SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）
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Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD
版本号: FP151203
产品内容
产品组成
FP205-01 FP205-02 FP205-03
20 µl×125 rxn 20 µl×500 rxn 20 µl×5000 rxn 2×SuperReal PreMix Plus
(with SYBR Green I) 1.25 ml
4×1.25 ml 10×4×1.25 ml 50×ROX Reference Dye 250 µl 1 ml
10×1 ml RNase-Free ddH 2O 2×1 ml
5×1 ml
10×5×1 ml
储存条件
收到本产品后，请⽴即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使⽤时，将冻存的2×SuperReal PreMix Plus 和50×ROX Reference Dye 融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均⼀后再⾏使⽤。如解冻后没有使⽤，须彻底混匀后重新冷冻(在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进⾏冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需⼀段时间内经常取⽤，可在2～8℃条件下储存3个⽉。避免反复多次冻融。
产品简介
本产品是采⽤SYBR Green I 嵌合荧光法进⾏Real Time PCR 的专⽤试剂。产品中预先混有Real Time PCR 反应所需最适浓度的SYBR Green I ，是⼀种2×浓度的PreMix ，反应液配制⼗分简单⽅便。 SuperReal PreMix Plus 采⽤了独特的双组分热启动DNA 聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA 聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA 聚合酶)，配合精⼼优化buffer 体系，具有⾼扩增效率，⾼扩增特异性和宽⼴的可信范围的特点。本升级版试剂在经过成分调整后，扩增特异性上的优势更为突出。 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)SuperReal 荧光定量预混试剂增强版
(SYBR Green)
⽬录号：FP205
试剂盒特点
1. SuperReal PreMix Plus采⽤了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq
DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶)，从⽽构成酶活⾃动调节系统，配合精⼼优化buffer体系，具有⾼扩增效率，⾼扩增特异性和宽⼴的可信范围的特点。
2. 本产品Buffer体系平衡了K+和NH4+的⽐例，还特别添加了独创的H-Bond因⼦, 能协同调整
反应体系中的氢键作⽤⼒，使引物模板退⽕条件更加严谨，反应的专⼀性增强，重复性更好。 3. SuperReal PreMix Plus中预混有SYBR Green I，PCR反应液配制时，只需加⼊模板、引
物、灭菌蒸馏⽔便可进⾏Real Time PCR反应，操作简单⽅便。
4. 本产品附带ROX Reference Dye，⽤于消除信号本底以及校正孔与孔之间产⽣的荧光信号
误差，⽅便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使⽤。
试剂盒原理
本产品采⽤了独特的双组分热启动DNA聚合酶进⾏PCR扩增，通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR 产物扩增量的⽬的。
本产品中双热启动酶构成了独特的酶活⾃动调节系统。酶活⾃动调节系统是由化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶组成。其中HotStar Taq DNA 聚合酶占绝⼤部分⽐例，其聚合酶活性的激活是严格依赖于95℃⾼温的⼀个缓释过程，⽽Anti Taq DNA聚合酶则在95℃⾼温下完全激活。经过95℃条件下孵育15 min激活⼤部分HotStarTaq DNA 聚合酶，进⼊PCR循环后，每经过⼀轮95℃条件下变性，即可重新激活⼀部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA 聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活⾃动调节系统。PCR反应初期，完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以协同已经激活的HotStar Taq DNA聚合酶达到最佳酶活状态，⽽在整个PCR反应过程中，每⼀轮新释放的HotStart Taq DNA聚合酶活⼒刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失。因此，SuperReal PreMix Plus在整个PCR反应过程始终保持最佳的DNA聚合酶活⼒，配合精⼼优化Buffer体系，从⽽可以获得⾼扩增效率，⾼扩增特异性和更加⼴泛性的模板适应性。
注意事项
连弩银针秀
1． PCR反应的预变性条件必须设定为95℃ 15 min，⽤以充分激活热启动酶。
2．本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
3．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使⽤时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使⽤振荡器进⾏混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离⼼后使⽤。
4．引物纯度对反应特异性影响很⼤，建议使⽤PAGE级别以上纯化的引物。
5．引物终浓度为0.3 µM可以在⼤多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进⼀步优化，可以在0.2-0.5 µM范围内调整引物浓度。
6．20 µl反应体系中，基因组DNA或cDNA模板的使⽤量⼀般⼩于100 ng，逆转录产物作为模板时，使⽤量应不超过PCR体系终体积的20%。
