曲江模式邓晓芬;杨晓佳;易天红;冯英;柯潇;赖维莉
【摘 要】旨在对编码融合蛋白和抗体的重组质粒转染CHO-S细胞的转染条件进行摸索优化,提高外源基因的转染效率,从而增加外源蛋白的表达.应用Amaxa Nucleofector-Ⅱ 电转仪,从电转染程序、质粒用量及细胞用量三方面着手,最终发现编码融合蛋白的重组质粒的最佳电转条件为:电转程序U-030,质粒用量20μg/孔,细胞用量1×107个/孔;编码抗体的重组质粒的最佳电转条件为:电转程序U-024,质粒用量15μg/孔,细胞用量1×107个/孔;实验结果进一步显示抗体重组质粒电转染CHO-S细胞的效果要优于融合蛋白重组质粒,利用高通量细胞筛选仪Clone Pix对转染后重组细胞的阳性克隆数进行统计,证实了该抗体重组质粒的转染效率更高.这为以后的抗体及融合蛋白重组质粒电转染CHO-S细胞提供了一定的数据支持,同时提示不同类型的细胞及外源基因,都需要设计相应的电转染实验进行条件优化,进而为获得高产稳定的生产用细胞株奠定基础. 【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2019(035)004
【总页数】6页(P223-228)
【关键词】融合蛋白;抗体;电转染;转染效率
【作 者】邓晓芬;杨晓佳;易天红;冯英;柯潇;赖维莉
【作者单位】成都康弘药业集团股份有限公司产品技术中心,成都610036;成都康弘药业集团股份有限公司产品技术中心,成都610036;成都康弘药业集团股份有限公司产品技术中心,成都610036;成都康弘药业集团股份有限公司产品技术中心,成都610036;成都康弘药业集团股份有限公司产品技术中心,成都610036;成都康弘药业集团股份有限公司产品技术中心,成都610036
少阳病【正文语种】中 文
近年来，全球药物研发的重心正在从小分子化药向生物大分子药物转移，比如抗体、疫苗、激素、生长因子、细胞因子、凝血因子和酶等，其中大部分为蛋白类药物。由于多数蛋白类药物分子量较小，半衰期短，为了延长药物的半衰期，蛋白融合技术应运而生［1］。融合蛋白药物是利用基因工程技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与其他天
金山毒霸2006然蛋白融合而产生的新型蛋白类药物。与传统的蛋白类药物相比，融合蛋白药物具有双功能性［2］，既提高了功能蛋白的稳定性，延长在体内的代谢时间，又融合多个功能片段，形成高效靶向药物。
继重组蛋白药物之后，重组抗体药物引领了第2次生物医药产品浪潮，是今后若干年新药研发的主要方向［3］。重组抗体是指利用重组DNA技术或是基因突变的方法改造某种抗体基因的编码序列，使之产生出自然界中原本不存在的抗体蛋白分子［4］。重组抗体类药物从组成上分为两类，一类是抗体本身，而另一类是由抗体本身与药物（如放射性核素，毒素等）结合构成。
随着生物药物的发展，各种重组蛋白表达平台也在发展，其中CHO细胞是表达重组蛋白（特别是融合蛋白和基因工程抗体）最常用的宿主之一［5-6］，而重组蛋白基因在宿主细胞内的高效表达，最关键的步骤便是基因的转染。目前常用的转染方法主要有电转染、脂质体转染、显微注射法、磷酸钙共沉淀法等［7］。电转染法相比其他转染技术，具有操作简便、重复性好和转染效率高等优点，电转染几乎适用于所有细胞，但是不同的电转染条件，会导致外源基因的转染效率不同，即便在最优条件下转染相同细胞，不同的外源基因，
转染效率也会有所差别。本研究旨在摸索编码融合蛋白和抗体的重组质粒分别转染CHO-S细胞的最佳电转染条件，并对比在最优电转条件下两分子转染CHO-S细胞的效果，为后续电转染重组融合蛋白和重组抗体分子提供一定的数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与细胞 抗血管内皮细胞生长因子受体融合蛋白表达载体pCMVi-VEGFR（由VEGFR1中的免疫球蛋白样区域2和VEGFR2中的免疫球蛋白样区域3，与人免疫球蛋白 Fc片段经过融合而成），抗肿瘤坏死因子-α抗体表达载体pCMVi-TNF-α由成都康弘药业集团股份有限公司构建并保存。CHO-S细胞，购自美国Life TechnologyTM公司。
1.1.2 主要试剂及仪器 去内毒素质粒抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司，限制性内切酶FspⅠ购自美国NEB公司，细胞培养基CD FortiCHO、Anticlumping agent、L-Glutamine均购自美国Gibco公司，电转仪Amaxa Nucleofector-II及试剂盒Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V购自瑞士Lonza公司，紫外分光光度计Nanovue购自美国GE公司，细胞
