCFP 细胞凋 亡的影响 与NC 组比较,sWp53组细胞p53
蛋白水
Q2-UL(8.38%)Q2-UR(60.66%)
*
醪訝:
Q2-LL(23.97%)
Q2-LR(7.00%)
Annexrn V-FITC
o
o o o
o
8 6 4 2(f )M 4J E 舉
馬B
图3 CTHRC1沉默检测MCF-7凋亡率和凋亡相关蛋白表达
A : Annexiv V 、PI 双染流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡图;
B : Western blot 实验检测cospaso 7蛋白表达水平；:blank 组;2 ： sh-V
C 组；：/-
CTHRC1 组；与 bduk 组比较：* * * P<2. 921
B
io 1 102 1 03 1 04 1 05 1 06 1 07'21072106105104103
Q2-UL Q2-UR (0.0%)
(96.0%)
A
Q2-LL Q2-LR :(0.0%)(4.0%)
101 102 1 03 1 04 1 0’10° 1072101 102 1 03 1 04 1 0’10° 1072
CytC
COX IV
CytC
GAPDH
JC-10绿荧光
图4 CTHRC1沉默后检测MCF-7细胞线粒体膜电位和Cyt C 蛋白表达
A : Annexiv V 、PI 双染流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡图；
B ： Western blot 实验检测Cyt
C 蛋白表达水平；:blank 组；4： sh-VC 组；：/-
CTHRC1 组；与 bduk 组比较：* * * P <2.021
平下调(i =44.941 ,P <0.901、，表明y23干扰成功 (图6A ) o 细胞凋亡检测结果(图6B )显示，与NC
组比较,/-753组细胞凋亡率无差异(=0. 231, >
0. 92 )，而sPVTHRC1组细胞凋亡率增加(= 3& 852, P < 0.001 )；与 sPVTHRC1 组比较,sh-
CTHRC1 + /-723组细胞凋亡率又降低(i = 13.999 , P<0. 91)，说明CTHRC1沉默诱导的MCFV 细胞凋
亡依赖于p23蛋白。Western blot 结果(图6C )显
示，与 sPVTHRC1 组比较,sPVTHRC1 + /-723 组细
胞线粒体中Cyt C 蛋白表达升高(= 21.723, P< 0. 01)，而细胞质Cyt C 蛋白表达降低(i 二65. 129,P
< 0.01)。进一步表明CTHRC1沉默可激活y23介
导的线粒体细胞凋亡途径进而诱导MCFV 细胞凋 亡
。
= 2
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图5 CTHRC1沉默后检测p53介导的 线粒体凋亡途径相关蛋白表达
1: blank 组；2： sh-NC 组；5 ： sh- CTHRC1组；与blank 组比较：P <
0.05, *** P<0. 001
现代化史观A
B
p53GAPDH
io 6105
104103
102
102 io 3 IO 4 10’ 10°106105体访
104103
^o^io^io 4 i? r?
Q3-UL (0.15%)
Q3-UR (6.02%)
Q3-LR (12.70%)
10105
104103
102
io 2 io 3 io 4 10s io 6106105
104103
1O 1O 2 io 3 io 4 io 5 io 6
Q3-UL (0.26%)
Q3-UR (11.04%)
Q3-LR (1&80%)
图6共干扰CTHRC1和p53后检测细胞凋亡率和Cyt C 蛋白胞内定位
A ：WeWern blot 实验检测p57蛋白表达水平;
B ： Annexin V 、PI 双染流式细胞术检测MCFN 细胞凋亡；
C ： WeWern blot 实验检测Cyt C 蛋白表
达水平;1：NC 组；2：sh-FTHRC1 组；7：W n 57 组;4：sh-CTHRC1 + si-p57 组；与 NC 组比较:** P < 0. 01 ,** P < 0. 001；与 sh-CTHRC1 组比较:引擎
#P<0. 01,##P<0.
001
