rescue实验转染步骤
健康之路 性功能背景技术：
在细胞中敲除靶基因并观察所得表型是生物学研究中确定一个基因功能最常用的方法。然而，有一些基因是维持细胞存活必不可少的，称为必需基因。直接敲除必需基因，将导致细胞死亡，无法研究敲除后对细胞功能的影响。这类基因只能靠条件性敲除研究。杨贵妃传
已有的几种条件性敲除方法总结如下：
（1）cre/loxp重组系统是条件性敲除必需基因最常用的方法。该技术需要在靶基因两侧插入一对34bp的loxp位点，在cre重组酶作用下，两个lox位点之间的序列会发生重组删除。所用的cre重组酶一般为mer—cre—mer，加雌激素cre可以发挥重组功能。cre需要整合到基因组上表达。
（2）另一种常用的方法是利用tet—on/tet—off调控基因表达。首先构建一个稳定表达转录激活因子tta的细胞系，然后将tre启动子插入到内源基因上游启动子序列中，这样就可以调控内源基因表达。也可以先引入外源基因，再将内源基因敲除，外源基因启动子为tre启动子，受
dox调控表达。然而这些方法都需要多个步骤来构建外源基因稳定整合的细胞系，耗时耗力。研究突变对基因功能的影响时，往往需要将突变引入到内源基因上，工作量很大。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法及研究必需基因突变体功能的方法。本发明方法简单、快速、有效。本发明通过构建同时存在条件下细胞才能存活的一个双质粒系统，把crispr/cas9基因编辑系统、tet—off诱导调控系统和外源基因克隆到这个双质粒系统中，实现必需基因条件性敲除。本发明的技术方案具体介绍如下。 本发明提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法，具体步骤如下：
（1）构建双质粒系统，双质粒系统包含ko质粒（敲除质粒）和rescue质粒（营救质粒），ko质粒含有用于敲除内源基因的sgrna和cas9基因，用于调控外源基因表达的tta基因和负责质粒在真核细胞中复制的ebna1和orip元件；rescue质粒含有补偿敲除的必需基因的外源补偿基因，用于筛选转染成功细胞的抗药基因和在ebna1蛋白的作用下可以使质粒
在真核细胞中复制的orip元件；将靶向目的基因的sgrna克隆到ko质粒上，将外源补偿基因cdna克隆到rescue质粒上；
（2）将双质粒系统转染到细胞中，在药物筛选下培养若干天，分选单克隆，测序鉴定，即筛选出必需基因纯合敲除的细胞系。
本发明中，步骤（1）中，为了避免rescue质粒上的外源基因被ko质粒上的crispr/cas9靶向破坏，需要在rescue质粒的sgrna靶向序列和pam序列上引入同义突变。凯夫拉纤维
本发明中，rescue质粒中的外源补偿基因表达受dox诱导调控。
本发明中，步骤（1）中，rescue质粒还含有荧光素基因，方便观察转染效率和tet—off调控效果。
本发明中，步骤（1）中，rescue质粒中含有的抗药基因是puromycin抗性基因、zencin抗性基因、blast抗性基因或neomycin抗性基因中任一种。
本发明中，步骤（2）中，细胞选自成纤维细胞，胚胎干细胞，多潜能诱导多能干细胞ips，
上皮细胞，成肌细胞，也可以是哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、由sv40转化的猴肾cvi系、人胚肾系293、幼仓鼠肾细胞、小鼠sertoli细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、人宫颈癌细胞、犬肾细胞、buffalo大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺瘤细胞、大鼠肝瘤细胞、hih/3t3细胞、人u2—os骨肉瘤细胞、人a549细胞、人k562细胞、人hek293细胞、人hek293t细胞、人hct116细胞、人mcf—7细胞或tri细胞中任一种。
本发明中，步骤（2）中，将双质粒系统转染到细胞里，通过药物筛选后，含有rescue质粒的细胞才能存活。rescue质粒的复制依赖于ko质粒，所以活下来的细胞含有两个质粒。单独一个质粒无法使细胞长期存活。飘舞的碎布
本发明中，步骤（2）中，在筛选到的纯合敲除细胞系中加doxcylin可以关闭外源补偿基因表达，用来研究必需基因功能。
本发明进一步提供一种研究必需基因突变体功能的方法，其在上述的步骤（1）和步骤（2）后，还包括构建另一个替换质粒rescue2，再将rescue2质粒转染细胞系，用新的抗生素筛选，recue质粒被替换为rescue2，进而研究突变基因对细胞的影响；其中：替换质粒rescue2包含与rescue不同的抗性标记以及含有突变的外源基因，用于编码带有突变的必阿信的博客
圣手书生需基因。