十一届三中全会的意义
计数仪Vi-cell购自美国Beckman公司，Octet Qke Refurb检测仪购自美国Pall公司，CloneMedia-CHO、高通量细胞筛选仪Clone Pix购自美国Molecular Devices公司，CO2培养箱Forma371购自美国Thermo Fisher公司，细胞培养摇床ISF1-X购自瑞士科耐公司。
1.2 方法
1.2.1 转染质粒的提取及线性化 将构建好的重组质粒菌种扩大培养，按照去内毒素质粒抽提试剂盒说明书的方法提取质粒后进行质粒的线性化，37℃过夜酶切后回收质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的线性化程度，紫外分光光度计检测质粒DNA浓度后于-20℃保存待用。
1.2.2 细胞传代培养 细胞用125 mL摇瓶，于120 r/min，36.5℃，5% CO2摇床培养，每2-3 d进行细胞计数，以2×105 vc/mL传代，培养体积为30 mL，细胞传代培养基配制：1 L CD FortiCHO培养基加入40 mL L-Glutamin 和 10 mL Anti-clumping agent，4℃保存，使用前室温预热。
动物之爱1.2.3 重组质粒电转条件的摸索 将线性化的重组质粒进行以下电转染条件的摸索：电转染
程序、质粒用量和细胞用量，具体转染实验设计见表1，首先在细胞用量为1×107个/孔，质粒用量为10 μg/孔的前提下，摸索并确定最佳的电转染程序（U-023、U-024、U-030），接着利用最佳的电转染程序，在细胞用量为1×107个/孔的前提下，摸索并确定电转最佳的质粒用量（5、10、15、20 μg/孔），最后在最佳的电转染程序和最佳的质粒用量前提下，摸索并确定电转最佳的细胞用量（1×107、1.5×107、2×107个/孔）。电转染前，6孔板中各加入2.5 mL细胞传代培养基，37℃培养箱预热；取CHO-S细胞计数，计算使用的细胞体积；电转染按Amaxa Cell line Nucleofector kit V 转染试剂盒操作程序进行；电转染后，6孔板置于36.5℃、5% CO2培养箱静置培养，48 h后取0.5 mL细胞液检测细胞活率和活细胞密度，另取0.5 mL细胞液1000 r/min离心5 min，上清用Octet Qke Refurb检测仪检测蛋白表达量，综合细胞的生长和蛋白表达量判断最佳电转染条件，并最终对比融合蛋白与抗体表达质粒的电转效果。
1.2.4 转染效率的检测 采用高通量细胞筛选仪Clone Pix进行转染后重组细胞阳性克隆数的统计。转染48 h后进行细胞计数，用新鲜培养基将细胞稀释到最佳密度5000 cells/mL；已融化的半固体培养基CloneMedia中加入其它成分，配成100 mL体积：90 mL CloneMedia+7 mL水+1 mL CloneDetect+2 mL Clone XL Reagent；将稀释好的细胞液加
入到配好的CloneMedia中，混匀后接种6孔板，2 mL/孔，37℃，5%CO2培养。培养10 d后，观察每个孔长出的克隆数，间接判断细胞的转染效率。
表 1 电转染条件摸索实验设计注：U-023、U-024、U-030是Amaxa Nucleofector-II电转仪自带的电转程序，适用于CHO细胞的电转。摸索步骤 细胞用量（×107个/孔）质粒用量（μg/孔）5 10 15 20电转染程序 1 U-023/ U-024 / /U-030质粒用量 1 最佳程序 最佳程序 最佳程序 最佳程序细胞用量 1 1.5 最佳电转染程序及最佳质粒用量2
2 结果
2.1 重组表达质粒提取及线性化结果
质粒按照去内毒素质粒提取试剂盒方法提取，得到的质粒浓度和纯度均较高，见表2，用限制性内切酶FspⅠ酶切后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒的线性化程度，见图1，结果显示质粒线性化成功，可用于后续转染实验。
2.2 电转染条件摸索试验结果
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将编码融合蛋白和抗体的重组质粒分子线性化后，转染CHO-S细胞，分别对两种分子的电转程序、质粒用量和细胞用量进行摸索。采用细胞计数仪检测其活率、密度，Octet Qke Refurb检测仪检测细胞的蛋白表达量，通过对比细胞的状态及蛋白表达量来确定最佳的转染条件。融合蛋白重组质粒电转染条件摸索结果见图2。
表2 重组表达质粒浓度及纯度质粒名称 浓度（ng/L） 纯度（A260/A280）抗体轻链 3300 1.849抗体重链 3145 1.855融合蛋白 3315 1.857