操作⽅法
<1> 建⽴Real-Time PCR反应体系：
请注意将2×SuperReal PreMix Plus和50×ROX Reference Dye避光保存。
1. 溶解2×SuperReal PreMix Plus(如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
2. 建议置于冰上进⾏Real Time PCR反应液的配制。
反应体系：
*引物终浓度为0.3 µM可以在⼤多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不⾼时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发⽣⾮特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进⼀步优化引物浓度的，可以在
0.2～0.5 µM范围内调整。
△⼏种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度见下表：
<2>进⾏Real time PCR反应
建议采⽤两步法PCR反应程序进⾏反应。当出现模板浓度过低引起⾮特异扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，建议尝试进⾏三步法PCR 扩增反应。
两步法反应程序:
吲哚乙酸
三步法反应程序:
△1 请先使⽤60℃ 32 sec(20 sec,30 sec,31sec.)进⾏扩增。如果需要进⼀步优化，可以尝试在60-66℃范围内进⾏。
△2通常引物退⽕温度⽐引物的解链温度(Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提⾼退⽕温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退⽕温度。
* 使⽤不同型号仪器进⾏时间设定时，请按照仪器使⽤说明书要求进⾏实验操作，⼏种常见仪器的时间设定见下表：
使⽤时Roche LightCycler/ LightCycler 480请设定在20 sec。
使⽤ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时请设定在30 sec。
使⽤ABI 7000和7300时请设定在31 sec。
使⽤ABI 7500时请设定在32 sec。新疆15个地州市
3．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离⼼，确保所有组分均在管底。
4．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。
以使⽤ABI 7500 Real Time PCR扩增仪为例，进⾏扩增效率优化时，可以按照下表中所⽰优化⽅案1或优化⽅案2的反应条件进⾏反应：
以使⽤ABI 7500 Real Time PCR 扩增仪为例，进⾏特异性优化的参考⽅案： <3> Real Time PCR 反应举例：
图1 扩增曲线图2 熔解曲线
图1. 以单链cDNA 为模板，⽤SuperReal PreMix Plus(FP205)进⾏8对不同检测体系的qPCR 实验，之后进⾏熔解曲线分析。结果显⽰，熔解曲线均为单⼀峰，未发现⾮特异性扩增和引物⼆聚体产⽣(图2)。
cDNA 的合成使⽤FastQuant cDNA 第⼀链合成试剂盒(KR106)。
图3. 同⼀反应体系，使⽤SuperReal PreMix Plus(FP205)的熔解曲线仅有单⼀峰，为特异性扩增产物，其Tm 值为83℃；使⽤国外A 公司试剂除了特异性扩增产物外，还出现了引物⼆聚体。引物⼆聚体的Tm 值⼀般在75℃左右。
图3 熔解曲线分析差生转化案例
进⾏RT-qPCR反应时的操作建议
进⾏RT-qPCR反应时，有两种cDNA第⼀链合成试剂盒可以选择，分别是FastQuant cDNA第⼀链合成试剂盒(KR106)和TIANScript II cDNA第⼀链合成试剂盒(KR107)。其中，FastQuant cDNA第⼀链合成试剂盒是专为两步法RT-qPCR第⼀步实验配制的，具有⾼灵敏度的RT-qPCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA合成第⼀链cDNA。该试剂盒中使⽤的逆转录酶Quant Reverse Transcript
ase与通常使⽤的Moloney⿏⽩⾎病病毒来源的M-MLV和鸟成髓细胞病毒来源的AMV不同，是⼀种使⽤⼤肠杆菌⼯程菌进⾏重组表达的全新⾼效逆转录酶。该酶能够⾼效转录多种RNA模板，最⼤限度将RNA转录成cDNA第⼀链。以FastQuant cDNA第⼀链合成试剂盒(KR106)为例，下列操作步骤适⽤于模板量为50 ng-2 µg 的总RNA。
1. 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、
RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使⽤前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离⼼以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤请在冰上进⾏。为了保证反应液配制的准确性，进⾏各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2. 按照表1的gDNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离⼼，并置于42℃，孵育3
min。然后置于冰上放置。
3. 按照表2的反转录反应体系配制混合液。
4. 将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。
数理统计法5. 42℃，孵育15 min; 95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可⽤于后续实验，或低
温保存。
6. 进⾏PCR反应
表1 gDNA去除反应体系表2 反转录反应体系
本实验是应⽤两步法定量RT-P C R对⼈
Jurkat cell 的GAPDH mRNA进⾏定量检
测。荧光定量PCR是使⽤SuperReal PreMix
Plus(FP205)。cDNA合成是使⽤FastQuant
cDNA第⼀链合成试剂盒进⾏(KR106)，
cDNA⽤量相当于10 pg-100 ng总RNA。
引物设计说明
进⾏Real Time PCR反应时，PCR引物的设计⾮常重要。设计PCR扩增效率⾼，反应特异性强的引物可以参考以下要求。
◆设计引物要求如下：
引物长度 18-30个碱基
GC含量 40-60%
